田苗苗, 楊 麗

(1. 吉林工程技術師范學院, 化學與工業(yè)生物工程交叉學科研究院, 吉林 長春 130052; 2. 東北師范大學化學學院, 吉林 長春 130024)

毛細管電泳技術(capillary electrophoresis, CE)具有分離效率高、操作簡單、樣品和試劑消耗少、分析速度快以及可與多種檢測器聯(lián)用等優(yōu)勢,已經(jīng)發(fā)展成為酶分析研究領域的強有力工具[1-3]。目前,基于CE技術的酶分析方法主要有兩種操作模式,即離線酶分析(又稱柱前酶分析法)和在線酶分析(又稱柱上酶分析法)。離線酶分析是指將底物、酶和其他一些反應組分加入到一個單獨的反應瓶中發(fā)生酶反應,反應生成的產(chǎn)物和剩余底物通過CE技術分離分析。離線模式操作和方法相對較簡單,由于酶促反應的發(fā)生和CE的分離檢測是相對獨立的步驟,因此兩者均可在其最佳條件下進行,彼此不產(chǎn)生干擾。但是,離線酶分析存在試劑消耗量大、步驟操作煩瑣、酶穩(wěn)定性差等缺點,限制了其在酶分析中的應用。在線酶分析中,毛細管兼具酶促反應場所和底物/產(chǎn)物的分離通道,在線酶分析將進樣、酶促反應的啟動和終止、分離及檢測集成于一次運行中。與離線酶分析相比,在線酶分析具有準確、快速、易于自動化、酶消耗量少等優(yōu)勢,逐漸成為CE酶分析的主流發(fā)展趨勢,在酶分析的各個方面得到廣泛應用。電泳媒介微分析法(electrophoretically mediated microanalysis, EMMA)和固定化酶微反應器(immobilized enzyme microreactor, IMER)是CE酶分析中常用的在線分析方法。EMMA是在電場作用下利用酶、底物在緩沖溶液中的遷移速率差異來實現(xiàn)反應物的柱內混合,從而引發(fā)酶促反應,隨后在電場作用下實現(xiàn)反應底物和產(chǎn)物的分離檢測[1]。IMER是指將酶分子通過物理吸附、交聯(lián)、共價鍵合等方法固定于毛細管內壁或毛細管內特定的載體上,酶反應器通常位于毛細管的一端,毛細管的其余部分用作CE分離檢測[4]。底物流經(jīng)酶反應器時發(fā)生酶催化反應,進而實現(xiàn)底物和產(chǎn)物的在線分離和檢測。與自由酶溶液相比,固定化酶具有更高的酶/底物比、催化活性好、可重復使用、穩(wěn)定性高等獨特優(yōu)勢。EMMA和IMER已經(jīng)廣泛應用于酶活性和酶動力學、抑制劑篩選和底物測定等方面。目前,已有一些綜述文章[5-8]對于這兩種CE在線酶分析的研究進展進行了很好的總結和分析。

表 1 基于序列進樣的CE技術在線酶分析實例

近年來,基于快速序列進樣的CE序列分析技術已成為在線酶分析的另一種有力手段。傳統(tǒng)的CE分析技術常用的進樣方式為壓力進樣和電動進樣。這兩種進樣方式都需要在每次進樣后將毛細管進樣端從樣品溶液移入電泳緩沖溶液中,無法實現(xiàn)無干擾序列進樣分析。因此基于壓力進樣和電動進樣的CE在線酶分析(EMMA或者IMER)都很難實現(xiàn)高時間分辨和高通量在線檢測。然而,對酶反應動力學過程的高時間分辨精確檢測,可以實現(xiàn)對反應全程監(jiān)測,即從反應開始到完全結束對反應物和產(chǎn)物的實時測量,因此可以更準確地獲得反應機制和反應速率常數(shù),監(jiān)測酶活性隨反應歷程的變化,有助于更好地了解酶反應機制,從而更好地認識酶在生物代謝中的功能,對于酶抑制類藥物的研發(fā)以及疾病的臨床診斷具有重要意義。另一方面,基于序列進樣的CE在線酶分析技術亦可以實現(xiàn)高通量的分析檢測,這對于酶反應和酶抑制反應分析是非常重要的,尤其是準確、快速、高通量的酶抑制篩選方法的發(fā)展對加快新藥的研發(fā)具有重要意義。

本文介紹了CE序列分析技術在線酶分析的最新研究進展,并著重介紹了基于光快門進樣(optical-gated photobleaching injection, OGPB)、流動門進樣(flow-gated injection)、毛細管對接的二維擴散進樣(two-dimension diffusion injection)、流動注射進樣(flow injection, FI)、液滴微流控進樣(droplet microfluidics)等技術的CE在線酶反應和酶抑制反應的研究。表1總結了基于序列進樣技術的高時間分辨酶分析和高通量酶抑制分析研究。

1 基于OGPB的CE在線酶分析

光快門進樣是由Jorgenson課題組[25]于1991年首次提出的。該方法利用分束鏡將激光分裂為兩束,一束激光通過一個光快門后聚焦于毛細管上游位置作為漂白光,另一束激光位于下游作為激光誘導熒光檢測的檢測光。進樣的具體過程為:首先在毛細管內連續(xù)引入具有熒光的樣品溶液,同時打開光快門使漂白光持續(xù)照射樣品,由于光漂白作用,經(jīng)過的樣品被分解為無熒光的物質。當需要進樣時,關閉光快門一定的時間,使經(jīng)過的一小段樣品不被漂白即完成進樣。這一小段樣品區(qū)帶經(jīng)CE分離后在毛細管下游的檢測點進行激光誘導熒光檢測。OGPB最早應用于毛細管電泳分離體系中,以提高分離效率。文獻[25-27]中已報道利用該進樣技術,實現(xiàn)了熒光標記的氨基酸、多肽、寡核苷酸和其他小分子的高速(分離時間小于1 s)和高分離效率(塔板數(shù)106/m)的分析檢測。光快門進樣的進樣量是由高精度光快門的開閉時間(通常為ms級)決定的,可低至數(shù)十至數(shù)百pL。因此,該進樣方法可獲得非常狹窄的進樣區(qū)帶,進而獲得高的分離效率。光快門進樣法不僅可以實現(xiàn)高準確的少量進樣,而且還能實現(xiàn)高重現(xiàn)性的多次自動序列進樣,因此該進樣技術非常適合包括酶反應在內的化學反應動力學的在線連續(xù)監(jiān)測。

Xu等[9]首次將光快門進樣技術與微芯片電泳法結合，應用于在線酶分析,研究測定了β-半乳糖苷酶的酶活性和競爭性酶抑制反應。在分析過程中,底物和酶先在離心管中混合,然后轉移到芯片上的儲液槽中。在反應過程中,將樣品連續(xù)引入微芯片的分離通道中,通過光快門實現(xiàn)序列進樣,進而實現(xiàn)底物和產(chǎn)物的分離和檢測。利用該系統(tǒng),在一次CE分析中實現(xiàn)了對β-半乳糖苷酶酶促反應全程30 s高時間分辨的自動在線檢測。為了提高分析通量,Xu等[10]進一步將光快門進樣技術與多通道微芯片電泳法聯(lián)用,采用相同的操作步驟測定了β-半乳糖苷酶的酶活性和酶抑制反應。在一次CE分析中,可以同時實現(xiàn)不同酶反應過程(如不同底物濃度的酶反應、無抑制劑/添加抑制劑酶反應)30 s高時間分辨的自動在線檢測,大大提高了酶反應的分析通量。從上述分析過程可以看出,作者采用的是離線反應模式,對于反應速度非?？斓拿复俜磻茈y從反應開始就實現(xiàn)檢測,而且由于進樣過程中酶分子隨著底物和產(chǎn)物一同進入分離通道,因此無法及時終止酶反應,導致在分離過程中酶反應仍可能繼續(xù)進行,影響最后分析的準確性。

圖 1 (a)OGPB-LIF毛細管電泳序列分析裝置、(b)毛細管 進樣端示意圖和(c)固定化胰蛋白酶酶催化反應中底物、產(chǎn)物峰隨酶催化反應時間的變化圖[11] Fig. 1 Schematic diagram of (a) the OGPB-LIF instrument for sequential CE analysis, (b) the loading end of the capillary and (c) evolution of the substrate and product peaks as a function of time in study of immobilized trypsin cleavage reaction[11] The inset of Fig. 1a shows an enlarged view of the optically gated vacancy capillary electrophoresis (OGVCE) region, the distance between the photobleachingposition (F1) and the detection position (F2) on the capillary is the effective separation distance. OGPB: optical-gated photobleaching injection.

圖 2 (a)OGPB-UV-Vis毛細管電泳序列分析裝置圖,(b)Asn和 Asp標準混合溶液20次連續(xù)進樣電泳譜圖和(c)L-天冬酰胺酶催化酶反應中底物、產(chǎn)物峰隨酶催化時間的變化圖[12] Fig. 2 (a) Schematic diagram of the OGPB-UV-Vis setup for sequential CE analysis, (b) electropherogram for the 20 sequential analysis of Asn and Asp standard mixture and (c) evolution of the substrate and product peaks as a function of reaction time in the study of L- asparaginase-catalyzed reaction[12] The inset of Fig. 2c shows the measured Michaelis-Menten diagram obtained from the sequential CE enzyme assay.

為了克服上述問題,Chen等[11]提出了一種基于光快門進樣技術和自制的固定化酶隔離裝置聯(lián)用的在線酶分析系統(tǒng)(見圖1a和圖1b),實現(xiàn)了高時間分辨進樣的同時避免了酶反應由于無法及時停止而影響檢測結果的問題。實驗中為了防止固定酶進入毛細管而影響分析結果的準確性,在毛細管進樣端安裝了一個孔徑為1 μm的不銹鋼網(wǎng)狀薄膜(見圖1b)。網(wǎng)狀薄膜可阻止酶分子進入毛細管,實現(xiàn)底物和酶溶液的分離進而終止酶反應。因此每次光快門進樣都對應于一個酶催化反應的時間點。利用該分析系統(tǒng)以熒光標記的血管緊張肽為底物,建立了胰蛋白酶酶切反應和酶抑制反應的高時間分辨在線測定平臺,在一次CE分析中實現(xiàn)了對酶促反應全程5 s高時間分辨的自動在線檢測。根據(jù)底物和產(chǎn)物的消耗和產(chǎn)生,測定了胰蛋白酶的酶促反應動力學常數(shù)(見圖1c),測定結果與線外反應測定結果一致,證明了該方法用于在線酶分析的準確性和可靠性。

OGPB通常與LIF檢測聯(lián)用,以實現(xiàn)高準確性的少量進樣和高重復性的序列進樣分析。為進一步拓展OGPB在CE在線酶分析中的應用,Liu等[12]提出了一種OGPB進樣技術與商品化的紫外-可見(UV-Vis)檢測器相結合的CE序列分析方法(見圖2a)。該裝置由氨基酸在線衍生、光門進樣、CE分離、UV-Vis檢測器等部分構成。在該系統(tǒng)中激發(fā)光只是作為漂白光實現(xiàn)序列進樣,因此無須復雜的分光操作。光漂白作用可以使生色團化學結構發(fā)生變化,進而導致分析物的紫外吸收降低,因此漂白后的樣品可利用UV-Vis進行檢測。利用該系統(tǒng),以天冬酰胺(Asn)和天冬氨酸(Asp)的標準混合物測試了該方法的分析性能,序列進樣20次,氨基酸的峰高、峰面積和遷移時間的RSD分別為2.23%、2.57%和0.70%(見圖2b),表明該方法具有良好的重復性。在L-天冬酰胺酶催化反應全程在線監(jiān)測的研究中,時間分辨率可達12 s,通過同時檢測底物的消耗和產(chǎn)物的生成,測定了L-天冬酰胺酶的米氏常數(shù)(0.25 mmol/L)(見圖2c),實驗結果與離線測定結果一致,表明基于OGPB-UV-Vis序列分析法可實現(xiàn)準確的序列進樣和酶反應全程的在線監(jiān)測。該方法的提出也證明了OGPB可與多種檢測手段聯(lián)用,拓展了OGPB進樣法的適用范圍。

2 基于流動門進樣的CE在線酶分析

1993年,Lemmo和Jorgenson研究組[28]提出了流動門進樣技術。該進樣方法是將兩根相距一小段間隙的毛細管同軸對齊,其中一根毛細管為引樣毛細管,另一根為分離毛細管,在兩根對接毛細管的垂直方向上連接一個流動泵,流動泵打開時,緩沖溶液被不斷引入兩根毛細管間隙,流動的緩沖溶液會將從引樣毛細管中流出的樣品沖走,使樣品無法進入分離毛細管。進樣時,關閉流動泵,讓樣品從引樣毛細管中流出并充滿兩毛細管的間隙,然后以電進樣方式使一小段樣品進入分離毛細管;接著打開流動泵將間隙內剩余樣品沖走。該技術首先被應用于二維分離系統(tǒng)作為進樣接口,將一維分離體系的分離組分引入到二維分離系統(tǒng)進行電泳分離,以提高復雜樣品的分離效率[29,30]。流動門進樣也被應用于高速毛細管電泳中,實現(xiàn)pL級的進樣量,以提高分離效率[31-34]。在線微滲析取樣-高速毛細管電泳體系是流動門進樣的另一重要研究領域[35-37],微滲析取樣可實現(xiàn)在線、實時、連續(xù)的活體取樣,流動門進樣技術可將其不斷引入毛細管中進行高速分離,因此該方法可實現(xiàn)生物體內生命過程的在線連續(xù)監(jiān)測。

圖 3 (a)流動門進樣與芯片毛細管電泳聯(lián)用用于在線酶分析 示意圖和(b)谷胱甘肽還原酶催化酶反應中產(chǎn)物GSH*隨酶催化反應時間的變化圖[15] Fig. 3 (a) Schematic diagram of the flow-gated injection coupled to microchip electrophoresis for sequential CE analysis and (b) evolution of GSH* peaks as a function of time in the study of a glutathione reductase-catalyzed enzymatic reaction[15] GSH*: ThioGlo-1-GSH adduct; GND: ground; DP: detection point.

Wu等[15]首次將流動門進樣法與芯片電泳聯(lián)用(見圖3 a),在線研究了谷胱甘肽還原酶的酶動力學和酶抑制動力學。該系統(tǒng)主要由柱前衍生、流動門進樣、CE分離和LIF檢測系統(tǒng)組成。谷胱甘肽還原酶在輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)的存在下可以將氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSH)催化反應成還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH),實驗中通過連續(xù)監(jiān)測GSH濃度的變化,測定了谷胱甘肽還原酶的酶動力學和酶抑制動力學。分析開始前,先在試劑池中加入衍生試劑ThioGlo-1,在樣品池中加入底物和輔酶,然后向樣品池中加入一定濃度的谷胱甘肽還原酶,啟動酶反應,隨后酶反應溶液和衍生試劑連續(xù)的進入反應通道發(fā)生衍生反應，生成含有熒光的產(chǎn)物(ThioGlo-1-GSH adduct, GSH*),熒光產(chǎn)物通過流動門進樣方法連續(xù)的引入分離通道,進行CE分離和LIF檢測。利用該系統(tǒng),實現(xiàn)了對谷胱甘肽還原酶酶反應全程10 s高時間分辨的自動在線檢測,獲得了谷胱甘肽還原酶的酶動力學參數(shù)(見圖3b),測定結果與其他文獻[38,39]報道結果一致,表明了流動門序列進樣技術可用于連續(xù)監(jiān)測酶反應。

3 基于二維擴散進樣的CE在線酶分析

Chen等[16]在2012年提出了一種基于擴散進樣實現(xiàn)CE序列分析的方法(見圖4a)。該裝置是將兩根一端磨平的毛細管同軸固定于一個樣品池中,毛細管間隔距離在1.5 μm左右。CE分析時,通過周期性地控制高壓電源的開(樣品分離)、關(擴散進樣),實現(xiàn)準確的在線序列進樣和連續(xù)CE分析。當電壓開啟時,樣品溶液不會進入到毛細管中;當電壓關閉時,由于樣品池中溶液和毛細管間隙的緩沖溶液之間存在濃度梯度,因此樣品各組分通過擴散作用充滿毛細管間隙,待擴散一定時間后,打開電壓,在電滲流作用下毛細管間隙中的樣品進入毛細管中并進行分離和檢測。利用該系統(tǒng),以丙氨酸(Ala)和谷氨酸(Glu)的標準混合物測試了該方法的分析性能。序列進樣20次,氨基酸的峰高、峰面積和遷移時間的RSD分別為1.01%、1.25%和0.80%(見圖4b),表明該連續(xù)擴散進樣方法具有良好的重復性。

圖 4 (a)二維擴散進樣毛細管電泳在線連續(xù)分析裝置圖和(b)Ala和Glu標準混合溶液20次連續(xù)進樣的電泳譜圖[16] Fig. 4 (a) Scheme diagram for on-line sequential analysis by capillary electrophoresis based on two-dimension diffusion injection and (b) electropherogram for the 20 sequential analysis of Ala and Glu standard mixture[16]

Liu等[17]對上述連續(xù)擴散進樣(sequential diffusion injection, SDI)的機制進行了分析?；诙S擴散進樣的理論模型,在菲克第二定律的基礎上,推導出絕對進樣量Ainj與初始濃度C0、進樣時間t和狹縫寬度d成正比。實驗中采用NADH作為分析物,針對所建立的理論模型分別對影響進樣量的3個因素進行了驗證。實驗結果表明,進樣量與C0、t和d均成正比,與理論預測相一致,證明所建立的CE-SDI體系為二維擴散體系。CE中傳統(tǒng)的擴散進樣是沿著毛細管縱向的一維擴散,其進樣量與進樣時間平方根成正比。與之相反,在SDI體系中是沿著毛細管橫向和縱向的二維擴散,其進樣量與時間成正比,因此與一維擴散進樣相比,SDI體系大大增加了擴散效率。

圖 5 谷氨酸轉氨酶催化酶反應中底物、產(chǎn)物峰隨酶催化反應時間的變化圖[16]Fig. 5 Evolution of Ala and Glu peaks as a function of time in the study of a glutamate pyruvate transaminase-catalyzed enzymatic reaction[16] Electrophoretogram of substrate and product corresponding to different enzymatic reaction time: a. 0-2.5 min; b. 2.5-5.0 min; c. 5.0-7.5 min; d. 7.5 min-10.0 min; e. 10.0-12.5 min; f. 12.5-15.0 min; g. 20.0-22.5 min.

Chen等[16]將二維SDI方法應用于谷氨酸轉氨酶(glutamate pyruvate transaminase, GPT)酶反應全程的連續(xù)在線監(jiān)測。分析開始前,樣品池中先加入底物(Ala)和α-酮戊二酸,在毛細管中充滿包含有衍生試劑(鄰苯二甲醛/2-巰基乙醇)的硼砂緩沖溶液。然后,在樣品池中加入GPT溶液啟動酶反應,通過關閉電壓一段時間(10 s),酶反應底物(Ala)和產(chǎn)物谷氨酸(Glu)在二維擴散作用下,進入兩根毛細管的間隙,與緩沖溶液中的衍生試劑快速發(fā)生衍生反應,打開電壓后,衍生后的底物和產(chǎn)物在電滲流的作用下進入分離毛細管中,隨著電泳的進行,0.5 min內實現(xiàn)Ala和Glu的基線分離。通過該方法,實現(xiàn)了對谷氨酸轉氨酶酶反應全程30 s高時間分辨的自動在線檢測,獲得了GPT的酶動力學參數(shù)(見圖5),與傳統(tǒng)線外反應測得數(shù)值相一致,表明二維序列進樣方法可用于在線連續(xù)監(jiān)測酶反應。

二維SDI還被應用于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)酶催化反應的全程連續(xù)監(jiān)測[17]。實驗中,固定進樣時間為10 s,分析周期為40 s,連續(xù)在線檢測了酶反應產(chǎn)物NADH的生成量隨酶反應時間的變化,進而獲得了其酶反應動力學常數(shù)Km,且與線外結果有很好的一致性。

在酶抑制研究方面,Liu等[18]將二維SDI應用于丙氨酸轉氨酶(alanine amino transferase, ALT)催化反應酶抑制動力學的研究,研究了一種有機酸(琥珀酸)和兩種傳統(tǒng)中藥(清開靈注射液和甘草酸二銨注射液)對ALT酶反應的抑制作用,得到了3種抑制劑的抑制機制和抑制動力學常數(shù),與線外反應測得結果一致,表明該二維SDI對于在線檢測酶抑制作用具有很好的可行性和準確性。

4 基于FI的CE在線酶分析

流動注射分析(flow injection analysis, FIA)是由Ruzicka和Hansen首次提出的一種新型的連續(xù)流動分析技術[40]。該技術是把一定體積的試樣溶液注入一個流動的、非空氣間隔的試劑溶液(或水)載流中,被注入的試樣溶液流入反應盤管,形成一個區(qū)域,并與載流中的試劑混合、反應,再進入流通檢測器進行測定分析及記錄。FI分析系統(tǒng)避免了手動引入樣品和試劑,因此具有進樣頻率高、準確度高、重線性好、可自動控制等優(yōu)勢。FIA自建立以來已經(jīng)迅速發(fā)展為分析化學研究領域一種高效率進樣及在線溶液處理手段[41,42]。FIA最初作為序列進樣技術被應用于毛細管電泳分離體系中,以提高CE的進樣頻率和進樣速度[43,44]。在FI-CE操作過程,樣品先注入FI部分,然后傳遞到FI-CE界面,最后引入分離毛細管。進樣過程可在無須移動毛細管和中斷高壓的情況下連續(xù)操作。一次分析過程可完成多次進樣,有效提高了CE的分析速度和分析結果的準確性。由于FI-CE具有樣品在線處理和序列進樣分離測定的獨特優(yōu)勢,已經(jīng)被成功應用于在線反應、化學動力學參數(shù)以及食品、環(huán)境分析等多個研究領域[45]。

圖 6 流動注射分析與CE聯(lián)用系統(tǒng)用于酶抑制劑高通量篩選[20]Fig. 6 Schematic diagram of CE combined with flow injection system[20]

Du等[20]首次將流動注射分析與CE聯(lián)用,實現(xiàn)了酶抑制劑的高通量篩選(見圖6)。該系統(tǒng)包含一根6 cm長的石英毛細管,轉盤式缺口試樣陣列和激光誘導熒光檢測系統(tǒng)。當毛細管尖端快速穿過試劑瓶槽口時,樣品在重力作用下進入到毛細管中實現(xiàn)進樣。轉盤式缺口試樣陣列上固定裝有不同試劑的樣品瓶,通過旋轉缺口試樣陣列,可以使毛細管穿過不同的試劑瓶,實現(xiàn)不同樣品的自動序列進樣。該方法具有高通量、低樣品消耗、自動轉換進樣等優(yōu)勢。該系統(tǒng)成功應用于β-半乳糖苷酶酶抑制分析,每次測定試樣和試劑消耗僅為4.2 nL,分析通量可達300 sample/h。

5 基于液滴微流控系統(tǒng)的CE在線酶分析

液滴微流控系統(tǒng)是由Quake研究組[46]于2001年提出的,該系統(tǒng)也被稱作非連續(xù)流微流控系統(tǒng),是一種由互不相溶的兩相在其交界處形成相互間隔的液滴(droplet),作為反應、分析和檢測的單元。在該系統(tǒng)中,通常采用油水間隔的方式,試樣和試劑被不互溶的油相分隔在pL～nL級的液滴中。相對于連續(xù)流系統(tǒng),液滴具有體積小、低擴散、無交叉污染等特點,并且具有高通量分析的獨特優(yōu)勢。該技術已在化學合成、單細胞分析、生化檢測和分離分析等方面得到了應用[47-49]。Edgar等[50]首次將液滴微流控系統(tǒng)與CE聯(lián)用,實現(xiàn)了液滴中多組分的分離分析。他們采用T型通道生成油相間隔的pL級水相液滴,然后直接將其注入電泳分離通道中進行分離。采用上述系統(tǒng),成功實現(xiàn)了異硫氰酸熒光素(FITC)標記的氨基酸混合物的分離和LIF檢測。研究結果證明了液滴微流控系統(tǒng)與CE分離系統(tǒng)聯(lián)用的可行性。液滴微流控系統(tǒng)最早在分離科學中主要被應用于兩個方面:(1)作為二維分離系統(tǒng)的接口,以提高多維分離系統(tǒng)的分辨率[51,52]; (2)與在線微滲析-毛細管電泳分離系統(tǒng)聯(lián)用實現(xiàn)生物體內化學過程動態(tài)監(jiān)測,以提高檢測的時間分辨率[53,54]。由于水相液滴內的樣品被不互溶的油相分隔,液滴之間不存在分子擴散或者對流,因此液滴在長時間傳輸和儲存過程中不會產(chǎn)生擴散引起的稀釋問題和交叉污染問題,可真實記錄樣本的初始狀態(tài)信息。因此,液滴系統(tǒng)作為接口與二維分離體系聯(lián)用時,利用液滴技術可將一維分離的樣品進行分集和封裝,最大限度保留上一維的分辨率,然后以液滴的形式進入分離通道進行二維分離,可大大提高復雜樣品的分辨率。同樣的,當液滴微流控系統(tǒng)與微透析取樣探針聯(lián)用時,可將以滲析采樣得到的樣品以液滴間隔開,經(jīng)過長時間的傳輸,不會發(fā)生稀釋和分散,進而可顯著提高微滲析分析的時間分辨率。將液滴技術應用于CE分離體系中,可實現(xiàn)多個樣品的連續(xù)引入,可以提高CE系統(tǒng)的分析通量。

Pei等[21]首次將液滴技術與微芯片毛細管電泳分離系統(tǒng)聯(lián)用,實現(xiàn)了酶反應的高通量分析。該芯片裝置由3個分離通道和三個“K型”通道的樣品進樣界面組成。油相間隔的液滴連續(xù)流過疏水性主通道,兩個支通道則不間斷流過水相緩沖溶液,當液滴流經(jīng)交叉界面時,水相樣品會自動轉移到連續(xù)水相緩沖溶液中,進行電泳分離。利用該分析系統(tǒng),實現(xiàn)了GTPase酶催化反應的高通量分析。實驗中,將3個酶反應時間點(0、15、30 min)的溶液預先以油相間隔的液滴形式分別封裝于3根毛細管中,每個時間點的酶反應溶液形成40個體積為9 nL的液滴,然后將3根毛細管分別與芯片上3個獨立的K型通道相連,實現(xiàn)樣品進樣和CE的分離檢測,并在10 min內完成了120個樣品的分離分析。該實驗結果初步證明了液滴技術與微芯片毛細管電泳系統(tǒng)聯(lián)用,可實現(xiàn)高通量的酶分析,有望進一步應用于高通量酶抑制劑篩選。

圖 7 (a)聚二甲硅氧烷/玻璃復合芯片電泳裝置分析液滴的示意圖和(b)140種化合物對蛋白質激酶的抑制效力[22]Fig. 7 (a) Schematic of polydimethylsiloxane(PDMS)-glass hybrid microfluidic device for analysis of segmented flow samples and (b) inhibitory effect of 140 small molecules against protein kinase A[22]

2015年,Guetschow等[22]將液滴微流控系統(tǒng)與聚二甲硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)/玻璃復合微芯電泳聯(lián)用(見圖7a),實現(xiàn)了酶抑制劑的高通量篩選。首先將96孔板中包含有不同抑制劑的酶反應溶液以油相間隔的液滴(體積為8 nL)裝載于一根聚四氟乙烯(teflon)毛細管中,然后將其與PDMS/玻璃復合芯片相連,在注射泵的驅動下,液滴順次進入PDMS通道,其中PDMS通道與芯片分離裝置上的親水性取樣毛細管正交相連,當液滴經(jīng)過取樣毛細管口時,水相樣品被萃取,進入樣品通道,而油相樣品則沿疏水通道流出。樣品通道內的樣品再以流動門電進樣方式進入分離通道實現(xiàn)酶底物和產(chǎn)物的CE分離檢測。酶反應產(chǎn)物和底物在1 s內即可實現(xiàn)基線分離。該系統(tǒng)被應用于蛋白質激酶酶抑制劑的高通量篩選,在一次分析中測試了160種化合物(140個測試化合物、10個陽性對照和10個陰性對照)對蛋白質激酶的抑制作用,其分析通量為8 sample/min。圖7b顯示了140種化合物對蛋白質激酶的抑制效力,其中25種化合物對蛋白激酶有抑制作用。此外,基于液滴技術與芯片毛細管電泳聯(lián)用系統(tǒng)也被成功應用于去乙?；?sirtuin 5)酶抑制劑的高通量篩選[23,24]。

液滴微流控系統(tǒng)與CE分離體系聯(lián)用,可實現(xiàn)高通量的酶分析和酶抑制劑的篩選,但是在這些研究體系中酶反應均以線外反應模式進行,酶反應完成后再將不同的樣品以液滴的形式進行封裝,實現(xiàn)了高通量分析。在以后的研究中,若能將在線酶反應與液滴生成技術及CE在線分離檢測聯(lián)用,有望進一步提高酶分析的分析通量。

6 序列進樣CE在線酶分析的其他應用

序列進樣CE在線酶分析還被應用于多肽C端測序、手性氨基酸分離和與膠束電動色譜技術聯(lián)用的手性分析等方面。Tian等[13]建立了基于光快門漂白進樣-激光誘導熒光檢測(OGVCE-LIF)的短毛細管快速毛細管電泳裝置,全程自動化在線測定了多肽羧基端的序列。利用羧肽酶Y水解法,對水解多肽釋放的氨基酸進行了高時間分辨的在線序列分析,根據(jù)釋放氨基酸的順序不同得到多肽C端序列。以兩個合成的N端封閉的多肽為例,利用該技術在一次CE分析中,對羧肽酶Y水解全程中所釋放的氨基酸實現(xiàn)了時間分辨為50 s的在線測定,進而獲得了多肽中的氨基酸序列。測定結果與多肽已知序列相一致,證明了該方法的準確性和可靠性。

Zhang等[14]將OGVCE-LIF分析技術用于手性氨基酸的分離并實現(xiàn)了D型氨基酸氧化酶(DAAO)酶動力學及抑制動力學的高時間分辨在線測定。利用OGVCE-LIF系統(tǒng),實現(xiàn)了5對衍生的氨基酸對映體的高效快速手性分離。通過在線高時間分辨測定D型氨基酸在酶反應前后的峰高變化,不僅實現(xiàn)了5種手性氨基酸單獨與DAAO反應時的酶分析,而且分析了多種手性氨基酸同時存在時對DAAO酶活性的影響。利用該技術,不僅檢測了單一手性DAAO的酶反應動力學,同時首次研究了多種手性底物存在時的DAAO酶反應動力學。研究結果表明,OGVCE-LIF技術對于復雜的生物樣品研究具有潛在的應用價值。

Fu等[19]將二維SDI與膠束電動色譜技術聯(lián)用,實現(xiàn)了丙氨酸外消旋酶反應的全程高時間分辨在線檢測。在該方法中,一方面通過周期性的關閉電壓,實現(xiàn)了準確的在線序列進樣和分離檢測;另一方面,利用膠束電動色譜實現(xiàn)了手性丙氨酸對映體(酶反應的底物和產(chǎn)物)的高效分離和靈敏檢測。在酶反應過程中,通過一次CE分析實現(xiàn)了丙氨酸外消旋酶反應時間分辨為40 s的全程連續(xù)在線檢測。利用該方法,測定了D型丙氨酸→L型丙氨酸和L型丙氨酸→D型丙氨酸的酶反應動力學常數(shù),且測定結果與傳統(tǒng)線外酶分析測定結果一致。

7 結論和展望

毛細管電泳具有微量、快速、高效、分離模式多、可與多種檢測方法聯(lián)用等特點,已逐漸發(fā)展為在線酶分析的有力平臺?；谛蛄羞M樣技術的毛細管電泳在線酶分析,既可以實現(xiàn)酶反應全程的高時間分辨檢測又可以實現(xiàn)酶抑制劑的高通量篩選,已成為了在線酶分析中的一種強有力技術手段。快速、連續(xù)、自動化的試樣引入系統(tǒng)是基于序列進樣毛細管電泳在線酶分析的重要組成部分。光快門進樣、流動門進樣、毛細管對接的二維擴散進樣、流動注射分析或液滴微流體進樣都已經(jīng)成功應用于酶反應全程的在線監(jiān)測或酶抑制劑的高通量篩選,大大提高了在線酶分析的分析準確性和分析通量。然而,各個序列進樣技術也存在其本身的局限性,比如光快門進樣對分析目標物的熒光性質的要求,流動門進樣和液滴微流體進樣在操作和設計的復雜性,毛細管對接的二維擴散進樣對應樣品擴散能力的限制等。因此仍需要開發(fā)更為簡單、易操作、高精準的CE序列分析技術,進一步拓展CE技術在在線酶分析領域中的應用。此外,如何實現(xiàn)多酶協(xié)同反應和級聯(lián)反應的高通量分析以及酶抑制劑篩選,同時兼顧各個酶反應的最適反應條件,亦是CE序列分析技術面臨的挑戰(zhàn)。這方面的研究將有望進一步拓展CE技術在酶分析和抑制反應中的應用,幫助我們更深入的了解酶活性和酶反應動力學機制,以及實現(xiàn)酶抑制劑的高通量篩選。