陳 義

(淮陰工學(xué)院, 江蘇 淮陰 223001; 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所, 中國(guó)科學(xué)院活體分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190;中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 北京分子科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190)

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)有豐富的分離模式[1],可從純電泳過(guò)渡到純色譜,適用面廣,加上其綠色經(jīng)濟(jì)、微量高效、簡(jiǎn)便多用等諸多特點(diǎn),本當(dāng)前程無(wú)量,可事實(shí)卻不盡然:CE頗受詬病,多責(zé)其不穩(wěn)或不重現(xiàn)。然重現(xiàn)(reproducibility)與重復(fù)(repeatability)并不同義。重復(fù)對(duì)應(yīng)于精度,多以日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差考量;重現(xiàn)乃指變參數(shù)測(cè)量,除質(zhì)譜(MS)等少數(shù)方法外,皆不重現(xiàn),非CE之弊。但不重現(xiàn)之CE,有損其定性能力,頗有貽害。因作者長(zhǎng)期經(jīng)營(yíng)CE,不忍其受貶,嘗多方挖掘解決之法,亦作經(jīng)年理論推演,稍有發(fā)現(xiàn),乃作此文。

1 時(shí)間測(cè)量模式

CE如色譜,皆以時(shí)間為變量構(gòu)建測(cè)量模式,源頭可能出自牛頓力學(xué)第二定律。用其推得電動(dòng)分離方程為:

(1)

式中m為離子質(zhì)量,μ為淌度,E為電場(chǎng)強(qiáng)度,Fi為阻力,q為離子所帶有效電荷,它們皆與t時(shí)間變量關(guān)聯(lián)。時(shí)間測(cè)量自然天成,但貽害不淺。

考慮溶液阻力源于對(duì)抗速度,或有∑Fi=fυ,則式(1)解為:

(2)

時(shí)間顯于指數(shù),對(duì)應(yīng)于加速。當(dāng)t>τ后,指數(shù)項(xiàng)可略,μ保持不變。在CE介質(zhì)中,τ僅在皮秒級(jí),所以CE實(shí)際是恒速電泳,但須受電泳、電滲和相分配機(jī)制共同控制,各有權(quán)重加到實(shí)測(cè)淌度上[1]:

(3)

式中n為溶質(zhì)分子數(shù),μem為離子有效淌度,μos為電滲率,下標(biāo)sum表示相加、p指相數(shù)。若管中只有兩相,則上式變?yōu)?

(4)

式中下標(biāo)L表示緩沖液,P表示固定相。CE中的固定相可能是準(zhǔn)固定相,也會(huì)電泳或隨電滲遷移。k為保留因子,定義為:

(5)

可用離子或中性組分測(cè)定。對(duì)于中性分子,若固定相不動(dòng)(tP=∞)并令tos=t0,則k=(tR-t0)/t0,與色譜無(wú)異。依公式(3)或(4), CE當(dāng)作加權(quán)淌度譜,但現(xiàn)實(shí)CE卻換測(cè)時(shí)間:

(6)

式中LR為遷移長(zhǎng)度,從而忽略了淌度、電場(chǎng)隨距離、時(shí)間的變化,引入許多誤差。CE多用弱電解質(zhì)緩沖溶液作介質(zhì),若價(jià)數(shù)z+=|z-|=z,則由溶液歐姆定律有:

(7)

式中I為電流強(qiáng)度,S為毛細(xì)管內(nèi)橫截面積,F=96 487 C·mol,σ為緩沖液電導(dǎo)率。cefb是緩沖液中電解質(zhì)折合成1-1價(jià)后的活度,是解離度α、濃度c(mol/m3)、活度系數(shù)γ和價(jià)數(shù)z的乘積。μ0為絕對(duì)淌度,下標(biāo)b表示緩沖液,正負(fù)號(hào)指示離子。合并式(6)與(7),整理得:

(8)

式中VR=SLR,叫遷移體積。該式清楚顯示,tR與毛細(xì)管(S、LR或VR)、電場(chǎng)(E、I、V等)、緩沖液(σ或α、γ、c、z、μ0等)、樣品等4類(lèi)參數(shù)有關(guān)。樣品還受緩沖液影響,它們共同受制于介電常數(shù)、黏度、溫度等;樣品淌度還受電滲和固定相控制。有如此眾多且互相制約因素的影響,tR很難精密,遑論重現(xiàn)。比如改變電壓或毛細(xì)管參數(shù)等其他因素,出峰位置即隨之改變。不少文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)用無(wú)緩沖能力的“緩沖液”做CE,其α不定,出峰必?zé)o法重現(xiàn)。

國(guó)內(nèi)外為解決上述問(wèn)題,提出過(guò)不少方法,首要者是穩(wěn)定電滲[2]。電滲遠(yuǎn)快于離子淌度,并與管壁狀態(tài)、緩沖液組成、樣品性質(zhì)等都有關(guān)系。樣品的非特異性吸附會(huì)改變管壁狀態(tài),影響電滲。緩沖液種類(lèi)、濃度、pH、黏度、介電常數(shù)皆影響管壁基團(tuán)解離和雙電層結(jié)構(gòu),直接影響電滲。另外,緩沖液濃度等還影響電流和焦耳熱,間接影響電滲,再影響tR。為此,要確保有足夠的緩沖容量并惰化管壁。除規(guī)范清洗毛細(xì)管的程序、穩(wěn)定緩沖液pH、黏度等[3-5]外,還可對(duì)毛細(xì)管壁做專(zhuān)門(mén)處理,如加載鍵合[6-9]或動(dòng)態(tài)涂層[10-14]、施加橫向電磁場(chǎng)[15-18]等。拋光管口、穩(wěn)定進(jìn)樣也有一定效果。然此類(lèi)研究至多能提高CE精度,無(wú)法改變重現(xiàn)性。管壁涂層因有壽命問(wèn)題,反而可能降低精度。能在一定程度上改變重現(xiàn)性的方法,是做出峰時(shí)間比例譜Rt=tR/tos[9,19]。它以電滲為參考點(diǎn),能抵消所有影響電滲的因素,但無(wú)法作實(shí)時(shí)測(cè)量,需事后分析。一言以蔽之,在時(shí)間概念內(nèi)改造CE,至今不太顯效?？磥?lái)需得跳出時(shí)間藩籬,發(fā)展非時(shí)間測(cè)量之法了。

2 非時(shí)測(cè)量模式

為推導(dǎo)非時(shí)間測(cè)量方案,需把公式(6)中忽略的因素找回。用式(7)把式(6)變?yōu)?

(9)

若認(rèn)為遷移距離變量l與σS無(wú)關(guān),僅電流密度I/S與t關(guān)聯(lián),則：

(10)

這便是遷移指數(shù)即MI法[9],式中i為電流密度。上述假設(shè)明顯不太合適,更為普適的假設(shè)應(yīng)為:管內(nèi)灌有均勻的緩沖液做恒溫CE。此時(shí)只有αγ、σ、μ的變化微小因而可略,故有:

(11)

式中VR為有效遷移體積,積分了管徑隨距離的變化,可用已知σ和μ體系表征測(cè)得。QR是可實(shí)時(shí)測(cè)量的非分析型時(shí)間函數(shù),靜電學(xué)中叫電量,CE文獻(xiàn)中誤為電通量[20],本文稱(chēng)其為遷移電量或出峰電量。將式(7)代入并整理得:

(12)

其中ρR=QR/VR為出峰電荷密度或電密度,它與MI類(lèi)似但隱含條件不同;gR=ρR/cefb是等效于1-1價(jià)電介質(zhì)的出峰摩爾電荷密度,簡(jiǎn)稱(chēng)摩爾電密度。公式(12a)與(12b)等價(jià),適用于所有樣品成分,包括離子和分子。若中性分子只隨電滲遷移,可得電滲率測(cè)量公式:

(13)

顯然QR、ρR、gR皆可與μ互換,與樣品本質(zhì)屬性關(guān)聯(lián),可用于構(gòu)造新的CE測(cè)量方式。已知離子有效淌度μem是擴(kuò)散系數(shù)D、離子半徑r或質(zhì)量m的函數(shù),它們也能用CE測(cè)量或反過(guò)來(lái)構(gòu)造測(cè)量模式。由此可以推得至少以下新的CE測(cè)量模式:加權(quán)淌度譜(weighted mobility spectrometry, WMS)、遷移電量譜(migrated charge spectrometry, MCS)、電密度譜(charge density spectrometry, CDS)、摩爾電密度譜(molar charge density spectrometry, MCDS)、擴(kuò)散系數(shù)譜(diffusion coefficient spectrometry, DCS)[22]、液相質(zhì)譜(liquid-phase mass spectrometry, LMS)等。下面分別作簡(jiǎn)要推導(dǎo)并予例證。

2.1 淌度譜和淌度比例譜

WMS按公式(3)和(12)以加權(quán)淌度分離分子和離子,由實(shí)時(shí)測(cè)量Q值作圖,因此與文獻(xiàn)之有效淌度譜[21]不同:后者只針對(duì)離子,以μem=μsum-μos繪制譜圖,由時(shí)間譜轉(zhuǎn)換而來(lái);前者以實(shí)測(cè)Q繪制μ的實(shí)時(shí)譜,不分離子、分子。為高精度測(cè)得μ-譜,應(yīng)棄用μ=LR/(Et)測(cè)量而改用μ=σVR/Q測(cè)量,其中σVR亦須用已知μ之組分表征測(cè)得。與時(shí)間譜圖(見(jiàn)圖1a、圖2a)不同,WMS能抵抗E的變化(見(jiàn)圖1b),但不能抵抗管參數(shù)VR等(見(jiàn)圖2b)的變化。

進(jìn)一步提高淌度譜重現(xiàn)性的方案是做加權(quán)淌度比例譜(weighted mobility ratio spectrometry, WMRS):

(14)

式中下標(biāo)IS表示內(nèi)標(biāo),最后一項(xiàng)表明可以直接用電滲做內(nèi)標(biāo)。比例譜能抵消對(duì)分子和分母有相同程度影響的各種因素,但不能抵消影響程度不同的因素。另外,比例譜是非實(shí)時(shí)的,除非QIS超穩(wěn)定且能事先表征出來(lái)。

圖 1 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)CE-LIF之(a)時(shí)間、(b)加權(quán)淌度、(c)遷移電量和(d)電荷密度譜圖的影響Fig. 1 Impact of electric field strength on (a) time, (b) weighted mobility, (c) migrated charge and (d) charge density spectra measured by CE-LIF CE-LIF: capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence detection. Capillary: 7 cm/13 cm (LR/total length)×50 μm ID; buffer: 5 mmol/L borax at pH 9.20; sample: fluorescein (FITC)-derived amino acids. The time spectra were measured in my lab by Dr. GUO Chao while the others were recalculated and replotted according to equation (12).

圖 2 (a)時(shí)間、(b)加權(quán)淌度、(c)遷移電量和(d)電荷密度譜隨毛細(xì)管和電場(chǎng)的變化Fig. 2 Changes of (a) time, (b) weighted mobility, (c) migrated charge and (d) charge density spectra with capillary size and electric fieldThe conditions are the same as in Fig. 1.

圖 3 電泳緩沖液濃度對(duì)(a)加權(quán)淌度譜、(b)遷移電量譜、(c)電密度譜和(d)摩爾電密度譜的影響Fig. 3 Impact of buffer concentration on (a) weighted mobility, (b) migrated charge, (c) charge density and (d) molar charge density spectraThe other conditions are the same as in Fig. 1.

2.2 遷移電量譜、電密度譜和摩爾電密度譜

加權(quán)淌度譜定義明確,但需經(jīng)Q計(jì)算,不如直接做電量譜或Q-譜簡(jiǎn)便。由公式(12)可知,Q和μ數(shù)學(xué)等價(jià),亦可抗拒電場(chǎng)影響。比較圖1c與圖1b可見(jiàn),Q-譜比μ-譜精密,因?yàn)棣坛齉外還受其他參數(shù)精度影響。注意,Q-譜也抵抗不了毛細(xì)管和緩沖液參數(shù)的變化。比較圖2c與圖2b及圖3b與圖3a可見(jiàn),Q-峰變化還遠(yuǎn)大于μ-峰,但更有規(guī)律,或許更適合于研究管參數(shù)和緩沖體系對(duì)分離的影響。

比Q-譜更穩(wěn)定的是電密度譜(ρ-譜)和摩爾電密度譜(g-譜)。若需更換毛細(xì)管,則宜用ρ-譜;若需變化緩沖液,則得換用g-譜。由式(12)可知,ρ-譜已從Q-譜中除去了遷移體積,出峰不再受管參數(shù)和電場(chǎng)強(qiáng)度的影響(見(jiàn)圖2d),但還受緩沖液影響,唯g-譜能抵抗電場(chǎng)、毛細(xì)管、緩沖液全部3類(lèi)因素的影響(比較圖3a、b、c與圖3d)。由式(12b)可知,gR只與緩沖液中的參數(shù)有關(guān),突出了樣品μ的變化,更適合于研究分離效果如何隨緩沖液參數(shù)的影響。實(shí)時(shí)測(cè)量g-譜需要事先表征或計(jì)算cefbVR參數(shù)。

g-譜尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,而ρ-譜有類(lèi)似的MI譜[11]。不過(guò)比較公式(12)和(10)可知,MI僅考慮了i隨時(shí)間的變化,而ρ-譜考慮l、t的關(guān)聯(lián)變化。

由ρ≈μb/μ可知,凡影響有效淌度的因素必會(huì)完全或大部分互相抵消,比如溶液黏度、介電常數(shù)、環(huán)境溫度等。實(shí)測(cè)表明,ρ-譜受溫度影響不到時(shí)間譜的一半(見(jiàn)圖4)。這種對(duì)溫控的低要求,有利于CE儀器研制的發(fā)展。但需注意,樣品和緩沖液電解質(zhì)的解離與pH和溫度的關(guān)系甚為復(fù)雜,不可能完全抵消,圖3d也部分反映了這種差異。

與淌度譜類(lèi)似,Q-、ρ-和g-譜亦可用比例譜來(lái)進(jìn)一步提高譜圖穩(wěn)定,且互相等價(jià),它們都是淌度比例譜的倒數(shù):

(15)

2.3 擴(kuò)散系數(shù)譜[22]

將愛(ài)因斯坦擴(kuò)散公式:

(16)

代入公式(4),整理得:

(17)

再由公式(12)得:

(18)

即擴(kuò)散系數(shù)D正比于T,但T對(duì)kB、σ的影響可被q和QR部分抵消。又電滲已被扣減,故在給定溫度時(shí),可測(cè)得穩(wěn)定的擴(kuò)散譜(見(jiàn)圖5)。為簡(jiǎn)化測(cè)量,一般取k=0做純電泳。更精密重現(xiàn)的測(cè)定是擴(kuò)散系數(shù)比例譜:

圖 4 溫度對(duì)遷移時(shí)間和遷移電荷密度的影響Fig. 4 Changes of migration time and migrated charge density with temperature Capillary: 50 cm/56.8 cm (LR/total length)×50 μm ID; buffer: 3 mol/L acetic acid and 0.1% (w/v) hydroxyethyl cellulose; sample: 3.0 mg/mL human hemoglobin. The other conditions are the same as in Fig. 1.

圖 5 混合樣品測(cè)得的毛細(xì)管電泳擴(kuò)散譜[22]Fig. 5 Diffusion coefficient spectrum measured from a mixed sample by capillary electrophoresis[22] Capillary: 37 cm/55 cm (LR/total length)×75 μm ID; buffer: 10 mmol/L 3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid at pH 9.00; voltage: 10 kV.

(19)

只需向樣品加入一已知擴(kuò)散系數(shù)的內(nèi)標(biāo)IS即可。擴(kuò)散系數(shù)譜和擴(kuò)散系數(shù)比例譜均需事后重建。但對(duì)于給定系統(tǒng),若電滲為零或已知,亦可實(shí)時(shí)測(cè)量擴(kuò)散系數(shù)譜。

2.4 液相質(zhì)譜

由斯托克斯剛性球黏滯阻力系數(shù)和質(zhì)量密度d關(guān)系式,可將式(6)變成:

(20)

假設(shè)各離子在同種溶液中密度差異可略,則在給定電泳條件下,可以直接實(shí)現(xiàn)LMS測(cè)量:

(21)

有電滲和相分配時(shí):

(22)

依據(jù)上式作LMS需事先用標(biāo)準(zhǔn)樣品校正CE系統(tǒng)。為獲得高穩(wěn)定結(jié)果,可換做質(zhì)量比例譜:

(23)

欲使LMS更像MS,可設(shè)法“電離”樣品成分(A)。容易設(shè)想的液相離子化方法是化學(xué)衍生離子化(liquid-phase deriving ionization, LDI)。若忽略衍生對(duì)A結(jié)構(gòu)的影響,得到的是啞鈴型產(chǎn)物A-B,則由式(2)與(20)有:

(24)

式中qA和qB分別為A和衍生基團(tuán)B所帶電荷,rA和rB為兩者單獨(dú)時(shí)的溶劑化半徑。代入公式(4)并整理后得:

(25)

該公式顯示,A-B的大小可由CE直接測(cè)得,若rB已知?jiǎng)t可求得rA。CE中的樣品濃度一般很低,多為良溶液,故高分子會(huì)無(wú)規(guī)卷曲,其溶劑化半徑可由Flory公式給出[23,24]:

rA=2Nnrmo

(26)

式中N是單體數(shù)目,rmo是單體半徑。N與單體之間的斥力有關(guān),無(wú)斥力時(shí)n=1/2,否則n=3/5。由此可計(jì)算A的質(zhì)量mA:

(27)

圖 6 聚乙二醇(5 kD)的(a)LMS和(b)MS譜圖Fig. 6 (a) LMS and (b) MS spectra of polyethylene glycol (5 kD)a. recalculated from the data in ref. [25]; b. replotted from ref. [25].

式中mmo是單體殘基平均質(zhì)量。圖6顯示,LMS(見(jiàn)圖6a)與MS(見(jiàn)圖6b)[25]完全可比。

3 結(jié)論

經(jīng)理論推導(dǎo)和簡(jiǎn)明實(shí)驗(yàn)例證,可以肯定CE不僅能精密測(cè)量,還能像MS一樣,做高重現(xiàn)測(cè)量。關(guān)鍵在于思路,要采用非時(shí)CE測(cè)量方案。本文基于電量Q測(cè)量,推導(dǎo)并驗(yàn)證了加權(quán)淌度譜、電量譜、電密度譜、摩爾電密度譜能做實(shí)時(shí)測(cè)量,而擴(kuò)散系數(shù)譜、液相質(zhì)譜以及各類(lèi)比例譜一般須實(shí)驗(yàn)后重構(gòu)。這些方法都在一定條件下能成為超穩(wěn)定CE,很有發(fā)展前景和應(yīng)用潛力,值得深入研究。

致謝 感謝郭超、郭振朋博士提供有關(guān)實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)。