宋佳一, 李夢琦, 沈 昊, 周梓昕, 賀雯婷, 蘇 萍, 楊 屹

(北京化工大學化學學院, 北京 100029)

酶廣泛分布于生命體內(nèi),影響著物質代謝和質能轉換等許多生命活動[1]。生物體內(nèi)某些酶的活性變化會導致疾病的發(fā)生,例如,神經(jīng)間隙中乙酰膽堿酯酶活性過高會導致阿爾茨海默癥,α-葡萄糖苷酶的活性升高與糖尿病密切相關,丙酮酸脫氫酶活性缺失會導致乳酸中毒等[2,3]。因此,發(fā)展新型的酶分析方法對酶活性和酶動力學等性能進行研究,對深刻理解生物代謝過程、疾病診斷和藥物研發(fā)具有重要意義。毛細管電泳(CE)具有樣品消耗量少、分析速度快、操作簡便以及可以與多種檢測手段聯(lián)用等優(yōu)點,已經(jīng)發(fā)展成酶分析的重要工具[4]。

采用CE進行酶分析主要包括兩種方式:離線模式和在線模式[5]。離線模式下,酶和底物在管外孵育后,再將酶反應液導入毛細管進行分析,CE僅作為分離工具;在線模式下,毛細管不僅作為分離通道,還作為酶反應場所,從而實現(xiàn)在一根毛細管內(nèi)連續(xù)完成酶反應、分離、檢測的分析步驟。在線模式又發(fā)展出均相分析方法-電泳中介微分析(electrophoretically mediated microanalysis, EMMA)和異相分析方法-固定化酶微反應器(immobilized enzyme microreactor, IMER)[4]。IMER將天然酶固定在毛細管內(nèi),不僅顯著提高了酶穩(wěn)定性和重復使用性,而且可以實現(xiàn)納升規(guī)模溶液的自動化酶分析,進而顯著降低了酶分析成本[6,7]。因此,近年來基于IMER的CE酶分析(CE-IMER)已經(jīng)成為主流的酶分析方法[8]。在CE-IMER酶分析中,如何構建性能良好、可再生使用、酶固載量大、自動化程度高的IMER一直是該領域重點研究的問題。隨著納米技術和材料科學等領域的不斷發(fā)展,各種性能優(yōu)異的新型材料和固定化技術被用于IMER的構建,顯著提高了CE-IMER在各個領域的分析性能[9-11]。本文將從DNA定向固定化技術的特點出發(fā),著重闡述基于DNA定向固定化技術構建IMER,并應用于CE酶分析的現(xiàn)狀和未來發(fā)展。

圖 1 DNA定向固定化流程圖[17]Fig. 1 Schematic representation of DNA-directed immobilization (DDI)[17]

1 DNA定向固定化技術的發(fā)展和特點

20世紀80年代人類基因組計劃的出現(xiàn)促進了DNA微陣列技術的發(fā)展,隨后又衍生出復雜的DNA微陣列,成為當今基礎和應用生物醫(yī)學研究中基因分型和基因組分析的常規(guī)工具[12]。此外,由于DNA分子具有較好的穩(wěn)定性,基于DNA微陣列還實現(xiàn)了多達數(shù)百萬種不同寡核苷酸參與的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)過程[13]。然而,DNA相關技術的應用遠遠超出了基因組學和轉錄組學的應用范圍。20世紀90年代初出現(xiàn)的DNA定向固定化(DNA-directed immobilization, DDI)技術[14]基于DNA微陣列的發(fā)展,通過載體表面DNA的有序排列實現(xiàn)了DNA芯片的研發(fā),為蛋白質和其他非核酸分子的分析開辟了新的途徑[15,16]。DDI利用載體表面結合的單鏈寡核苷酸片段,通過堿基互補配對原則(A-T, C-G),選擇性地結合帶有互補單鏈寡核苷酸標記的蛋白質[16]。通過DNA雜交固定化的過程與蛋白質的表面功能化過程分開進行,因此不會損害蛋白質敏感的三級和四級結構;同時,DDI可以通過簡單變性過程再生DNA表面[17](見圖1)。

近20多年來,DDI相關技術在蛋白質陣列分析、納米材料自組裝以及細胞生物學研究等領域發(fā)揮了重要作用[16]。例如,通過DDI將目標蛋白質固定在載體基質上制備蛋白質陣列,可廣泛應用于檢測小分子[18]、電化學酶分析[19]、蛋白質組學研究[20]以及蛋白質和金屬之間的電子轉移過程研究[21];通過將DDI技術與納米材料相結合,研究者開創(chuàng)性地自組裝金納米粒子,衍生出了一整套用于檢測核酸和蛋白質的生物分析方法[22-24];通過方式多樣的溫和化學方法,短鏈DNA寡核苷酸可以直接與活細胞膜結合,使細胞選擇性地附著在DNA表面,可用于細胞黏附[16,25]等。這些研究均表明DDI具有廣闊的應用前景。

2 DNA定向固定化技術用于IMER的制備與應用

DDI可以充分利用DNA分子的堿基互補配對(A-T, C-G),在溫和的生理條件下特異性固定生物大分子[26]。由于短鏈雙螺旋DNA分子具有較強的機械剛性和物理化學穩(wěn)定性,因此通過DDI將酶固定在載體表面,可以形成酶微陣列,還可以充分暴露酶的活性位點,有利于降低傳質阻力,提高酶與底物的接觸能力[27,28]。另一方面,酶與載體之間的相互作用極易導致酶活性結構的改變,最終導致酶活性損失,因此選擇合適的固定方法和策略對制備高穩(wěn)定性和高活性的固定化酶體系至關重要[29,30]。采用機械強度好的短鏈DNA,通過DDI技術將酶固定在毛細管內(nèi)壁,一方面有望降低酶與毛細管管壁的直接相互作用,提高穩(wěn)定性,另一方面有望提高酶與底物的接觸能力進而提高IMER的催化能力。

圖 2 DNA定向固定化胰蛋白酶IMER流程圖[31]Fig. 2 Schematic of the process for trypsin IMER by DNA direct immobilization[31] APTES: 3-aminopropyltriethoxysilane; PAMAM: poly(amidoamine).

本課題組在利用DDI技術制備IMER方面進行了初步的研究探索工作。Yang等[31]在硅烷化的石英毛細管內(nèi)壁鍵合聚酰胺-胺樹枝狀大分子用于提供大量端氨基,采用戊二醛將單鏈DNA(ssDNA)修飾在毛細管內(nèi)壁,隨后將與ssDNA互補配對的DNA-胰蛋白酶復合物通過DDI技術固定在毛細管內(nèi),制備了離線模式和在線模式的胰蛋白酶IMER(見圖2)。實驗發(fā)現(xiàn),制備的IMER具有較好的穩(wěn)定性和重復使用性,在4 ℃保存30天,仍可以保留70.16%的酶促活性,連續(xù)進行11次酶解反應,考察其重復使用性,RSD值僅為2.91%。通過DNA雜交和去雜交實現(xiàn)DNA-胰蛋白酶復合物在毛細管內(nèi)壁的固定和移除,可以達到ssDNA功能化毛細管基體的多次再利用,顯著降低IMER制備的經(jīng)濟和時間成本,提高了酶分析效率。將制備的胰蛋白酶IMER應用于細胞色素C的酶切,與游離酶相比,在較短的酶切時間內(nèi)展現(xiàn)出較好的酶切效果。

圖 3 DNA定向固定化GOx和HRP雙酶IMER流程圖[32]Fig. 3 Schematic of the process for GOx and HRP IMER by DNA direct immobilization[32]

自然界中存在的大多數(shù)酶促反應體系都需要兩種以上酶的共同參與,因此多酶反應體系的構建更能反映IMER在實際酶分析中的應用潛力。目前大部分基于毛細管柱的IMER局限于單酶固定,在一定程度上限制了其廣泛應用。Yang等[32]通過設計DNA堿基序列,采用兩條互相不配對的ssDNA對毛細管內(nèi)壁進行修飾改性,隨后將與ssDNA互補配對的DNA-葡萄糖氧化酶(GOx)和DNA-辣根過氧化物酶(HRP)復合物通過DDI固定在毛細管內(nèi),制備雙酶IMER(見圖3)。研究表明,制備的毛細管雙酶IMER具有較好的雙酶級聯(lián)酶促活性和突出的底物親和性。利用DDI可控制備酶陣列的優(yōu)勢,通過調節(jié)兩條ssDNA的比例,在毛細管內(nèi)實現(xiàn)GOx和HRP比例的調控,進而實現(xiàn)高效率級聯(lián)反應體系的構建。制備的雙酶IMER同樣通過DNA去雜交實現(xiàn)了DNA-酶的釋放和ssDNA功能化毛細管的再利用。研究表明,制備的雙酶IMER具有較好的穩(wěn)定性和重復使用性,且均優(yōu)于通過非特異性吸附制備的雙酶IMER。將制備的IMER用于葡萄糖的靈敏性分析檢測,展現(xiàn)出較好的酶促分析性能,在生命分析等領域具有廣闊的應用前景。

3 總結與展望

與傳統(tǒng)的吸附、交聯(lián)、封裝和共價連接固定化酶方法相比,DDI可以在溫和的生理條件下進行酶固定化,顯著降低固定化過程對酶活性構象和穩(wěn)定性的影響;同時,DDI的可逆固定化過程可以再生載體表面,顯著降低IMER制備的經(jīng)濟和時間成本。因此,DDI是制備IMER的理想方法。

目前,基于DDI等DNA納米技術制備新型IMER的研究處于起步階段,還有很大的發(fā)展和研究空間。在前期研究基礎上,可以著重發(fā)展以下方面:(1)基于DDI在毛細管內(nèi)分區(qū)域固定目標酶,構建更加高效催化的IMER級聯(lián)反應體系;(2)針對目前IMER制備過程中存在的穩(wěn)定性、酶促活性以及酶固載量有待提高等問題,充分利用DNA的結構和官能團優(yōu)勢,并與納米材料的發(fā)展相結合,制備新型IMER,進一步推進CE-IMER在酶分析中的廣泛應用。