陳 義

(淮陰工學(xué)院, 江蘇 淮陰 223001; 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所, 中國(guó)科學(xué)院活體分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190;中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 北京分子科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190)

從理論上統(tǒng)一毛細(xì)管電泳(CE)、傳統(tǒng)電泳(EP)、離子淌度譜(IMS)、質(zhì)譜(MS)等方法,有助于系統(tǒng)化它們并向更高層次發(fā)展。不過(guò)這些方法各有歷史,各顯其專,各有門戶,統(tǒng)一不易。比如電泳,其歷史并非始于1807年Reuss的黏土電動(dòng)實(shí)驗(yàn)[1], Gautherot在1801年就已觀察到了水滴會(huì)在兩通電金屬板間移動(dòng)[2],而Bose則早在1740年就用電場(chǎng)來(lái)誘導(dǎo)噴霧了[3-6]。這比1850年Runge用莎草紙(色譜)來(lái)鑒別摻假色素[7]還早110年。電泳初名ionophoresis、cataphoresis等,1909年Michaelis稱其為electrophoresis[8],這與Tswett在1906年命名色譜[9,10]相差無(wú)幾。從1930年后Tiselius的移界電泳開始,到1940～1970年的紙和凝膠電泳建立,再到20世紀(jì)80年代的CE爆發(fā),電泳經(jīng)歷了從低效到高效、從宏量到微/痕量、從純電泳到色譜等多機(jī)制交融[11]的發(fā)展過(guò)程,已成為蛋白質(zhì)、核酸等分離分析的一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn),卓然獨(dú)立。又如MS,從1899年Thomson發(fā)現(xiàn)氖同位素算起[12],已發(fā)展120年,創(chuàng)建了諸多精美的電磁調(diào)控模式,用以囚禁離子或令其作復(fù)雜曲線飛行,在質(zhì)量測(cè)量中一家獨(dú)大。就算IMS,雖本名氣相電泳[13,14]或等離子體色譜(plasma chromatography)[15,16],歷史不長(zhǎng),卻因美軍在越南為探測(cè)叢林里人類氣息[17]而得發(fā)展,現(xiàn)多涉安全,隱然自立。

統(tǒng)一雖難,但所想并非無(wú)據(jù),亦有歷史。它緣起于1984年作者初做CE不久,后因涉獵MS而有所行動(dòng),遂發(fā)現(xiàn)它們果能溯源至同一方程。

1 電動(dòng)分離基本方程

分離源于運(yùn)動(dòng)之速度υ不同。帶電量q的粒子,會(huì)在電場(chǎng)E中受力FE=qE因而獲速,并因各種阻力∑Fi而減速。已知E是電勢(shì)φ沿l方向的導(dǎo)數(shù),即E=dφ/dl,且電場(chǎng)中離子的運(yùn)動(dòng)須遵守牛頓力學(xué)第二定律F=ma。由F=FE-∑Fi與a=dυ/dt,得:

(1)

式中m是帶電粒子質(zhì)量,t是時(shí)間,μ=υ/E稱作淌度。方程(1)即為統(tǒng)一電動(dòng)方程,是關(guān)于速度或淌度的一階微分方程。若設(shè)阻力均與速度成正比,即∑Fi=∑fiυ=∑fiμE,由初始條件μ|t=0=0可得方程的解:

(2)

式中fi是阻力系數(shù)。顯然,阻力壓制了離子的加速過(guò)程,設(shè)到時(shí)刻τ后指數(shù)項(xiàng)趨于零,運(yùn)動(dòng)變成恒速穩(wěn)態(tài),則按e-x≈1-x=0有:

(3)

加速時(shí)間τ與粒子質(zhì)量成正比,而與阻力系數(shù)成反比。可由此推論:1)由加速時(shí)間可測(cè)定離子質(zhì)量,但尚未見多少研究報(bào)道,或能成質(zhì)譜測(cè)量新模式;2)電場(chǎng)中離子的遷移狀態(tài)與介質(zhì)密不可分,真空、氣相、液相各有不同。下面分別討論之。

2 真空電遷移

2.1 飛行時(shí)間質(zhì)譜

真空無(wú)阻力,若離子沿l方向飛行,令q=ze、υ=L/t,在(0～υ,φA～φB)區(qū)間積分可得方程(1a)的解為:

(4)

式中L為飛行距離,z為價(jià)態(tài),e為電子電量,φAB為電壓。如兩離子的z相等,則時(shí)間分辨率為:

(5)

顯然,時(shí)間分辨率隨電壓非線性降低而隨飛行距離線性增加,但受空間限制,飛行管不能過(guò)長(zhǎng),一般數(shù)米,故質(zhì)量分辨率m/Δm僅達(dá)萬(wàn)級(jí),還需要超高速檢測(cè)。比如在100 V/cm下m/z=1 000的離子飛行2 m需時(shí)僅32 μs,必須有ns級(jí)檢測(cè)響應(yīng)并配MHz級(jí)多路采樣接口。

2.2 磁質(zhì)譜與雙聚焦質(zhì)譜

電場(chǎng)加速后,離子可從β角度注入磁場(chǎng)B,讓磁力FM=qυBsinβ改變其飛行方向。若β=0,離子會(huì)繼續(xù)直線飛行;而β=90°時(shí)sin90°=1,FM最大并向心,以抵抗飛行離心力(mυ2/R,R為半徑)。兩力平衡時(shí):

(6)

若m/z相同,υ越大則R也越大,即磁場(chǎng)能色散速度。合并式(6)、(4)得:

(7)

即欲定R測(cè)不同m/z離子,則需調(diào)節(jié)B或φAB。因m/z受控于多個(gè)參數(shù),磁質(zhì)譜分辨率多在萬(wàn)級(jí),但雙聚焦能提高分辨率到10萬(wàn)以上。雙聚焦利用了磁、電的速度色散作用。將式(6)的磁力用側(cè)向電場(chǎng)力zeE┴替換,有:

(8)

由R∝υ2可知,電場(chǎng)對(duì)速度的色散能力強(qiáng)于磁場(chǎng)。聯(lián)用公式(8)和(6),讓離子順序穿過(guò)扇形電場(chǎng)和磁場(chǎng),作兩次弧形飛行,可聚焦離子,提高質(zhì)量分辨率。原因是m/z相同的離子,速度大則弧長(zhǎng),速度小則弧短,最終會(huì)同時(shí)到達(dá)檢測(cè)器。

2.3 回旋共振質(zhì)譜

把角頻率ω=υ/R=f/2π代入公式(6),整理得:

(9)

即質(zhì)量分辨率隨B線性增加,在超導(dǎo)強(qiáng)磁場(chǎng)(>9 T)下可達(dá)百萬(wàn)級(jí)別,是高分辨質(zhì)譜。因Δm∝Δf,質(zhì)量分辨率也受制于頻率分辨率,但由頻率測(cè)質(zhì)量,可用射頻共振法,結(jié)合傅里葉變換,便開創(chuàng)了測(cè)量質(zhì)量新模式。

2.4 四極桿與離子阱

若離子從其他角度進(jìn)入磁場(chǎng),則會(huì)作螺旋飛行。類似地,借電場(chǎng)亦可調(diào)變其飛行軌跡甚至囚禁離子,此即構(gòu)建四極桿、離子阱、軌道阱等質(zhì)譜的理念。四極桿質(zhì)譜可采用以下調(diào)控場(chǎng):

(10)

式中φdc、φac分別指直流、交流幅值,r0為四極桿圍出的半徑(見圖1)。離子因此受到的側(cè)向力為:

(11)

圖 1 四極桿質(zhì)量分析器結(jié)構(gòu)、坐標(biāo)與調(diào)制電場(chǎng)Fig. 1 Structure, coordinates, and modulated electric field of a quadrupole mass analyzer

結(jié)合式(1)得二階偏微分運(yùn)動(dòng)方程:

(12)

φac=0時(shí)的解為:

(13)

即在四極桿上施加恒電壓,則離子在y方向的飛行軌跡穩(wěn)定,但在x方向不穩(wěn)。令

(14)

得φ不恒定時(shí)的Mathieu方程:

(15)

此方程已有詳解[18,19]。從已知解看,當(dāng)離子在徑向和縱向都穩(wěn)定時(shí),就變成了離子阱;若在l向增加一直流電場(chǎng),就變成了線性離子阱。

2.5 軌道阱[20]

建立如圖2所示的柱坐標(biāo)系統(tǒng),對(duì)紡錘形內(nèi)電極和凸肚形圓筒外電極施加由四極場(chǎng)和圓柱形電容對(duì)數(shù)場(chǎng)合并成的電勢(shì),就得到了軌道阱調(diào)控場(chǎng):

(16)

式中A是常數(shù),K是電場(chǎng)曲率,Rm叫特征半徑,r2=x2+y2。軌道阱的有用信息是l向的運(yùn)動(dòng):

(17)

(18)

即軌道阱l向的f2與m反比,亦能采用頻率和傅里葉變換來(lái)測(cè)量質(zhì)量。注意f與能量或勢(shì)阱無(wú)關(guān),故能提高分辨率和質(zhì)量測(cè)量的準(zhǔn)確度;另外m與K成正比,即只增加K就能提高分辨率而無(wú)需強(qiáng)磁場(chǎng),故而能維持高分辨,并有效降低操作與維護(hù)的成本。

圖 2 軌道阱質(zhì)譜分析器之旋轉(zhuǎn)對(duì)稱構(gòu)型與柱坐標(biāo)設(shè)置(虛線為離子軌跡)Fig. 2 Rotationally symmetric configuration of orbital trap mass spectrometer on a cylindrical coordinates, with a dotted line showing an ion trajectory

3 氣相電動(dòng)方程

氣相中,離子在電場(chǎng)中飛行,會(huì)因粒子碰撞等產(chǎn)生阻力∑Fi=Fgr,可惜Fgr未知。為解方程(1),須先處理小離子(遠(yuǎn)小于自由程λ,如<1 kD)和大離子(?10 kD),然后返回處理中間離子。

3.1 小離子電動(dòng)方程

氣體中會(huì)有3類碰撞:離子、氣體分子的自我碰撞和離子-氣體分子碰撞。樣品離子一般都很稀少,自碰概率小而可略;氣體分子多但其自碰卻不影響離子行為;唯離子-氣體分子相撞阻擋離子漂移。在數(shù)個(gè)大氣壓氛圍中,氣體分子連續(xù)碰撞兩個(gè)以上離子的概率亦小而可略,僅離子-分子雙碰撞不可忽略。各向同性碰撞前后動(dòng)量須守恒,故:

(19)

(20)

(21)

代入式(19)得:

(21a)

(21b)

(22)

(23)

(24)

合并式(21b)～(24),由PV=nkBT得:

(25)

3.2 大離子電動(dòng)方程

若離子尺寸?λ,便無(wú)法再自由行走。氣體分子會(huì)圍攏而來(lái),攀爬在離子上,活像液體并出現(xiàn)黏滯阻力Fη,其值由Stokes公式Fη=fμemE確定,其中f=6πηr,f為黏滯阻力系數(shù),η為氣體黏度,r為離子切變半徑。以氮?dú)?常用)分離牛血清白蛋白為例,因r≈4.0 nm,m=66.43 kD=1.10×10-22kg(1 D=1.66×10-27kg), 200 ℃時(shí)η=2.46×10-5Pa·s,則τ≈m/(6πηr)=1.10×10-22/(6π×2.46×10-5×4.0×10-9)=5.9×10-11s=59 ps,即大離子經(jīng)皮秒級(jí)加速便進(jìn)入穩(wěn)態(tài):

(26)

式中d為離子自身密度。淌度與質(zhì)量也是非線性關(guān)系(μ∝m-1/3),分辨率亦不高。大離子淌度也與q正比、與半徑成反比,對(duì)電荷和尺寸有高分辨率。

3.3 中等離子電動(dòng)方程

在大、小離子之間的離子,阻力不清,方程(1)雖適用卻無(wú)法解出。有人基于大離子公式,結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果,提出了多種半經(jīng)驗(yàn)公式[21-24],其中以下公式較為簡(jiǎn)明[24]:

(27)

式中A1、A2、A3為常數(shù)。由此式可得到與大離子類似的結(jié)論。

4 液相電動(dòng)方程

4.1 常規(guī)電泳方程

液相電泳阻力高于氣相,溶液中除黏滯阻力Fη外,還有雙電層影響,會(huì)出現(xiàn)反號(hào)離子的逆泳阻力Fcep和雙電層變形的弛豫阻力Frl等。它們皆與υem成正比,FR=fυem=fμemE,故式(2)和(3)仍是方程(1)的解,不過(guò)r須是溶劑化半徑。液相黏度比氣相大10倍以上,電泳會(huì)更早進(jìn)入穩(wěn)態(tài)。仍以牛血清白蛋白為例,取25 ℃水,η=8.95×10-4Pa·s,有τ≈ 1.6 ps,即比氣相快35倍;若取水中最小離子H+,由m=1.674×10-27kg,r=1.7×10-15m,有τ≈ 58 ps,略快于氣相大離子。式(26)因此亦適合液相電泳,亦即μ∝q/r∝m-1/3,即對(duì)離子電荷、尺寸分辨率高于質(zhì)量,其中尺寸分辨能力已被凝膠等篩分介質(zhì)充分強(qiáng)化,成了蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子分析的金標(biāo)準(zhǔn)。

(28)

式中NA為阿伏伽德羅常數(shù),代入球坐標(biāo)泊松方程

(29)

由邊界條件φ(r=∞)=0和公式(26),可解得離子淌度與切變面電位ζ的關(guān)系式:

(30)

式中ε為介電常數(shù),1/κ為雙電層厚度。f(κr)包含了電泳阻力和弛豫阻力,很難解析。Henry用分段處理法推得了一個(gè)復(fù)雜的Henry函數(shù)[25];而Ohshima則用試錯(cuò)法,借電動(dòng)力學(xué)及邊界條件,提出了更簡(jiǎn)明準(zhǔn)確的公式[26]:

(31)

κr→0實(shí)為點(diǎn)電荷,κr→∞則為平板,但多數(shù)κr≈1～20,可用該式計(jì)算。式(30)顯示μem是離子濃度、價(jià)數(shù)、介電常數(shù)、黏度的函數(shù),這為分離提供了優(yōu)化的依據(jù),但與各參數(shù)測(cè)量并無(wú)關(guān)。為測(cè)量計(jì),可設(shè)電泳沿方向l作一維遷移:

(32)

由此便有兩套測(cè)量方案:定時(shí)分離測(cè)遷移距離LR與定長(zhǎng)分離測(cè)出峰時(shí)間tR:

(33)

此兩方案的峰位置均會(huì)受通道、電場(chǎng)和組分淌度(因而介質(zhì))等諸多因素影響,精密度頗難控制。

由電解質(zhì)溶液之修正歐姆定律i=I/S=σE(i為電流密度,I為電流強(qiáng)度,σ為電導(dǎo)率),可將公式(32)變?yōu)?/p>

σSdt=μemIdt

(34)

在給定介質(zhì)中做恒溫分離,則淌度、電導(dǎo)率變化可忽略。在0～tR與0～LR區(qū)間積分得:

(35)

式中VR叫遷移體積,QR叫遷移電量,ρR叫遷移電密度。QR和ρR同歸一系,皆能實(shí)時(shí)測(cè)量。由此式有另外兩套測(cè)量方案:定VR測(cè)QR和定QR測(cè)VR。其中前一方案便于實(shí)施,給定分離腔即可,故予推薦。QR融合了電流(或V、E)隨時(shí)間的變化,故能抗拒電場(chǎng)等參數(shù)變化;ρR還融合了通道尺寸等因素,可抗拒通道參數(shù)變化。QR、ρR測(cè)量應(yīng)是新法,少見報(bào)道。

至此,我們有純電泳的通用方程:

(36)

其中A為常數(shù)。該式前四式為測(cè)量方案,第五對(duì)應(yīng)于原理,第六對(duì)應(yīng)于應(yīng)用。

4.2 CE方程

毛細(xì)管充入溶液,管壁兩側(cè)即形成雙電層,液層一側(cè)的反離子電泳會(huì)帶動(dòng)溶劑形成電滲。因毛細(xì)管很大,κr→∞即f(κr)=1,故:

(37)

式中μos為電滲率,ζCap為管壁切變面電位。電滲如泵,助推離子、分子按加和淌度μsum遷移:

μsum=μos±μem

(38)

石英、玻璃等毛細(xì)管電滲與正離子同向皆取正,負(fù)離子取負(fù)。毛細(xì)管壁如固定相,可保留組分。此色譜機(jī)制可由固定相或準(zhǔn)固定相P強(qiáng)化,再次改變組分淌度:

(39)

式中n是組分的分子數(shù),p為相數(shù),μ可稱為加權(quán)淌度。若僅取兩相,則:

(40)

k即保留因子,可用離子或分子出峰時(shí)間測(cè)定。由此可知CE的通用方程是公式(39),結(jié)合式(36)、(38)和(40)可推導(dǎo)各種分離模式或?qū)崿F(xiàn)各種測(cè)量。有興趣者可參閱文獻(xiàn)[11]。

5 結(jié)論

從牛頓力學(xué)第二定律可以推導(dǎo)出統(tǒng)一電動(dòng)方程,它是關(guān)于速度或淌度的一階非線性微分方程,其解與初始、邊界條件有關(guān),但阻力影響最大。本文從真空、氣態(tài)和液態(tài)3種情況出發(fā),分別推導(dǎo)了質(zhì)譜、離子淌度譜、電泳和CE的運(yùn)動(dòng)方程。從這些方程可再推導(dǎo)出新的運(yùn)動(dòng)方程和測(cè)量模式。在推導(dǎo)中發(fā)現(xiàn),介質(zhì)中的電動(dòng)加速過(guò)程很短,都在皮秒級(jí),故氣、液相中離子皆以恒速遷移。在電泳中,穩(wěn)定的測(cè)量不是時(shí)間而是電量及其衍生方法。質(zhì)譜中離子飛行于無(wú)阻力真空,能連續(xù)加速或加速后再自由飛行,其飛行軌跡可受磁場(chǎng)、交變電場(chǎng)調(diào)控,由此可構(gòu)造飛行時(shí)間質(zhì)譜、磁質(zhì)譜以及四極桿、離子阱、軌道阱、旋共振質(zhì)譜等。電場(chǎng)調(diào)制正是質(zhì)譜創(chuàng)新發(fā)展的主流和前沿方向。由此可見,推導(dǎo)統(tǒng)一理論,不僅能條理化一些紛繁的儀器方法,還能開啟發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)新研究的新途徑。