錢(qián) 鑫, 田 晏, 羅欣欣, 潘靜苗, 鄧蘇雅, 黃一可, 付琦峰, 夏之寧*

(1. 重慶大學(xué)藥學(xué)院, 重慶 401331; 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 重慶 400016; 3. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 四川 瀘州 646000)

藥物篩選是使用適當(dāng)?shù)姆椒ê图夹g(shù),從眾多化合物中篩選出具有藥理活性的化合物的新藥研發(fā)過(guò)程。藥物篩選的數(shù)量越大,范圍越廣,發(fā)現(xiàn)新藥的概率也就越大,因此研究人員不斷地對(duì)藥物篩選方法和技術(shù)提出新要求。

藥物篩選方法之一是以藥代動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)[1],通過(guò)對(duì)候選化合物在人體吸收、分布、代謝和排泄的性質(zhì)以及化學(xué)毒性等因素進(jìn)行綜合評(píng)估,篩選出更有開(kāi)發(fā)價(jià)值的化合物。另一種是以藥理活性為基礎(chǔ)的篩選[2],其基本方法是評(píng)價(jià)藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合能力以及對(duì)靶點(diǎn)功能的影響,從而篩選出具有一定藥理活性的化合物。藥物篩選的方法主要是以相互作用研究為基礎(chǔ)，建立以酶、受體、核酸等化合物為靶點(diǎn)的藥物篩選模型，從而進(jìn)行化合物的活性評(píng)價(jià)。

藥物篩選技術(shù)較多,目前依靠?jī)x器手段的藥物篩選主要有高通量篩選、高內(nèi)涵篩選以及微流控芯片篩選等。毛細(xì)管電泳(CE)依靠的研究介質(zhì)體系是水溶液,可以模擬生命介質(zhì)環(huán)境而進(jìn)行藥物篩選,且篩選過(guò)程不引入其他干擾作用,即能比較準(zhǔn)確地反映藥物與靶點(diǎn)的相互作用,又具有效率高、通量可擴(kuò)展以及試樣量小等優(yōu)點(diǎn),已成為潛力較大的藥物篩選方法。

1 CE藥物篩選的基本原理

1.1 以藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)性質(zhì)為基礎(chǔ)的篩選

對(duì)于結(jié)構(gòu)非特異性藥物,弱酸候選藥物的酸平衡性質(zhì)(pKa值)以及候選藥物的油水分配系數(shù)(Po/w值)直接影響其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),從而影響藥效。傳統(tǒng)測(cè)定pKa值或Po/w值的方法建立在對(duì)候選化合物兩相平衡濃度的測(cè)定之上。CE相對(duì)于傳統(tǒng)的測(cè)定方法,具有速度快、操作簡(jiǎn)便、試樣消耗量小等特點(diǎn),且對(duì)化合物的純度要求不高,有多種模式可供選擇,因而在pKa值和Po/w值的測(cè)定中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[3]。

當(dāng)候選化合物具有弱酸性或弱堿性時(shí),在生物體內(nèi)將部分解離形成離子型和分子型兩種狀態(tài)。分子型穿過(guò)生物膜后解離成離子型發(fā)揮藥理作用,因此藥物篩選的目標(biāo)是篩選出具有適當(dāng)解離度的化合物。使用CE測(cè)定pKa值基于的是有機(jī)酸堿的電離平衡理論,其利用了有效電泳淌度與氫離子濃度[H+]之間的非線性關(guān)系[4]。

對(duì)于一元弱酸(HA)化合物,溶質(zhì)的有效淌度(μeff，cm2/(V·s))和緩沖溶液[H+]之間的非線性關(guān)系為:

(1)

式中,μA-為藥物離子淌度(cm2/(V·s)),可由候選藥物遷移時(shí)間(s)和毛細(xì)管的長(zhǎng)度(cm)等參數(shù)獲得;Ka為弱酸解離常數(shù)。CE可測(cè)得一系列不同酸度下藥物的μeff值,然后通過(guò)線性回歸求得Ka值。

藥物Po/w值的測(cè)定主要采用膠束或微乳電動(dòng)色譜法(MEEKC)。該法不受藥物溶解度的局限,并適應(yīng)任何pH條件,可以通過(guò)對(duì)一系列已知Po/w的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行MEEKC分析來(lái)測(cè)定Po/w[5],依據(jù)的理論公式為:

(2)

1.2 以相互作用為基礎(chǔ)的CE篩選

運(yùn)用CE方法分析藥物與靶點(diǎn)的相互作用獲得結(jié)合常數(shù)Kb值的藥物篩選方法分為兩類:一類是根據(jù)藥物的電泳淌度在受體存在后發(fā)生變化來(lái)測(cè)定Kb值,方法有親和毛細(xì)管電泳法(ACE)[7]和空位親和毛細(xì)管電泳法(VACE)[8];另一類是根據(jù)配受體結(jié)合物離解后的平衡濃度求得Kb,方法主要包括配體分離法(LS)[9]、空位峰法(VP)[8]、Hummel-Dreyer法(HD)[10]和前沿分析法(FA)[11]。

1.2.1親和毛細(xì)管電泳

ACE是研究分子間相互作用最常用的方法,該法基于配體-受體相互作用原理進(jìn)行藥物篩選。1992年,Chu等[12]使用CE對(duì)萬(wàn)古霉素和多種肽進(jìn)行相互作用研究,從中篩選出了與萬(wàn)古霉素相互作用最強(qiáng)的肽。隨后,該團(tuán)隊(duì)[7]將這種對(duì)物質(zhì)間相互作用進(jìn)行研究的方法正式命名為親和毛細(xì)管電泳法,同時(shí)建立了基于Scatchard方程的分析方法。在此基礎(chǔ)上,Zhang等[13]對(duì)該分析方法進(jìn)行了改進(jìn),利用淌度比對(duì)Kb值進(jìn)行求解,這一改進(jìn)消除了毛細(xì)管長(zhǎng)度、黏度與運(yùn)行電壓對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,從而提高了ACE在藥物篩選中的重現(xiàn)性。

ACE依據(jù)受體或配體在發(fā)生親和作用后有效電泳淌度的變化進(jìn)行Kb值的求解?？晒┻x擇的受體-配體體系有:蛋白質(zhì)(P)與藥物(D)、DNA與藥物、抗體與抗原、酶與底物等。

(3)

經(jīng)過(guò)推導(dǎo)后,可得到Scatchard方程:

(4)

對(duì)其進(jìn)行變形可得到:

(5)

(6)

公式(4)、(5)、(6)分別為雙倒數(shù)法、y-倒數(shù)法和x-倒數(shù)法。μD代表游離藥物淌度(cm2/(V·s)),μPD代表復(fù)合物淌度(cm2/(V·s)),μP-PD代表游離和結(jié)合兩種形態(tài)蛋白質(zhì)共同貢獻(xiàn)的淌度(cm2/(V·s))。采用以上3種方法作圖均可求得結(jié)合常數(shù)Kb值:雙倒數(shù)法以1/(μP-PD-μD)對(duì)1/[P]作圖,所得直線的截距與斜率之比為Kb值;y-倒數(shù)法以[P]/(μP-PD-μD)對(duì)[P]作圖,所得直線的斜率與截距之比為Kb值;x-倒數(shù)法以(μP-PD-μD)/[P]對(duì)μPD-μD作圖,所得直線的斜率即為Kb值。利用此方法,Li等[14]對(duì)布洛芬和阿司匹林與血清白蛋白之間相互作用進(jìn)行了研究,比較了它們的Kb值;Katriina等[15]也研究了載脂蛋白B與6-硫酸軟骨素的相互作用。

1.2.2動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管電泳(KCE)

在藥物篩選的過(guò)程中,結(jié)合常數(shù)Kb、配受體的正向結(jié)合速率常數(shù)Kon和反向解離速率常數(shù)Koff是3個(gè)有意義的參數(shù)。其中,Kon和Koff是表征配體和受體間結(jié)合速率、指導(dǎo)藥物在體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)應(yīng)用,以及藥物起效快慢、對(duì)機(jī)體作用程度的參數(shù)。ACE只能測(cè)定結(jié)合常數(shù)Kb值。2005年,Krylov團(tuán)隊(duì)[16]提出了動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管電泳,除了可以測(cè)定Kb,還能測(cè)得動(dòng)力學(xué)常數(shù)Kon和Koff。

藥物靶分子(T)與配體分子(L,生物大分子)首先進(jìn)行親和相互作用,隨后通過(guò)電泳將具有不同遷移速率的藥物靶分子、配體分子和結(jié)合物(C)進(jìn)行分離,通過(guò)建立數(shù)學(xué)方程式描述KCE的傳質(zhì)過(guò)程,并求解出動(dòng)力學(xué)參數(shù)Kon、Koff和Kb等。按照不同的初始條件和邊界條件,將KCE分為7種模式[17],如表1所示,即平衡混合物的非平衡CE(NECEEM)、平衡混合物的平衡CE(ECEEM)、掃集CE(Sweep CE)、區(qū)帶順進(jìn)CE(ppKCE)、連續(xù)平衡混合物之非平衡CE(cNECEEM)、短掃集CE(sSweep CE)和平衡混合物之短掃集CE(sSweep CEEM)。表中均假設(shè)T的遷移速率大于L的遷移速率。

表 1 7種動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管電泳示意圖

1.2.2.1NECEEM與ECEEM

NECEEM最早用于蛋白質(zhì)-DNA相互作用的研究[18],其過(guò)程包括將靶標(biāo)、配體事先混合孵育,使其達(dá)到平衡狀態(tài)后進(jìn)樣,根據(jù)混合物中T、L以及T-L復(fù)合物淌度的不同進(jìn)行電泳分離,背景緩沖液中不存在T,造成T-L復(fù)合物在電泳過(guò)程中不斷解離,該分離在非平衡狀態(tài)下進(jìn)行。該方法可通過(guò)一次電泳測(cè)定Kb和Koff,進(jìn)一步求得Kon。

NECEEM可以作為一種單通量的藥物篩選方法,以法尼基轉(zhuǎn)移酶(PFTase)為模型靶標(biāo)蛋白,通過(guò)NECEEM方法測(cè)得篩選前DNA文庫(kù)的解離常數(shù)Kd值,然后將平衡混合物中PFTase的濃度改為nmol/L級(jí)別,使用該法在一輪篩選后得到了Kd值為nmol/L級(jí)別的DNA適配體,篩選前后DNA文庫(kù)的整體親和力增加了200倍,該報(bào)道[19]首次將NECEEM方法引入核酸適配體的篩選中,高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)令其成為篩選核酸適配體的主要方法。

與NECEEM不同,ECEEM的分離是在運(yùn)行緩沖液中含有相同濃度T的條件下進(jìn)行的,即T-L復(fù)合物在分離過(guò)程中始終保持平衡狀態(tài)。ECEEM的獨(dú)特之處在于,具有不同Kd值的配體以不同且可預(yù)測(cè)的遷移率遷移。因此,選擇具有不同遷移率的組分會(huì)得到具有不同且可預(yù)測(cè)的Kd值的配體[20],能在復(fù)雜的候選藥物共存體系中發(fā)揮篩選評(píng)價(jià)作用。

除了單獨(dú)使用,也可以將NECEEM和ECEEM結(jié)合,用于DNA編碼化合物的篩選[21]。以碳酸酐酶Ⅱ(CA Ⅱ)為模型靶蛋白,模型庫(kù)中包含與CA Ⅱ親和力強(qiáng)(Kd=490 nmol/L)的DNA編碼苯甲酰胺(DNA-BSB)和親和力弱(Kd?100 μmol/L)的DNA編碼色胺(DNA-tryptamine),其比例為1∶105。在兩輪篩選后,成功將混合庫(kù)中DNA-BSB與DNA-tryptamine的比例升至11∶1,且DNA-tryptamine的量低于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的檢出限,與預(yù)測(cè)情況相符。該報(bào)道[21]證明了使用NECEEM和ECEEM結(jié)合的方法不僅可以對(duì)篩選的配體進(jìn)行定性,還可對(duì)其定量,有望用于篩選海量的DNA編碼化合物庫(kù)。

1.2.2.2Sweep CE

與NECEEM不同,Sweep CE不用預(yù)先孵育平衡混合物,而是使毛細(xì)管內(nèi)都具有L,并將T裝于入口瓶中。由于L的電泳淌度小于T,電泳開(kāi)始后,T不斷穿過(guò)L并與之形成C。Sweep CE主要研究的是L、T的結(jié)合過(guò)程,因此可直接測(cè)定Kon。Krylov課題組[22]利用該法研究了單鏈DNA結(jié)合蛋白和15聚體DNA寡核苷酸之間的相互作用,并測(cè)得Kon。

1.2.2.2ppKCE

ppKCE與NECEEM類似,但沒(méi)有預(yù)先注入平衡混合物,而是將T和L以區(qū)帶的形式注入充滿運(yùn)行緩沖液的毛細(xì)管中。電泳開(kāi)始后,T穿過(guò)L形成C,并伴隨有C的解離。因此ppKCE可通過(guò)一次過(guò)程直接測(cè)定Kon和Koff[16,23]。ppKCE主要用于考察蛋白質(zhì)和DNA間的相互作用,本課題組[24,25]在前人的基礎(chǔ)上將ppKCE擴(kuò)展到蛋白質(zhì)與小分子間相互作用的研究上,研究了其與西酞普蘭、依匹斯汀、加替沙星及羅沙替丁間的相互作用,并測(cè)定了Kon、Koff及Kb值。其他諸如cNECEEM、sSweep CE和sSweep CEEM等方法也都各有特色,并成為潛在的CE藥物篩選方法。

1.2.3配體分離法

Heegaard等[9]曾使用另一種方法對(duì)結(jié)合常數(shù)進(jìn)行求解,并將其稱為配體分離法。LS與ACE和KCE最大的區(qū)別是其依據(jù)濃度變化進(jìn)行相互作用分析。該方法的運(yùn)行緩沖液中不含有蛋白質(zhì)或者藥物,而是將相同濃度的蛋白質(zhì)和藥物預(yù)先混合作為樣品,待結(jié)合達(dá)到平衡后進(jìn)入毛細(xì)管。游離藥物和結(jié)合物的濃度隨蛋白質(zhì)濃度的變化而變化,根據(jù)這些變化便可計(jì)算得到蛋白質(zhì)和藥物之間的結(jié)合常數(shù)Kb值。對(duì)蛋白質(zhì)純度的要求較低是LS的主要優(yōu)點(diǎn)。利用此方法,Wang等[26]測(cè)定了牛血清白蛋白(BSA)與其單克隆抗體的Kb值;張勃等[27]也測(cè)定了抗真菌藥物棘球白素B的母核與其多克隆抗體之間的結(jié)合常數(shù),并建立了以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物篩選模型。該法存在一定的局限性,因?yàn)橐笈潴w與受體的結(jié)合能力足夠強(qiáng),生成的結(jié)合物足夠穩(wěn)定,以保證使用該方法時(shí)不會(huì)因?yàn)榻Y(jié)合藥物的解離而對(duì)游離藥物含量的測(cè)定產(chǎn)生影響。

表 2 毛細(xì)管電泳相互作用分析方法

1.2.4其他方法

VACE與ACE原理基本相同,區(qū)別在于VACE依據(jù)兩個(gè)負(fù)峰遷移時(shí)間的變化計(jì)算結(jié)合常數(shù)[28]。Busch等[29]曾將VACE用于萬(wàn)古霉素與N-Ac-d-丙氨酰-d-丙氨酸組成的體系進(jìn)行相互作用的研究,其結(jié)果與ACE所得結(jié)果具有良好的一致性。VP與VACE的操作類似,不同的是VP法要求溶質(zhì)和配體有相近的淌度[8]。Busch等[8]利用此方法研究了華法林與BSA的相互作用,并測(cè)定了Kb值。HD主要是通過(guò)測(cè)定游離藥物負(fù)峰的面積得到游離藥物的濃度,從而計(jì)算得到Kb值[10]。Quaglia等[30]用該法測(cè)定了α-酸性糖蛋白(AGP)與頭孢曲松之間的Kb值。FA通過(guò)向毛細(xì)管中注入藥物、蛋白質(zhì)及藥物-蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的平衡樣品混合物,依據(jù)遷移率的不同進(jìn)行分離[11]。Ding等[31]用該法研究了堿性藥物與人血清白蛋白(HSA)之間的相互作用,并測(cè)得結(jié)合常數(shù)Kb值與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。

這些方法各有特點(diǎn),應(yīng)依據(jù)研究中的不同情況選擇適宜的方法,表2為這些分析方法的匯總。

1.3 CE篩選應(yīng)用體系

CE藥物篩選中，與藥物作用的對(duì)象有許多,如核酸、蛋白質(zhì)(包括抗體和酶等)等生物分子和細(xì)胞膜、細(xì)胞(細(xì)菌),其中一些價(jià)格昂貴,難以獲得。CE的樣品用量在nL級(jí)別,能在類似于生命介質(zhì)的環(huán)境下運(yùn)行,已應(yīng)用于生物分子與配體的相互作用研究和篩選。

1.3.1以蛋白質(zhì)為作用對(duì)象

以蛋白質(zhì)為受體的CE藥物篩選技術(shù)包括以下幾類體系:

第一類是血漿蛋白。由于藥物進(jìn)入人體發(fā)揮藥理作用的過(guò)程中需要與血漿蛋白結(jié)合,因此對(duì)蛋白質(zhì)與藥物的結(jié)合特性，諸如結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合常數(shù)等進(jìn)行研究對(duì)新藥的篩選具有較大意義。郭寶元等[32]在CE相互作用分析中發(fā)現(xiàn),采用峰漂移法對(duì)藥物與蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用研究比其他方法效果更好。在此基礎(chǔ)上,該團(tuán)隊(duì)對(duì)麻黃堿、咖啡因、撲熱息痛與BSA的相互作用進(jìn)行了研究。Jiao等[33]綜述了中藥有效成分與血漿蛋白結(jié)合的常用分析方法,總結(jié)了不同類型中藥活性成分與血漿蛋白結(jié)合的規(guī)律。

第二類是抗原(Ag)。建立在抗體(Ab)和抗原間特異性免疫反應(yīng)的方法稱為免疫分析,將CE應(yīng)用于免疫分析領(lǐng)域,便形成了一種新型的免疫分析技術(shù),即CE免疫分析法(CE immunoassay, CEIA)。Hurrell等[34]于1986年便將CE用于免疫分析領(lǐng)域研究中。Luo等[35]對(duì)CEIA進(jìn)行綜述,并將CEIA分為競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性兩種。競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法通過(guò)對(duì)受標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物[Ag*-Ab]和[Ag*]兩個(gè)峰的信號(hào)進(jìn)行比較,可計(jì)算得到[Ag]的含量。而在非競(jìng)爭(zhēng)免疫分析則通過(guò)檢測(cè)[Ab*-Ag]與過(guò)量的[Ab*]的峰信號(hào)實(shí)現(xiàn)定量分析,抗原、抗體的標(biāo)記物可為放射性同位素、酶、化學(xué)發(fā)光劑等。競(jìng)爭(zhēng)性分析適用于低分子量的抗原或抗體分子;而非競(jìng)爭(zhēng)性分析適用于分子量較大的蛋白質(zhì)。利用CEIA法,Liu等[36]對(duì)阿霉素及其單克隆抗體進(jìn)行了研究,建立了依據(jù)熒光特性的抗癌藥物分析方法。張勃等[27]將CE技術(shù)與結(jié)構(gòu)篩選結(jié)合起來(lái),建立了以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物篩選模型,用于具有抗原類似結(jié)構(gòu)的化合物的篩選。該藥物篩選模型具有高特異性、高篩選效率的優(yōu)點(diǎn)。

第三類是具有催化功能的酶,當(dāng)前對(duì)酶抑制劑的活性評(píng)價(jià)與篩選逐漸成為研究熱點(diǎn)之一。康經(jīng)武等[37]綜述了CE在天然產(chǎn)物中酶抑制劑篩選的研究進(jìn)展,并總結(jié)了轉(zhuǎn)移酶、水解酶及氧化還原酶的抑制劑在CE篩選中的研究成果。在CE篩選中,酶抑制劑的篩選主要有柱前酶反應(yīng)模式和在柱酶反應(yīng)模式這兩種不同的分析方法。而根據(jù)是否將酶固定在毛細(xì)管中,在柱酶反應(yīng)模式又可分為電泳中介微分析(EMMA)與固定化酶微反應(yīng)器(IMER)兩種模式。

EMMA技術(shù)于20世紀(jì)90年代初期,由Bao等[38]首次提出:利用游離的酶與底物在電場(chǎng)下具有不同的遷移速度,通過(guò)擴(kuò)散作用,使其混合均勻,并根據(jù)電泳淌度的差異進(jìn)行分離。王海榮等[39]采用該技術(shù)對(duì)抗癌藥物的熱門(mén)靶點(diǎn)進(jìn)行了研究,建立了氨肽酶N抑制劑的篩選模型,為抗癌藥物的篩選提供了新的方法。

IMER技術(shù)通過(guò)適宜的方法將酶固定于毛細(xì)管內(nèi)壁,將待篩選的樣品與底物混合后進(jìn)樣,測(cè)定產(chǎn)物的峰面積并將其與僅底物進(jìn)樣時(shí)的產(chǎn)物峰面積進(jìn)行對(duì)照，判斷樣品對(duì)酶的抑制能力,以此達(dá)到對(duì)酶抑制劑進(jìn)行篩選的目的。該法將酶固定于毛細(xì)管中,因此具有良好的穩(wěn)定性,此外還有可重復(fù)利用以及樣品消耗少等優(yōu)勢(shì)。Cheng等[40]采用IMER法對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行固定化并實(shí)現(xiàn)了對(duì)15種中藥成分進(jìn)行酶抑制劑的在線篩選,證實(shí)了黃芩苷對(duì)凝血酶的抑制活性。

1.3.2以細(xì)胞(細(xì)菌)為作用對(duì)象

CE在細(xì)胞水平上的藥物篩選體系主要包括細(xì)胞-配體[41],細(xì)菌-配體[42]以及細(xì)胞膜-配體[43]。CE以水溶液為介質(zhì),接近人體真實(shí)環(huán)境,并具有微型化和高通量等特點(diǎn),已成為細(xì)胞水平上藥物篩選的有力工具。夏之寧等[32]使用ACE方法對(duì)細(xì)胞和藥物進(jìn)行了研究,對(duì)麻黃堿、咖啡因和腎上腺素與紅細(xì)胞的相互作用進(jìn)行了比較。Li等[44]研究了喹諾酮類藥物與細(xì)菌之間的相互作用,基于細(xì)菌與抗菌對(duì)映體的立體選擇性和親和性,建立了一種細(xì)菌手性選擇分離氧氟沙星的新方法,為對(duì)映體分析、手性藥效學(xué)和手性藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了新途徑。Xia等[43]將細(xì)胞膜作為假固定相采用CE峰漂移法測(cè)定了西酞普蘭和兔紅細(xì)胞膜的Kb值,后又以ppKCE為理論基礎(chǔ)測(cè)定了多種藥物與紅細(xì)胞膜的相互作用[24]。

1.3.3以核酸為作用對(duì)象

絕大部分藥物都是以受體分子、酶、離子通道為作用靶標(biāo),以核酸(DNA或RNA)為靶標(biāo)的藥物主要包括抗菌藥、抗病毒藥及抗腫瘤藥物。以核酸為靶標(biāo)的藥物篩選技術(shù)有濾膜結(jié)合試驗(yàn)、凝膠滯后試驗(yàn)、表面等離子共振以及基于熒光的高通量篩選技術(shù)等,目前尚無(wú)CE應(yīng)用于以核酸為靶標(biāo)的藥物篩選相關(guān)報(bào)道,但由于CE可在類似于生命介質(zhì)的環(huán)境下進(jìn)行并具有微量快速分析的特點(diǎn),可以預(yù)見(jiàn)該類藥物的CE篩選將很快出現(xiàn)。

1.4 CE篩選藥物的類型

1.4.1核酸適配體

核酸適配體是從大量的核酸分子文庫(kù)中篩選出的短鏈寡核苷酸,能與許多目標(biāo)物特別是蛋白質(zhì)特異性結(jié)合,而且穩(wěn)定性好,容易制備及修飾,被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX技術(shù))是篩選適配體的經(jīng)典方法,但在配體靶標(biāo)復(fù)合物與游離配體分離技術(shù)上遇到了瓶頸。CE篩選過(guò)程是在溶液相中完成,無(wú)須介質(zhì)固定,且篩選成本低,速度快。自2004年Bowser等[45]首次將CE和SELEX技術(shù)結(jié)合,該技術(shù)不斷發(fā)展并在核酸適配體篩選上展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì),被認(rèn)為是核酸適配體篩選的最高效方法。

基于CE-SELEX，有3種主要的動(dòng)力學(xué)篩選模式:NECEEM模式、ECEEM模式和non-SELEX模式。Berezovski團(tuán)隊(duì)[19]采用NECEEM模式對(duì)8種適配體進(jìn)行了藥物篩選。在這些適配體中,獲得了對(duì)PFTase具有nmol/L級(jí)親和力的最佳適配體,其Kd值為0.5 nmol/L。這些結(jié)果證明了NECEEM可以作為開(kāi)發(fā)和利用寡核苷酸適配體的通用工具。隨后,該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了h-Ras蛋白的核酸適配體篩選,證明了基于NECEEM的non-SELEX篩選技術(shù)無(wú)須PCR擴(kuò)增,且篩選效率高[46]。

屈鋒團(tuán)隊(duì)[47,48]自2007年開(kāi)展CE-SELEX以來(lái),已用多種CE-SELEX篩選模式成功篩選出多尺度靶標(biāo)(如小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和微生物)的核酸適配體,并對(duì)篩選核酸適配體的CE方法進(jìn)行了系統(tǒng)綜述。楊歌等[49]將80 nt的單鏈DNA庫(kù)與鹽酸克倫特羅混合孵育,篩選出親和力較強(qiáng)的3條序列,為小分子靶標(biāo)的核酸適配體篩選奠定了基礎(chǔ);同樣,他們[50]也用CE-SELEX技術(shù)篩選出了人免疫球蛋白G(IgG)Fc片段的核酸適配體,該適配體未來(lái)可能用于IgG效應(yīng)功能的調(diào)控。

1.4.2天然藥物

天然藥物可能具有十幾種甚至更多成分,往往不易進(jìn)行分離分析,這給單獨(dú)活性評(píng)價(jià)帶來(lái)困難。而CE具有對(duì)多成分復(fù)雜體系分離的能力,因此使用CE對(duì)天然藥物進(jìn)行研究十分普遍,且分離分析的同時(shí)可進(jìn)行活性篩選。Huang等[51]利用CE分離和鑒定油菜提取物，并評(píng)價(jià)了其中酚酸和類黃酮物質(zhì)的抗氧化活性。Tsukagoshi等[52]、Yang等[53]和夏之寧等[54]均使用基于魯米諾反應(yīng)的CE-CL聯(lián)用技術(shù)對(duì)天然藥物中抗氧化活性進(jìn)行了研究,豐富了天然藥物抗氧化劑的CE篩選基礎(chǔ)工作。

2 CE藥物篩選相關(guān)技術(shù)

2.1 化合物庫(kù)篩選技術(shù)

DNA編碼化合物庫(kù)(DECL)技術(shù)是一種在分子水平進(jìn)行藥物發(fā)現(xiàn)的高效方法,具有海量化合物成員數(shù)量、超高效篩選速度等特點(diǎn),被制藥界公認(rèn)為近年來(lái)創(chuàng)新藥物領(lǐng)域發(fā)展最快速且最重要的手段之一[55]。迄今,通過(guò)DECL技術(shù)已成功篩選出若干臨床化合物。例如葛蘭素史克公司的針對(duì)可溶性環(huán)氧化物水解酶的抑制劑GSK2256294[56],以及針對(duì)受體相互作用蛋白I的首創(chuàng)新藥GSK2982772[57]。Drabovich等[58]充分利用DECL在藥物篩選中高通量、高效率的優(yōu)勢(shì),將這種先進(jìn)的DECL技術(shù)與CE技術(shù)進(jìn)行結(jié)合。利用CE中DNA-小分子耦合物、靶標(biāo)蛋白、DNA-小分子耦合物與靶標(biāo)蛋白復(fù)合物這3類物質(zhì)間的電泳淌度不同來(lái)分離,從而達(dá)到在同相中進(jìn)行藥物篩選的目的。

2.2 餾分收集技術(shù)

雖然試量小是毛細(xì)管電泳的優(yōu)點(diǎn),但是極微量的樣品經(jīng)分離后的餾分收集是CE的一大問(wèn)題,因此關(guān)于CE的餾分收集鮮有報(bào)道。在使用CE進(jìn)行藥物篩選的過(guò)程中,需要將毛細(xì)管內(nèi)特定區(qū)域的餾分收集起來(lái)進(jìn)行二次鑒定,如未知成分需進(jìn)行MS檢測(cè),未知序列的DNA需經(jīng)PCR后測(cè)序等。

應(yīng)用CE餾分收集技術(shù),得以將CE和SELEX結(jié)合,成為篩選親和力為nmol/L級(jí)別的抗IgE適配體技術(shù)[45]。采用傳統(tǒng)的SELEX技術(shù),與靶標(biāo)蛋白結(jié)合緊密的DNA很難從色譜柱上洗脫下來(lái),SELEX與CE結(jié)合后,DNA復(fù)合物與游離DNA淌度有明顯差異而得以分離,再應(yīng)用CE餾分收集技術(shù)回收篩選出的DNA。non-SELEX方法[19]以確定收集窗的方式收集餾分,進(jìn)行多次NECEEM分離,將ssDNA庫(kù)的親和力提高了5個(gè)數(shù)量級(jí),篩選效率大大提升。羅昭鋒等[59]將餾分收集毛細(xì)管電泳(fraction collection CE, FCE)與SELEX技術(shù)結(jié)合提出了FCE-SELEX方法,他們將收集窗分成小段,分開(kāi)收集,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的循環(huán)次數(shù)確定結(jié)合復(fù)合物的位置,僅用一輪篩選就獲得了親和力為nmol/L級(jí)別的鏈霉親和素適配體。該方法一改前面大范圍收集的作風(fēng),提出了分段收集的新概念,是CE藥物篩選餾分收集方法的新舉措。

2.3 CE-CL聯(lián)用技術(shù)

將CE與自由基氧化發(fā)光反應(yīng)體系進(jìn)行結(jié)合,便可構(gòu)建毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光聯(lián)用裝置[60],該裝置的原理是自由基可使發(fā)光試劑氧化發(fā)光,而抗氧化劑對(duì)自由基的清除作用可造成化學(xué)發(fā)光受到抑制,通過(guò)對(duì)抑制程度進(jìn)行測(cè)定，實(shí)現(xiàn)抗氧化活性的評(píng)價(jià)。在CE-CL基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展,構(gòu)建紫外吸收-化學(xué)發(fā)光雙檢測(cè)系統(tǒng),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多組分復(fù)雜樣品的篩選。因此可將其應(yīng)用到中藥復(fù)雜體系中,對(duì)篩選天然產(chǎn)物中的抗氧化劑具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2.4 CE-MS聯(lián)用技術(shù)

毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不僅具有CE對(duì)復(fù)雜體系的高效分離能力,同時(shí)具有質(zhì)譜對(duì)組分的強(qiáng)大鑒定能力。CE可以將眾多化合物成分進(jìn)行分離,同時(shí)根據(jù)化合物之間的相互作用能力差異,篩選出候選化合物。MS能將這些候選化合物進(jìn)行定性,有利于微量，甚至超微量的組分鑒定。因此,這種雙重功能使CE-MS技術(shù)成為一種有潛力的藥物篩選手段。例如,對(duì)酶的活性評(píng)價(jià)及酶抑制劑篩選中,Hoffmann等[61]基于CE-ESI-MS/MS研究了α-胰凝乳蛋白酶(α-CT)與5種酶抑制劑的相互作用,并對(duì)其親和力進(jìn)行了比較,MS的高靈敏性以及對(duì)目標(biāo)化合物的識(shí)別能力彌補(bǔ)了CE無(wú)法定性的問(wèn)題。兩者的配合使用使得基于相互作用所篩選的候選藥物更加有效和準(zhǔn)確。Langmajerova[62]利用毛細(xì)管的層流剖面橫向擴(kuò)散原理,使CE-MS聯(lián)用中的毛細(xì)管兼具酶反應(yīng)器和分離柱兩個(gè)功能。在一次實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞色素P450酶(CYP2C9)與底物的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了定性和定量分析,這種方法可作為新藥開(kāi)發(fā)早期篩選潛在候選藥物的有效工具。Li等[63]首次采用ACE分析方法,利用CE-MS技術(shù)建立了快速篩選并在線測(cè)定結(jié)構(gòu)的方法,成功地在甘草提取物中發(fā)現(xiàn)了兩種與包膜蛋白gp120的核心靶點(diǎn)R15K有顯著相互作用的化學(xué)成分,并在細(xì)胞水平的生物活性實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)了它們抗艾滋病(HIV)的活性。這為在天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)HIV抑制劑提供有利的篩選手段。

2.5 微流控芯片

微流控芯片(microfluidic chip)是將樣品制備、反應(yīng)、分離及檢測(cè)集成于一體的分析裝置,其與CE的結(jié)合使之具備了高通量的優(yōu)勢(shì),這是傳統(tǒng)CE不具備的。微流控芯片自開(kāi)始就在DNA及蛋白質(zhì)領(lǐng)域顯示出極強(qiáng)的功能,目前已被廣泛用于其他化合物的研究。Tokuyama等[64]利用微流控芯片，監(jiān)測(cè)肥大細(xì)胞的組胺釋放過(guò)程,并將其應(yīng)用于抗過(guò)敏藥物的篩選。Wu等[65]開(kāi)發(fā)了一種新型多層微流控裝置,用于表征人肝微粒體中的藥物代謝及細(xì)胞毒性,展示了微流控芯片在藥物開(kāi)發(fā)中進(jìn)行高通量藥物篩選的潛力。

3 結(jié)論與展望

回顧歷史,人們利用CE技術(shù)進(jìn)行藥物篩選的研究已經(jīng)走過(guò)了30年的路程。隨著藥物篩選的需求不斷擴(kuò)大,基于CE的藥物篩選技術(shù)具有潛在的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。但是因?yàn)镃E試樣用量小的特點(diǎn)和餾分收集困難等缺點(diǎn),使之與HPLC相比一路走來(lái)顯得進(jìn)展緩慢,應(yīng)用范圍及效果不盡人意。然而,隨著多種聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,包括聯(lián)用進(jìn)樣技術(shù)、聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)和餾分收集技術(shù)等,CE在藥物篩選中嶄露出新的頭角。更重要的是,CE與其他手段相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),包括篩選環(huán)境更接近于生命介質(zhì)體系、藥物與靶點(diǎn)間的相互作用受外力影響較小、有較多靈活的評(píng)價(jià)與篩選的方法。這使得CE在藥物篩選領(lǐng)域的應(yīng)用潛力不斷增加,目前已出現(xiàn)了許多可以借助CE優(yōu)勢(shì)的藥物篩選探索,例如適配體篩選、中藥等復(fù)雜多組分體系篩選和DNA編碼化合物庫(kù)藥物篩選等。相信利用CE進(jìn)行藥物篩選的良好前景盡在眼前。