林雪霞, 王晨境, 林金明

(1. 華僑大學(xué)化工學(xué)院, 福建 廈門 361021; 2. 微量分析測試和儀器研制北京重點實驗室, 清華大學(xué)化學(xué)系, 北京 100084)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是一種常見的球形DNA病毒,屬于乳頭瘤病毒科,通過直接或間接接觸方式傳播并感染人體的皮膚與黏膜,從而引起一系列疾病,如宮頸癌、直腸癌、陰莖癌和疣等。目前已知的HPV亞型已經(jīng)超過200種,不同類型的HPV危險程度有所不同。根據(jù)其致癌能力,分為高危型和低危型。高危型HPV(hrHPV)主要包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和70型,平均感染持續(xù)時間大約8個月。低危型HPV(lrHPV)包括HPV6、11、42、43、44型,感染平均持續(xù)時間為4～8個月。HPV感染后,感染者大多沒有臨床表現(xiàn),絕大部分感染會被機體免疫系統(tǒng)自動清除,只有持續(xù)的hrHPV感染才會發(fā)生癌前病變或使感染者患宮頸癌等。因此,可以采用HPV分型檢測的方式區(qū)分持續(xù)(重復(fù))感染、多重感染和一次感染,明確治療方向;可以針對不同分型的感染采取不同的治療方案,有利于受檢者盡快恢復(fù)健康,避免過度治療，也有利于預(yù)測受檢者發(fā)病的風(fēng)險度,確定篩查間隔。

在HPV疾病的診斷過程中,快速、可靠和準(zhǔn)確的樣品分析是患者、醫(yī)生以及檢測人員的要求和目標(biāo)。然而,由于大多數(shù)樣品都很復(fù)雜,在對樣品分析之前,分析工作者需要完成對樣品的充分處理和分離等一系列操作,步驟煩瑣。因此,在實際診斷分析中很難同時實現(xiàn)快速而可靠的檢測。分離是提高分析速度的一個難點,也是分析信息的關(guān)鍵。微流控芯片(microfluidic chip)又稱微全分析系統(tǒng)或芯片實驗室,其能夠在一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上高度集成化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元,獲得了人們的極大關(guān)注,并得到快速發(fā)展。微流控芯片技術(shù)的進步也促進了芯片毛細管電泳(microchip capillary electrophoresis, MCE)技術(shù)的誕生和發(fā)展。MCE是一種將傳統(tǒng)毛細管電泳與微機電加工技術(shù)相結(jié)合,然后集成在一個芯片上的分離技術(shù)。在HPV的檢測中,MCE主要是利用玻璃、石英或各種聚合物材料加工成微米級通道,以高壓直流電場為驅(qū)動力,利用分離緩沖液的篩分效應(yīng),根據(jù)DNA/RNA分子的大小進行HPV核酸快速分離檢測。與傳統(tǒng)的凝膠電泳以及毛細管電泳相比,MCE具有高度集成以及自動化的優(yōu)點,可以將檢測時間縮短到幾分鐘,在分析速度方面具有顯著優(yōu)勢。本文主要分為兩部分進行綜述:(1)MCE系統(tǒng)和芯片的設(shè)計制作;(2)MCE在HPV核酸檢測中的應(yīng)用。

1 芯片毛細管電泳

MCE是在制作好的芯片通道中進行物質(zhì)的分離。它的分離原理與毛細管電泳類似,在電場的作用下,由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等差異,分子產(chǎn)生不同的遷移速度,經(jīng)過一定時間后,根據(jù)移動距離不同而達到分離的效果。芯片通道的設(shè)計和電場的應(yīng)用不僅可以實現(xiàn)樣品的快速、高效分離,還可用于對樣品進行前處理,比如樣品的純化和富集。HPV核酸的檢測也從傳統(tǒng)的PCR凝膠電泳分析向PCR-MCE轉(zhuǎn)化,極大地提高了HPV的檢測速度,節(jié)省了大量的勞動力。

圖 1 芯片毛細管電泳用于人乳頭瘤病毒DNA/mRNA的檢測Fig. 1 Human papillomavirus (HPV) DNA/mRNA detection based on the microchip capillary electrophoresis (MCE) a. composition of the MCE system; b. schematic diagram of the MCE chip commonly used; c. test result report by MCE. S, SW, B and BW indicated sample solution, sample waste, buffer and buffer waste, respectively.

1.1 MCE系統(tǒng)

典型MCE裝置的核心單元包含微流控進樣通道、分離通道、檢測單元和電源供應(yīng)等(見圖1a)。芯片電泳系統(tǒng)主要由高壓電源、芯片、電解液池、進樣系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)等構(gòu)成。如圖1b所示,MCE芯片的微通道結(jié)構(gòu)一般包含了樣品流動的微通道、樣品和緩沖液儲存池、分離緩沖液或者凝膠等。高壓電源是組成芯片電泳裝置的重要設(shè)備,是樣品在溶液中遷移的動力來源。目前常用的進樣系統(tǒng)為電動或者動液壓進樣系統(tǒng)。不同的進樣方式需要的通道結(jié)構(gòu)也不同。電動進樣操作簡單，并適用于大多數(shù)微通道設(shè)計,因此是MCE的首選進樣方式。在電動進樣模式下,樣品的進樣量主要取決通道交叉口的體積。動液壓進樣是通過樣品和樣品廢水池的液位差,或者施加壓力或抽真空來完成的。這種進樣方式是通過輔助設(shè)備(如泵或移液管)實現(xiàn)樣品進樣。因此,這種進樣方式目前使用較少。新的動液壓進樣注射常通過噴墨和陣列技術(shù)控制液滴注射[1,2]。這種液滴注射法不僅能夠進行高通量進樣,而且能精確地控制體積為nL到pL的樣品進樣。此外,目前商品化MCE儀器中檢測器主要以紫外-可見光檢測器和激光誘導(dǎo)熒光檢測器為主,也發(fā)展了發(fā)光二極管熒光檢測器、電化學(xué)檢測器等多種其他檢測器,能夠獲得如圖1c所示的色譜分離圖。同時,為了獲得足夠的光信號,常常使用光電倍增管(PMT)或電荷耦合器件(CCD),提高檢測靈敏度。

常見制作MCE芯片的材料包括玻璃、陶瓷和各種聚合物。其中聚合物包含聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate, PMMA)、環(huán)烯烴共聚物、聚苯乙烯和聚碳酸酯等。通過光刻法制作的PDMS芯片由于價格低廉、光學(xué)透明、無毒、制作相對簡單的優(yōu)點而被廣泛使用。然而,PDMS具有一定的疏水性,能夠在通道表面吸附疏水性物質(zhì),并且不容易控制電滲流,從而降低了芯片的分離效果。因此,一部分研究者一直致力于PDMS芯片表面的修飾。除了PDMS外,另一種常用的聚合物是PMMA,它主要是通過熱壓成型的方式來制作芯片。這種通過熱壓形成的PMMA芯片能夠?qū)崿F(xiàn)MCE芯片的快速、大規(guī)模生產(chǎn)。近年來,紙基芯片以及纖維芯片由于結(jié)構(gòu)相對簡單和制造成本低廉等優(yōu)勢越來越受到人們的關(guān)注。與此同時,芯片的制作技術(shù)也快速發(fā)展起來。噴墨法、繪圖法、等離子體法以及激光打印等一些其他制作工藝雖然沒有達到光刻的精度和分辨率,但是這些工藝的制作程序具有簡單、成本低的優(yōu)點。盡管大規(guī)模芯片制作方法在一定程度上降低了生產(chǎn)成本,但是芯片電極的加入?yún)s大大提高了MCE器件的成本。Henderson等[3]通過激光焊接技術(shù)在聚苯胺導(dǎo)電膜上制備了一種用于電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(capacitively coupled contactless conductivity detection, C4D)的電極。然后在PMMA基底上涂覆C4D電極涂層。最后將PMMA基底與帶有微通道的PDMS芯片鍵合，得到MCE芯片,極大地降低了芯片制造成本。Tang等[4]通過微接觸電化學(xué)蝕刻技術(shù),可以在不到2 min的時間內(nèi)完成MCE芯片的制作。盡管如此,玻璃仍然是MCE芯片制作最常用的理想基質(zhì)。Donora等[5]通過濕法刻蝕和激光雕刻燒蝕制作玻璃MCE芯片。這些芯片的分離效率明顯低于光刻蝕制作的芯片。與此同時,使用玻璃芯片的商品化MCE系統(tǒng)也發(fā)展起來,如島津公司MutiNA MCE、安捷倫公司2100生物分析儀、Perkin Elmer公司LabChip?分離系統(tǒng)和Bio Rad公司ExperionTM自動電泳系統(tǒng)。

1.2 MCE芯片結(jié)構(gòu)

MCE芯片結(jié)構(gòu)的設(shè)計,最初是一條直微通道作為分離通道,后來出現(xiàn)了多種不同的通道設(shè)計。經(jīng)典的MCE芯片設(shè)計包括兩條交叉通道及4個緩沖池(樣品池、廢液池、陽極池和陰極池,見圖2a)。T型微通道可以進行樣品富集,是MCE最常用的結(jié)構(gòu)(見圖2b)。商品化的島津MCE-202 MultiNA芯片就是采用這種通道[6]。它包含1個樣品槽、1個試劑和緩沖液入口槽、2個廢液槽。為了能夠開展多個樣品分析,系統(tǒng)可以允許同時使用4個芯片。為了能夠更好地進行復(fù)雜樣品的研究,實現(xiàn)復(fù)雜樣品的高度分離,Bottenus等[7]和Zhuang等[8]設(shè)計了蛇形通道來增加分離通道的長度,從而提高了樣品分離效果(見圖2c)。除此之外,還有雙T型、十字型以及其他類型的芯片(見圖2d和圖2e)[9,10]。雙T型芯片通道的設(shè)計,使樣品可以在MCE芯片中連續(xù)流動,從而實現(xiàn)對樣品的連續(xù)分析。同步循環(huán)MCE芯片的設(shè)計能夠使分子通過環(huán)形通道延長遷移距離,獲得更好的分離度[11]。

圖 2 4種常見芯片通道的示意圖Fig. 2 Schematic diagrams of four common chip channels a. straight channel; b. T channel; c. serpentine channel; d. dual channel; e. double channels.

此外,通過對MCE芯片通道的設(shè)計,能夠?qū)悠返那疤幚砑稍谝粡埿酒稀umar等[12]在MCE芯片上集成了固相萃取裝置。他們將聚合物溶液填充在芯片通道中,并通過原位光聚合制備芯片內(nèi)的固相萃取柱。制作的固相萃取柱不僅能夠進行目標(biāo)物的萃取,還能將目標(biāo)物的濃度富集高達80倍。對于核酸檢測,Ma等[13]在MCE芯片上集成等溫擴增單元,開展高靈敏檢測的研究。Liu等[14]在芯片上集成PCR單元,然后通過MCE分離進行phiX174噬菌體序列和大腸桿菌PCR產(chǎn)物的高靈敏檢測。通過這種方法能夠?qū)崿F(xiàn)50拷貝DNA的樣品分析,而且整個樣品處理過程和樣品分析過程在45 min內(nèi)完成。通過對芯片結(jié)構(gòu)的設(shè)計和電極的應(yīng)用,在MCE芯片上集成不同樣品處理功能,不僅能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏、快速的樣品分析,而且易于自動化和微型化,減少試劑使用量和降低成本。

1.3 芯片電泳分離方式

樣品的電泳分離是通過在通道上施加電場來實現(xiàn)的。電場的施加將促進帶電分子的遷移。在MCE中,最常用的電泳方式是區(qū)帶電泳、凝膠電泳和介電泳。

在區(qū)帶電泳中,帶電物質(zhì)在電場作用下在背景溶液中遷移,并根據(jù)電泳遷移率的不同實現(xiàn)分離。待測物質(zhì)除了受到電場作用之外,還受到溶質(zhì)顆粒與固相載體吸附作用的影響。區(qū)帶電泳在藥物、代謝產(chǎn)物等小分子的分離方面有著廣泛的應(yīng)用。

介電泳,也稱雙向電泳,是介電常數(shù)較低的物體在非勻強電場中受力的現(xiàn)象,常用于顆粒和細胞的分離。Sun等[15]通過自組裝離子液體電極和介電泳技術(shù)將聚苯乙烯微球和PC-3細胞分離。

凝膠電泳技術(shù)發(fā)展歷史悠久。在凝膠電泳中,電場的施加是沿著篩分基質(zhì)進行的。電泳中使用了無反應(yīng)活性的篩分基質(zhì),如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺膠等,從而提高了分析物的分離效果。同時,電泳的遷移率同分子的大小、極性及介質(zhì)黏度、凝膠形狀的差異和分子所帶的凈電荷密切相關(guān)。隨著凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展,近年來基于凝膠電泳的微芯片裝置也逐步發(fā)展應(yīng)用。分離速度從原來的幾個小時縮短到10 min以內(nèi)。Lin等[6,16]通過使用商品化的島津MultiNA MCE分析儀開展了多種蛋白質(zhì)的分析和核酸分析。在核酸分析中,Lin等[6,16]針對經(jīng)過PCR擴增后的短串聯(lián)片段和白血病相關(guān)的BCR-ABL片段進行基于MCE的凝膠電泳分析,均可以在90 s內(nèi)完成分析。在多種蛋白質(zhì)的檢測中,主要是結(jié)合功能適配體調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子的大小和改變凈電荷的數(shù)目進行多種蛋白質(zhì)快速高靈敏的檢測[17]。隨著MCE的發(fā)展,各種不同的MCE分離技術(shù)被進一步開發(fā)和利用。Wang等[18]將MCE與適配體技術(shù)相結(jié)合,對牛奶中的抗生素實現(xiàn)了快速高靈敏的檢測。Qin等[19]將MCE和熒光信號放大技術(shù)相結(jié)合,用于人血漿中γ干擾素(IFN-γ)的高靈敏檢測。

2 MCE在HPV檢測中的應(yīng)用

HPV是一種DNA病毒,感染人類表皮及黏膜組織,目前約有200種類型的HPV被鑒別出來。流行病學(xué)研究已經(jīng)證實,HPV病毒持續(xù)感染是引發(fā)癌變的主要原因。其中,16型(HPV16)和18型(HPV18)是世界范圍內(nèi)感染率最高的亞型。目前,HPV的商業(yè)化檢測方法主要包括德國Qiagen公司生產(chǎn)的雜交捕獲Ⅱ代 (HC2) 檢測法和瑞士Roche 公司建立的酶切信號放大法(LA法)等。其中,HC2檢測是HPV檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。然而這兩種方法受到核酸探針的影響,成本較高,難以被大量推廣使用。此外,HPV分型檢測常用的方法還有細胞學(xué)檢查、PCR、實時熒光定量PCR、印跡雜交法等技術(shù)。細胞學(xué)檢查靈敏度低,觀察范圍有限,在病毒感染早期往往難發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)假陰性的概率較高?；趥鹘y(tǒng)PCR的HPV分型檢測和PCR產(chǎn)物常用瓊脂糖凝膠電泳檢測,耗時較長,操作也比較復(fù)雜。而MCE能夠在幾分鐘內(nèi)完成PCR產(chǎn)物鑒定,極大地降低了分析時間。本文主要介紹核酸擴增技術(shù)和MCE技術(shù)用于HPV分型的檢查方法,其中包括PCR和MCE結(jié)合用于HPV的檢測技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)的HPV檢測方法、基于PCR結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)技術(shù)用于HPV分型的DNA檢測、基于核酸序列擴增(nucleic acid sequence based amplification, NASBA)技術(shù)檢測HPV mRNA等。

2.1 PCR-MCE檢測的HPV分型

HPV分型的檢測經(jīng)歷了很長的發(fā)展階段。由于存在許多不同的HPV亞型,近20多年來,HPV的檢測主要是利用PCR技術(shù)開發(fā)出在一次實驗中檢測多種不同HPV亞型的檢測方法。這些檢測方法主要是在衣殼蛋白晚期轉(zhuǎn)錄期L1或早期轉(zhuǎn)錄期E1開放讀碼框中,通過選擇針對HPV基因組的高度保留序列的通用型引物來實現(xiàn)這一目的。最早的通用型PCR實驗是IU/IWD0、MY09/11和GP5/6-PCR體系(PGMY體系),擴增出包含450個或150個堿基對的目標(biāo)物。在此基礎(chǔ)上,建立了基于PGMY引物的第二代HPV的PCR檢測技術(shù)。近些年,出現(xiàn)了許多新的PCR HPV分型檢測技術(shù),包括把病毒的L1或E1區(qū)域內(nèi)其他保存區(qū)域作為目標(biāo)。針對不同HPV分型,以不同病毒區(qū)域為目標(biāo),研究者也開發(fā)了多種不同引物。然而,大多數(shù)HPV分型的PCR產(chǎn)物均通過凝膠電泳進行分析,只有極少量的HPV PCR產(chǎn)物通過MCE進行檢測分析。

圖 3 PCR-MCE用于HPV分型檢測Fig. 3 Detection of HPV types by PCR-MCE a. DNA extraction and PCR assay; b. HPV analysis based on MCE; c. simultaneous detection of HPV16 and HPV18. PCR: polymerase chain reaction.

基于PCR的HPV分型檢測方法多有報道。然而,利用GP5+/GP6+通用引物對目標(biāo)物進行擴增,往往需要進一步利用分型探針與PCR產(chǎn)物雜交,才能夠得到準(zhǔn)確的HPV分型[20-22]。目前HPV分型的探針并不能完全覆蓋HPV的所有分型。傳統(tǒng)的HPV分型檢測中,由于受到探針的影響,HPV檢測只能檢查出已知的HPV分型,不能達到預(yù)測其致病程度的作用,方法的使用也受到限制。為了避免受到探針的限制,一些研究者[23,24]通過MCE檢測HPV PCR產(chǎn)物的大小,進行HPV16和HPV18分型的鑒定(見圖3)。為了能夠獲得準(zhǔn)確的PCR產(chǎn)物大小,在MCE檢測中使用2%羥乙基纖維素為篩分介質(zhì),Tris-硼酸(TBE)為緩沖液,通過在線混合方式對HPV PCR產(chǎn)物進行熒光檢測。同時,為了提高分析的準(zhǔn)確度,以低片段和高片段DNA標(biāo)志物為內(nèi)標(biāo)物進行擴增片段大小的校正。與傳統(tǒng)的HPV分型檢測相比,此方法不需要檢測探針就可以實現(xiàn)HPV16和HPV18分型的檢測。同時,MCE技術(shù)在HPV分型檢測中的應(yīng)用極大地簡化了操作步驟,也縮短了分析時間,檢測靈敏度也比傳統(tǒng)染色方法高出10倍以上,檢測樣品所需的緩沖液及樣品量很少,大大降低了HPV檢測的成本。與細胞學(xué)檢查相比,此方法大大提高了檢測靈敏度,降低了檢測成本,有助于HPV相關(guān)癌癥的早期篩查,降低檢測的假陰性概率,具有實際應(yīng)用價值。在前期實驗的基礎(chǔ)上,林金明等[23]又提出了一種能夠同時檢測HPV16和HPV18,并且能夠有效區(qū)分兩種高危型HPV亞型的MCE檢測方法。該方法已成功應(yīng)用于HPV的檢測,測序結(jié)果顯示了良好的可靠性。鑒于全球?qū)D女健康認識的不斷提高,以及最近推出的宮頸癌疫苗,對于HPV的檢測將成為科研人員未來更加關(guān)注的研究方向。為了進一步提高HPV檢測的靈敏度,Fan等[24]還提出了一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)的HPV檢測方法。該方法采用可視化方法,通過肉眼對HPV16和HPV18進行鑒別,無須昂貴的專用儀器。實驗結(jié)果表明,該方法具有良好的可靠性,與細胞學(xué)方法相比,假陰性率降低。相比之下,目測LAMP法的結(jié)果與PCR MCE法的結(jié)果一致,表明目測LAMP法可成功用于檢測兩種高危型HPV。因此,這種操作簡便、結(jié)果可以直接通過肉眼判斷的LAMP檢測方法可以用于宮頸癌的現(xiàn)場檢測。由于減少了對儀器的依賴,這種方法更有利于偏遠地區(qū)HPV的普查。

2.2 RFLP-MCE自動分型法用于HPV分型篩查

圖 4 PCR-RFLP-MCE自動HPV分型檢測示意圖[26]Fig. 4 Schematic diagram of PCR-RFLP-MCE for automatic detection of HPV[26] a. PGMY09/11 primes for the amplification of the potential multiple HPV DNAs; b. DNA analysis on MCE; c. the sites of different restriction endonucleases and the sizes of RFLP; d. automatic typing software for RFLP fragments. RFLP: restriction fragment length polymorphism.

基于PCR的HPV檢測方法雖然靈敏度高,但需要特異性的探針,成本相對昂貴,且只能檢測出已知分型,無法滿足實際需要。其中,采用常規(guī)PCR-MCE方法對HPV分型進行檢測,只能利用PCR引物和MCE檢測到PCR產(chǎn)物的大小,初步判斷HPV分型,無法進行精準(zhǔn)判斷。因此,為了實現(xiàn)自動化快速HPV分型的篩查,近年來,發(fā)展了PCR-RFLP技術(shù)用于HPV分型的檢測。RFLP技術(shù)是通過將PCR產(chǎn)物酶切成不同長度的DNA片段,然后通過篩分介質(zhì)或凝膠電泳分離進行片段大小的分離。Tawe等[25]通過PCR-RFLP開展宮頸癌中HPV分型檢測。然而,這種RFLP常常只使用一種酶進行少量HPV分型的酶切,無法對多種HPV分型進行篩查。為了能夠?qū)崿F(xiàn)多種分型的篩查,Yi等[26]利用多種酶對HPV的PCR擴增產(chǎn)物進行酶切(見圖4),然后利用MCE分離得到HPV分型的指紋特征,再利用開發(fā)的HPV分型軟件,能夠一次實現(xiàn)47種HPV分型的識別。其中,多種酶和HPV指紋特征的應(yīng)用,極大地提高了HPV分型檢測的準(zhǔn)確度,降低了假陰性和假陽性概率。相比于傳統(tǒng)的PCR檢測技術(shù)和PCR-MCE檢測,PCR-RFLP-MCE的方法不僅可以檢測出已知HPV分型,還可以通過指紋特征檢查出未知的HPV分型。這種方法不需要特異性探針,可以進行在線熒光標(biāo)記,具有更高的自動化性能。此外,自動化分型分析軟件的開發(fā)不僅節(jié)省了分析時間,而且減小了主觀誤差率,克服了傳統(tǒng)HPV分型分析煩瑣操作的缺點,為HPV分型的全自動化檢測奠定了基礎(chǔ)。Yi等[26]將PCR-RFLP-MCE自動分型法獲得的結(jié)果與細胞學(xué)檢查和DNA測序方法對比,結(jié)果顯示陽性檢出率是傳統(tǒng)的細胞形態(tài)學(xué)檢查的4倍,檢測出單一感染占2/3,分型準(zhǔn)確度大于90%。證明了PCR-RFLP-MCE自動分型方法的優(yōu)越性以及用于輔助宮頸癌早期診斷HPV篩查的可能性。

2.3 MCE用于HPV病毒mRNA的檢測

對于HPV感染相關(guān)疾病的分子生物學(xué)檢測,最直接的方法莫過于直接對PCR產(chǎn)物進行測序。這樣不僅能進行HPV分型的確認,還可以發(fā)現(xiàn)新的亞型。該方法對測序樣品的純度要求高,一般的PCR擴增體系成分復(fù)雜,容易導(dǎo)致測序有誤。充分利用酶切技術(shù),根據(jù)不同類型HPV DNA特定內(nèi)切酶的酶切片段長度的不同,也可實現(xiàn)HPV的篩査和分型。但多種酶的使用容易產(chǎn)生大量的DNA短片段,使HPV分型難以確定。此外,有研究表明基于PCR的HPV DNA檢測無法識別轉(zhuǎn)錄活性病毒,是引起假陰性的一個重要原因。據(jù)報道[27],有14% HPV DNA檢測陽性的口咽和舌根鱗狀細胞癌在hrHPV E6/E7 mRNA的檢測中表達為陰性和低的HPV DNA病毒載量。因此,HPV的DNA檢測只可作為“旁觀者”檢測分型。PCR檢測的結(jié)果用于HPV分型的鑒定受到了一定的質(zhì)疑。mRNA的轉(zhuǎn)錄水平能夠相對準(zhǔn)確地反映出細胞內(nèi)癌蛋白的表達。因此,檢測編碼癌蛋白的mRNA可作為蛋白質(zhì)直接檢測的方法。有研究表明,在高級別的宮頸病變中,宮頸刮片中利用E6/E7 mRNA的陽性檢出率高于HPV DNA的檢出率,其主要原因可能是因為HPV mRNA的表達水平能夠更好地體現(xiàn)具有細胞轉(zhuǎn)化潛能的HPV激活感染程度,而HPV DNA的篩査容易受到臨床無關(guān)條件的影響[28]。

各種各樣的HPV E6/E7 mRNA檢測方法逐漸發(fā)展起來,包含了原位熒光雜交技術(shù)和自取樣技術(shù)的HPV mRNA分析[29-31]。其中,HPV mRNA的高靈敏檢測主要通過擴增技術(shù)進行檢測,如利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)以及后來發(fā)展的依賴核酸序列擴增(NASBA)技術(shù)對HPV mRNA目標(biāo)片段進行擴增[32]。

圖 5 NASBA用于HPV E6/E7 mRNA的擴增Fig. 5 Amplification of HPV E6/E7 mRNA based on nucleic acid sequence based amplification (NASBA)

圖 6 NASBA-MCE用于HPV16、18型的E6/E7 mRNA的檢測Fig. 6 Detection of E6/E7 mRNA of HPV16 and HPV18 by NASBA-MCE

在這兩種擴增技術(shù)中,RT-PCR是一種發(fā)展成熟的RNA擴增方法,擴增的過程需要借助溫度循環(huán)裝置來保證目標(biāo)片段的選擇性擴增。NASBA是一種等溫擴增技術(shù),擴增過程中所需的溫度變化較少,不需要復(fù)雜的變溫過程(見圖5)。然而NASBA的擴增過程以RNA作為對象,對實驗條件和實驗環(huán)境要求嚴(yán)格。Liu等[33]分別對HPV16、18型的E6/E7 mRNA的3種常用擴增方法(NASBA、一步法RT-PCR和兩步法RT-PCR)進行了比較,發(fā)現(xiàn)盡管NASBA-MCE(見圖6)操作簡單,具有較好的靈敏度和特異性,但該方法的重現(xiàn)性不夠理想。此外,一步法RT-PCR操作相對簡單,但引物的特異性不高,導(dǎo)致非特異性擴增現(xiàn)象嚴(yán)重。采用降落(Touch Down)的一步法RT-PCR用于HPV mRNA的擴增,通過MCE分析,發(fā)現(xiàn)利用Touch Down的RT-PCR能夠較大地提高方法的靈敏度,但是非特異性擴增并沒有得到明顯改善,非特異性擴增仍然嚴(yán)重。利用MCE比較3種不同擴增方法的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物的MCE遷移時間明顯受到一步法RT-PCR和NASBA擴增體系的影響。但是兩步法RT-PCR擴增產(chǎn)物的MCE遷移時間并不受體系影響,也較少受到樣品基質(zhì)的影響。因此,兩步法RT-PCR-MCE非常有利于實際樣品的HPV mRNA檢測。Liu等[33]推測這可能是因為兩步法RT-PCR降低了非特異性擴增,從而改善了分析的穩(wěn)定性。將3種HPV16和18型E6/E7 mRNA結(jié)果相比,還發(fā)現(xiàn),兩步法RT-PCR-MCE具有更高的靈敏度和特異性,能夠進行更準(zhǔn)確的半定量分析[33]。

2.4 其他HPV檢測方法

HPV的檢測在宮頸癌、直腸癌、陰莖癌等疾病早期篩查中扮演著重要角色,很大程度上提高了癌前病變的檢出效果。隨著人們對HPV和相關(guān)癌癥病變關(guān)系的深入了解,HPV-DNA/RNA檢測在癌癥病變?nèi)鐚m頸病變預(yù)防、篩查、診治及隨訪檢測中的作用日益顯現(xiàn),也由最初的細胞學(xué)檢查發(fā)展了多種不同的檢測技術(shù),除了MCE外,還包含了傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)[34]、電化學(xué)法[35,36]、電化學(xué)發(fā)光檢測法[37]、比色法[38]等,具體見表1。Viana等[34]通過PCR進行HPV DNA目標(biāo)片段的擴增后,通過FI-IR技術(shù)進行HPV分子的識別和檢測。Mahmoodi等[35]為了提高HPV DNA檢測的靈敏度,以HPV 18 DNA為檢測對象,將還原氧化石墨烯和多壁碳納米管沉積在絲網(wǎng)印刷碳上的電極上,進一步將金納米粒子沉積到改性的電極上,再將單鏈DNA捕獲探針通過金-巰基鍵合到電極上,最后通過脈沖伏安法實現(xiàn)了HPV18 DNA的高靈敏檢測。Avelino等[36]則利用含金納米粒子的聚苯胺膜結(jié)合阻抗分析技術(shù)實現(xiàn)了多種HPV DNA的檢測。此外,Nie等[37]利用鋅摻雜的二硫化鉬量子點和亞銅粒子氧化還原羥基形成水,結(jié)合T7外切酶,成功建立了HPV16 DNA的電化學(xué)發(fā)光檢測方法。Mukama等[39]通過LAMP技術(shù)對HPV16和HPV18的目的片段進行擴增后,利用CRISPR/Cas12a的分裂和側(cè)流生物傳感器實現(xiàn)了超高靈敏的檢測。比色法由于無需專門儀器、檢測方法簡便而被廣泛使用。在HPV檢測中為了能夠?qū)崿F(xiàn)簡便分析,Fan等[24]不僅利用環(huán)介導(dǎo)擴增技術(shù),還結(jié)合甜菜堿、氯化錳和鈣黃綠素實現(xiàn)了可視化檢測。HPV mRNA檢測大部分是基于原位雜交的檢測方法[40,41]以及部分基于DNA酶的比色法[38]。

表 1 信號放大技術(shù)與除MCE外的其他檢測方法用于HPV檢測

3 MCE在HPV檢測的挑戰(zhàn)與展望

近年來,將微流控芯片技術(shù)和電泳技術(shù)完美地結(jié)合在一起的MCE已成為當(dāng)今臨床疾病檢測的一個相對成熟的分析技術(shù)。MCE的快速發(fā)展為生物標(biāo)志物的研究提供了有力的解決方案和方法。一些課題組[42-44]將PCR裝置器件和MCE器件集成在一個芯片上,并開展了短串聯(lián)重復(fù)序列測定和原位病原體診斷研究工作。然而,高集成的MCE在HPV分析檢測中仍存在一些挑戰(zhàn)。首先,雖然MCE裝置可以很好地進行HPV的分離檢測,但目前的MCE技術(shù)本身卻無法實現(xiàn)HPV的高靈敏和高選擇性檢測。其次,即使有部分研究者成功地將PCR和MCE集成在一個芯片上,但是在HPV檢測方面仍然沒有集成化的PCR-MCE芯片。由于每一種目標(biāo)物擴增時所需要的溫度不同,微小的溫度差異可能會帶來完全不同的結(jié)果。因此,無法將已經(jīng)開發(fā)的PCR-MCE芯片直接用于HPV分型的檢測。MCE芯片技術(shù)的另一個瓶頸是微型化、自動化MCE器件的研制。微型化器件的制造常常需要專業(yè)的多學(xué)科團隊的合作和一系列復(fù)雜加工的制造工藝。因此,MCE器件仍然無法實現(xiàn)大規(guī)模低成本生產(chǎn)。雖然MCE在HPV的檢測以及其他生物標(biāo)志物的檢測方面仍存在著重重挑戰(zhàn)。但是我們相信，未來MCE將向微型化、高集成化以及自動化方向發(fā)展。此外,由于個性化診斷和現(xiàn)場檢測技術(shù)的發(fā)展,我們相信MCE技術(shù)在將來能夠?qū)崿F(xiàn)對HPV實時快速的現(xiàn)場檢測,也能夠發(fā)展出低成本、簡單、高通量的便攜式現(xiàn)場診斷技術(shù)甚至是穿戴式的HPV檢測技術(shù)。

4 結(jié)論

MCE技術(shù)是一種快速、實時、可實現(xiàn)復(fù)雜物質(zhì)現(xiàn)場分析的強有力技術(shù)。因此,越來越多的研究者們致力于MCE技術(shù)的集成化、微型化、自動化和高通量研究。首先,隨著MCE技術(shù)的逐漸成熟,用于HPV自動化檢測的標(biāo)準(zhǔn)化MCE芯片和平臺將逐步實現(xiàn)。其次,各種不同的高選擇性HPV探針和高靈敏的檢測方法將再次發(fā)展并得到進一步的推廣和應(yīng)用。最后,人們不僅能夠?qū)CR平臺集成在MCE芯片上,未來還將集成更多的功能,如樣品前處理中的萃取濃縮等技術(shù)。此外,高通量的MCE HPV檢測技術(shù)在未來將得到人們越來越多的關(guān)注。因此,雖然目前MCE在HPV分型檢測中仍然不成熟,存在著一些挑戰(zhàn),但在未來,MCE將繼續(xù)得到發(fā)展和應(yīng)用。