許 旭, 陳 鋼, 劉 浩

(1. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué), 上海 201418; 2. 上海市食品藥品檢驗所, 上海 201203; 3. 國家藥監(jiān)局治療類單抗質(zhì)量控制重點實驗室, 上海 201203)

藥物分析是毛細(xì)管電泳(CE)的重要應(yīng)用領(lǐng)域,持續(xù)提供著許多不同類型和有實際研究價值的研究需求,也不斷將CE的研究成果應(yīng)用到藥物研發(fā)、生產(chǎn)以及臨床應(yīng)用與評價等各環(huán)節(jié)。CE用于藥物分析的研究文獻(xiàn)較多,本文從藥品分析領(lǐng)域中的化學(xué)藥物、中藥、生物制品,以及體內(nèi)藥物分析幾個方面綜述了近幾年毛細(xì)管電泳在這些傳統(tǒng)藥物分析中應(yīng)用的研究進(jìn)展。對于現(xiàn)代藥物分析研究比較活躍的理化常數(shù)測定、親和毛細(xì)管電泳與結(jié)合常數(shù)研究(包括藥物與受體間的相互作用等)、臨床分析生物標(biāo)志物、代謝組學(xué),以及微流控芯片CE分析等方面的研究,文獻(xiàn)內(nèi)容較多,本文限于篇幅未做討論。本文主要涉及2017年1月至2020年2月近3年的文獻(xiàn)，也包括一些2016年的文獻(xiàn)和之前的少量相關(guān)文獻(xiàn)。在概述這段時期CE在傳統(tǒng)藥物分析領(lǐng)域新進(jìn)展的同時,本文討論了目前這些傳統(tǒng)藥物分析領(lǐng)域的需求,以及CE在其中的地位、挑戰(zhàn)和機遇。

Deeb等[1]在對2013～2015年CE在藥物分析中的應(yīng)用研究評述中,提到不少傳統(tǒng)藥物分析領(lǐng)域的技術(shù)需求,包括人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)對藥物分析方法的要求,以及進(jìn)樣方法和檢測靈敏度等常見CE方法問題。屈鋒實驗室[2-5]近3年以及之前的毛細(xì)管電泳年度綜述均包括藥物分析的內(nèi)容。Kristoff等[6]總結(jié)了CE在蛋白質(zhì)、藥物、糖基化分析,以及外泌體與病毒分析等生物分析方面的重要進(jìn)展。Voeten等[7]發(fā)表在AnalyticalChemistry的年度綜述總結(jié)了CE在2015年9月至2017年9月的研究進(jìn)展。近期有關(guān)CE-MS的研究引起了人們的關(guān)注,Stolz等[8]綜述了CE-MS的研究進(jìn)展,包括在單克隆抗體與藥物的應(yīng)用。周韋等[9]綜述了CE-MS在藥物和生物制品分析中的應(yīng)用。本文從小分子藥物及其有關(guān)物質(zhì)、手性分離、中藥與天然產(chǎn)物、體內(nèi)藥物分析、大分子與生物制品分析幾個方面具體討論近幾年CE在這些傳統(tǒng)藥物分析中應(yīng)用的研究進(jìn)展。

1 小分子藥物及其有關(guān)物質(zhì)

1.1 法規(guī)需求

小分子藥物的分析越來越關(guān)注到ICH的方法要求。Deeb等[1]在評述時關(guān)注到ICH Q8指南中“質(zhì)量源于設(shè)計”(quality by design, QbD)的策略對藥物分析方法建立的要求。戴勝云等[10]綜述了QbD在藥物分析方法開發(fā)中的應(yīng)用研究進(jìn)展。QbD要面向需求,通過系統(tǒng)化、結(jié)構(gòu)化、層層遞進(jìn)的方式建立分析方法。Pasquini等[11]基于QbD原理,使用γ-環(huán)糊精-正丁醇-膽酸鈉-硼酸鹽分離緩沖液,建立了毛細(xì)管膠束電動色譜(MEKC)快速測定卡托普利、氫氯噻嗪及其有關(guān)物質(zhì)的方法。

中國藥典四部(2015版)在通則9101“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則”中規(guī)定[12]:精密度可接受范圍與樣品中待測定成分含量有關(guān),待測定成分含量在1%以上時重復(fù)性(RSD)要求低于2%,而CE直接定量的重復(fù)性(RSD)多在3%左右。雖然不少文獻(xiàn)中日內(nèi)RSD小于2%,但推廣應(yīng)用時常常達(dá)不到要求。因此,對多數(shù)含量高于1%的藥品主成分,CE方法需要改進(jìn)重復(fù)性問題。郭懷忠等[13]曾經(jīng)在2005年系統(tǒng)討論過影響毛細(xì)管電泳分析結(jié)果重現(xiàn)性的因素及其控制途徑,至今仍然有很好的參考價值。改進(jìn)精密度的常見方法是內(nèi)標(biāo)法。Lago等[14]以呋喃苯胺酸為內(nèi)標(biāo),建立了測定替帕那韋(tipranavir)膠囊的毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CZE)，方法精密度<2%,將該法用于藥品在酸性、堿性、熱性、光解性和氧化性條件下的穩(wěn)定性評價,顯示氧化為主要降解途徑。Guichard等[15]建立了兩種CE方法用于內(nèi)標(biāo)法定量分析注射劑中的16種抗腫瘤藥物。一種是使用含50%乙腈的分離緩沖液建立的CZE方法，用于分析阿霉素、表阿霉素、伊達(dá)比星、道諾霉素、伊立替康、拓?fù)涮婵?、長春新堿、長春地辛、長春堿和長春瑞濱。另一種是MEKC使用含20%乙腈的硼酸鹽-十二烷基硫酸鈉(SDS)分離緩沖液測定甲氨蝶呤、培美曲塞、依托泊苷、磷酸依托泊苷、磷酸氟達(dá)拉濱和5-氟尿嘧啶。胡雯雯等[16]使用閻超研究團(tuán)隊[17]此前開發(fā)的基于定量閥進(jìn)樣的商品化儀器(原理圖見圖1),同時測定復(fù)合維生素B片中5種維生素,直接測定峰面積的日內(nèi)RSD在1.9%以內(nèi),顯著優(yōu)于普通CE儀器。近期另一臺值得關(guān)注的儀器是浙江大學(xué)方群教授實驗室[18]開發(fā)的手持式CE儀器,使用激光誘導(dǎo)熒光檢測、短柱和缺口管進(jìn)樣技術(shù),具有體積小、成本低的特點,已用于氨基酸、蛋白質(zhì)和DNA的分析。

圖 1 基于定量閥進(jìn)樣的高精度毛細(xì)管電泳儀器原理圖[17]Fig. 1 Schematic overview of automated quantitative capillary electrophoresis system[17]

1.2 電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測法(C4D)

C4D適用于缺乏生色團(tuán)成分的檢測,近來得到廣泛應(yīng)用。Elbashir等[19]綜述了2014年2月到2016年10月期間CE-C4D在藥物、生物醫(yī)學(xué)和食品分析領(lǐng)域的應(yīng)用文獻(xiàn),其中以藥物分析的應(yīng)用居多。Cunha等[20]建立了在2 min內(nèi)快速測定不同制劑中可待因、鄰甲苯海明、異丙嗪、東莨菪堿、曲馬多和撲熱息痛含量的CE-C4D方法,檢出限為0.62～15 μmol/L。de Castro Costa等[21]采用CE-C4D在1 min內(nèi)超快速同時測定了藥品中銨和苯海拉明的含量。他們使用2-(N-嗎啉諾)乙醇磺酸-氫氧化鋰(pH 6.0)作為背景緩沖液。氨和苯海拉明的檢出限分別為0.04 mmol/L和0.02 mmol/L。他們[22]還提出CE-UV和CE-C4D快速測定精氨酸、抗壞血酸和天冬氨酸的方法,每小時分別可以測定23和78次,LOD均為0.01～0.04 mmol/L。Nguyen等[23]設(shè)計了一種CE-C4D系統(tǒng),可用于β-內(nèi)酰胺抗生素的質(zhì)量控制與摻偽識別。Evans等[24]用便攜式CE-雙C4D分別測定了3種含偽麻黃堿的市售片劑(見圖2)和兩種違禁藥物(甲基酮和對甲氧基甲基苯丙胺)的無機陰離子和無機陽離子譜。10個陽離子的檢出限為0.10～1.25 μmol/L, 8個陰離子檢出限為0.13～1.03 μmol/L。兩類離子的CE分離分別都在6 min內(nèi)完成,測得的離子指紋數(shù)據(jù)可用于對未知樣品的分類。

圖 2 3種市售含偽麻黃堿藥片的(a)無機陽離子和(b)陰離子CE-C4D譜圖[24]Fig. 2 CE-C4D chromatograms of (a) cations and (b) anions in the three kinds of commercially available tablets containing pseudoephedrine[24] C4D: capacitively coupled contactless conductivity detection; STD: standard samples; EPH: pharmaceutical tablet containing pseudoephedrine. Peaks in Fig. 1a: 1. Cs+ (IS), 2. 3. K+, 4. Ca2+, 5. Na+, 6. Mg2+, 7. Mn2+, 8. Sr2+, 9. Ba2+, 10. Li+; peaks in Fig. 1b: 1. Cl-, 2. 6. F-(IS), 7.

1.3 間接檢測方法

1.4 CE-MS分析

dos Santos等[28]用CE-MS/MS測定天然減肥藥和膳食補充劑中安非他明及其衍生物芬特明(PTM)、甲基苯丙胺(MAM)、甲二氧基安非他明(MDA)、甲二氧基甲基安非他明(MDMA)和甲二氧基乙基安非他明(MDEA)。樣品經(jīng)改良的QuEChERS方法處理,檢出限為0.02～0.06 μg/L。Ouyang等[29]采用電滲流泵鞘流納噴接口,實現(xiàn)了負(fù)離子模式下的毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)-MS聯(lián)用,并用于按照電荷差異精細(xì)分離識別硫酸軟骨素和硫酸肝素中不同結(jié)構(gòu)的酸性低聚糖,鞘流液是含乙酸銨的甲醇-水溶液。此前該團(tuán)隊的Sun等[30]采用相同的電滲流泵鞘流接口,用CZE-MS在正離子模式下分析了肝素低聚糖和低分子量肝素,使用的分離緩沖液是揮發(fā)性碳酸氫銨,鞘流液是含甲酸的甲醇-水溶液。Ansar等[31]先用含10%蔗糖的磷酸緩沖液(20 mmol/L, pH 6.5),在對脂質(zhì)體最小影響的條件下,用CE直接測定脂質(zhì)體阿霉素制劑中未包封阿霉素的含量。他們[32]還進(jìn)一步建立了CE與電感耦合等離子體(ICP)-MS/MS聯(lián)用方法,可在脂質(zhì)體破壞最小的情況下直接定量測定阿霉素脂質(zhì)體制劑中在脂質(zhì)體內(nèi)外不同狀態(tài)的硫酸鹽含量。

1.5 離子液體

李敏等[33]以30 mmol/L的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體水溶液為背景電解質(zhì),以頭孢拉定為內(nèi)標(biāo),CE同時測定頭孢噻肟、頭孢唑啉、頭孢曲松和頭孢米諾4種注射用頭孢藥物的含量。離子液體經(jīng)二氯甲烷萃取回收可重復(fù)使用。離子液體在手性藥物分析方面也有較多研究[34,35]。

1.6 藥物有關(guān)物質(zhì)分析

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心公布的《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[36]指出,“由于各種分析方法均具有一定的局限性,因此在進(jìn)行雜質(zhì)分析時,應(yīng)注意不同原理的分析方法間的相互補充與驗證,如HPLC與TLC及HPLC與CE的互相補充……”。說明在藥品雜質(zhì)分析研究時,需要用CE作為“互補技術(shù)”去發(fā)現(xiàn)目前HPLC方法難以分離分析甚至未檢出的雜質(zhì)。這種“互補技術(shù)”的應(yīng)用也是各國藥品審評指導(dǎo)原則的要求。

藥品中諸雜質(zhì)的種類與含量被總稱為雜質(zhì)譜,Holm等[37]綜述了藥物雜質(zhì)譜分析的研究進(jìn)展,討論了ICH在藥物雜質(zhì)風(fēng)險控制方面的若干準(zhǔn)則和策略。Dispas等[38]介紹了可應(yīng)用于雜質(zhì)檢測方法的QbD原理和統(tǒng)計策略,并對QbD應(yīng)用這類分析方法的文獻(xiàn)進(jìn)行了綜述。G?r?g[39]則評述了包括CE在內(nèi)的近十年來對映體雜質(zhì)的藥物雜質(zhì)譜和降解譜方面的研究進(jìn)展。畢萌萌等[40]建立了原料藥中呋喃西林及其雜質(zhì)5-硝基糠醛二乙酯的MEKC分析方法。楊直等[41]建立了CZE測定鹽酸雷尼替丁注射液中雷尼替丁和3個有關(guān)物質(zhì)含量的方法。Fayed等[42]在化學(xué)計量學(xué)優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立了CZE同時測定佐芬普利鈣、氫氯噻嗪,以及氫氯噻嗪的兩種主要雜質(zhì)氯噻嗪(chlorothiazide)和沙胺(salamide)。de Souza等[43]建立了CE分析呋喃苯胺酸(furosemide)及其降解樣品的方法,并做了方法認(rèn)證,該藥在中性、酸性和堿性條件下的水解,以及氧化、熱和光引起的降解產(chǎn)物不影響其定量。

1.7 手性藥物的對映體雜質(zhì)分析

中國藥典四部(2015版)[12]在通則9102“藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則”指出,對于立體異構(gòu)體雜質(zhì)的檢測廣泛采用手性色譜法和高效毛細(xì)管電泳法。

Saz等[44]綜述了環(huán)糊精用于CE手性藥物分析的研究進(jìn)展。Fanali等[45]在詳細(xì)總結(jié)CE手性拆分各方面已有成果的基礎(chǔ)上,討論了近十年進(jìn)展緩慢的原因和未來發(fā)展趨勢。潘聰潔等[46]綜述了2013～2015年CE用于手性分離的進(jìn)展。劉明霞等[47]綜述了2017～2019年CE在手性分離分析方面的進(jìn)展。杜迎翔等[48]綜述了近年來二元手性選擇劑CE拆分體系的進(jìn)展。吐爾遜·賈娜爾[34]綜述了手性離子液體在毛細(xì)管電泳手性分離中的應(yīng)用。Hancu等[49]綜述了CE在抗抑郁藥(氟西汀、西酞普蘭、舍曲林、文拉法辛和度洛西汀)對映體分離中的應(yīng)用。Ali等[50]綜述了手性喹諾酮類藥物對映體拆分的色譜和電泳方法,還提出一些選擇手性分離條件的建議。

本文側(cè)重討論與傳統(tǒng)藥物分析應(yīng)用領(lǐng)域密切相關(guān)的研究進(jìn)展,不再特別討論手性拆分劑與拆分方法研究方面的內(nèi)容。

1.7.1檢測靈敏度

對映體雜質(zhì)分析通常需要在手性分離的基礎(chǔ)上能夠定量含量低至0.1%的對映體,《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[36]對不同劑量的原料藥和制劑中雜質(zhì)(包括對映體雜質(zhì))的報告限度一般為0.03%～0.1%,質(zhì)控限度一般為0.05%～1.0%,這對CE對映體分離的檢測靈敏度提出了一定要求。Sánchez-López等[51]綜述了2013年6月到2015年5月有關(guān)手性CE中改進(jìn)檢測靈敏度的進(jìn)展。esták等[52]以消旋美沙酮為樣品,帶負(fù)電荷的β-環(huán)糊精硫酸酯為手性選擇劑,通過對低電導(dǎo)率樣品溶液中的陽離子進(jìn)行柱頭場放大濃縮,改善CE手性分析的檢測靈敏度。Casado等[53]比較不同環(huán)糊精的實驗結(jié)果,結(jié)果硫酸化-γ-CD(sulfated-γ-CD)作為手性拆分劑分離伊伐布雷定(ivabradine)效果最好,而且加入氨基酸手性離子液體(單獨使用沒有得到手性分離)則可以增加分離度,建立的方法可以檢測0.1%的對映體雜質(zhì)。徐梓馥等[54]用羧甲基-β-CD和L-組氨酸-Cu2+雙手性手性選擇劑CE拆分氧氟沙星對映體,可以檢測到0.1%的對映體雜質(zhì)成分。

1.7.2QbD原理應(yīng)用

基于QbD原理,Orlandini等[55]建立了環(huán)糊精修飾的膠束電動色譜法同時測定手性藥物氨布里西坦(ambrisentan)的對映體雜質(zhì)和有關(guān)物質(zhì)。Pasquini等[56]使用羥丙基-γ-環(huán)糊精(HP-γ-CD)手性拆分,建立了CE同時測定手性藥物西那卡塞(cinacalcet)對映體純度和雜質(zhì)含量的方法。基于QbD,以手性分離度和分析時間為指標(biāo),經(jīng)過Box-Behnken設(shè)計、確定“可操作的方法設(shè)計區(qū)域(method operable design region, MODR)”、Plackett-Burman耐用性檢驗,以及基于ICH的方法驗證,最后用于實際樣品分析。Krait等[57]基于QbD,以硫酸化β-CD為拆分劑建立了CE測定右美托咪定手性純度的方法,可測定0.1%的雜質(zhì)含量。

1.7.3體液手性藥物分析

生物液體中藥物低濃度的手性分離分析是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。ebestová等[58]利用CE-ICP/MS以sulfated-γ-CD作為手性拆分劑測定了尿樣中的抗腫瘤藥奧沙利鉑對映體。檢出限為64 ng/mL。Wu等[59]用聚去甲腎上腺素包被磁性納米顆粒和手性毛細(xì)管電泳手性分離分析了3種β-受體拮抗劑(卡特洛爾、美托洛爾和倍他索洛爾)。結(jié)合場增強進(jìn)樣,檢出限為0.401～1.59 ng/mL,并用于人體尿液樣品分析。該實驗室Xiao等[60]還用聚多巴改性磁性納米顆粒固相萃取結(jié)合手性CE方法,手性分離分析了尿樣和牛血清中微量加標(biāo)氧氟沙星外消旋體。結(jié)合壓力輔助場增強進(jìn)樣,檢出限低至0.29 ng/mL。楊四梅等[35]使用L-脯氨酸-Cu2+-氯化-1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl)的Tris-磷酸緩沖液,以離子液體促進(jìn)的手性配體交換CE分離分析去氧腎上腺素光學(xué)異構(gòu)體,并用于加標(biāo)血液和尿液樣品中R和S型去氧腎上腺素的測定。

手性CE分析可以看成是特殊的難分離雜質(zhì)分析,與化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的需求相關(guān)。目前使用手性固定相的HPLC應(yīng)用較多,也解決了大部分對映體雜質(zhì)的分析檢測問題。CE因其易于在緩沖液中使用不同的手性添加劑而獨具特色,可在手性HPLC難分離對映體樣品的分析方面發(fā)揮重要作用。而且CE手性拆分時,拆分劑與對映體藥物處于均處于自由溶液中,為研究手性藥物與受體的識別提供了良好條件。

1.8 制劑分析

Contin等[61]建立了MEKC分析兒科制劑中艾地苯醌(idebenone)的分析方法，并做了方法認(rèn)證。結(jié)果表明，該成分存在兩種不同氧化還原狀態(tài)和生物活性。Kogawa等[62]提出一種定量分析片劑中利福昔明(rifaximin)的CE方法。王萍等[63]用CE測定消毒劑與藥品中的利巴韋林時,利用十六烷基三甲基溴化銨反轉(zhuǎn)電滲流縮短了分析時間。Junger等[64]建立了CE快速測定不同制劑中麻醉劑苯佐卡因和利多卡因的方法。Mufusama等[65]建立了CZE測定抗瘧復(fù)方制劑中阿莫地喹及其中含量≤0.5%的3種合成雜質(zhì)的方法，并根據(jù)ICH的質(zhì)量指南Q2(R1)文件的規(guī)定做了方法驗證。

1.9 其他

Kowalski等[66]利用SDS單體與大環(huán)抗生素的相互作用,結(jié)合場放大進(jìn)樣,使用含有60% (v/v)乙腈的緩沖液分離了螺旋霉素、伊維菌素、泰樂霉素、交沙霉素、雷帕霉素和利福霉素。張含智等[67]用CE測定了環(huán)肽抗生素硫酸多黏菌素中4種多黏菌素B成分,分離緩沖液為含有HP-β-CD和異丙醇的磷酸三乙醇胺緩沖液(pH 2.5)。Wingert等[68]用微乳電動色譜建立定量分析抗凝血藥利伐沙班的方法,并評價其穩(wěn)定性。

在靈敏度和精密度不如藥物分析常用的HPLC時,CE可通過多種分離模式提供獨特的選擇性,獲得與常用HPLC不同的分離效果。在新藥審評中普遍關(guān)注的雜質(zhì)研究方面,應(yīng)用CE可能分離出常規(guī)HPLC未分離而漏檢的雜質(zhì)。這個互補技術(shù)的概念也提示,尋找HPLC分析的難點、發(fā)揮CE的長處,也是CE研究值得注意的方向。

另一方面,CE在分離效率、選擇性、快速與經(jīng)濟性的優(yōu)勢仍然存在,產(chǎn)生CE應(yīng)用研究目前現(xiàn)狀的原因與其靈敏度和精密度密切相關(guān),這兩方面的進(jìn)展都可能顯著擴展未來CE的應(yīng)用領(lǐng)域,對CE的應(yīng)用研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響,值得關(guān)注。

2 中藥與天然藥物分析

2.1 CE分離分析方法研究

Liu等[70]使用甲基-乙烯基咪唑(methyl-vinylimidazole)官能團(tuán)化有機聚合物單體，自制的整體柱,采用毛細(xì)管電色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定了吳茱萸果實中3種生物活性成分吳茱萸胺(evodiamine)、吳茱萸次堿(rutaecarpine)、吳茱萸內(nèi)酯(limonin)的含量。李曉慧等[71]制備聚甲基丙烯酸丁酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯整體SPE材料,與CE聯(lián)合分離檢測桑葉中蘆丁、綠原酸、槲皮素等成分。

曾雪等[72]用加入β-CD的CZE方法測定了三黃片中大黃素和大黃酚。Sereia等[73]使用含HP-β-CD的硼酸緩沖液為背景電解質(zhì),建立了巴西藥用植物卡圖巴(Trichiliacatigua)樹皮乙酸乙酯部位多種非對映異構(gòu)多酚成分的CE-UV測定方法。

2.2 檢測方法

Zhou等[74]將聚醚醚酮(PEEK)毛細(xì)管用于CE-MS,使用高有機溶劑體系分析中藥中多組活性生物堿,表現(xiàn)出良好的分離性能,并應(yīng)用于浙貝母藥材中貝母甲素(peimine)和貝母乙素(peiminine)的高靈敏定量分析。Cheng等[75]用自建的基于小離心管流動溶液電噴霧接口的非水CE-MS方法,以二羥基蒽二酮為內(nèi)標(biāo),分離測定了中藥大黃中大黃素甲醚、大黃酚和蘆薈大黃素。

Sun等[76]采用CE-電致化學(xué)發(fā)光檢測法測定了石蒜中加蘭他敏(galanthamine)、高石蒜堿(homolycorine)、石蒜寧堿(lycorenine)和多花水仙堿(tazettine)4種生物堿，檢出限依次為14、11、1.8和3.1 ng/mL。孫雙姣等[77]還測定了紅花石蒜中偽石蒜堿、石蒜堿和高石蒜堿,通過添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)改善了CE的分離效果。鄧光輝等[78]以CE-電致化學(xué)發(fā)光檢測法,建立了金釵石斛中石斛堿含量的測定方法,檢出限為0.045 mg/L。他們還建立了同時檢測博落回果實中血根堿和白屈菜紅堿含量的CE電致化學(xué)發(fā)光分析方法,分離緩沖液中使用了含50%的乙腈[79]。

Wu等[80]利用Triton X-100和SDS組成的混合膠束對姜黃素天然熒光的增敏作用,建立了MEKC-激光誘導(dǎo)熒光檢測(LIF)測定姜黃、藥用姜黃搽劑、咖喱調(diào)味料和人尿液中姜黃素、去甲氧基姜黃素、二去甲氧基姜黃素3種姜黃素類成分的方法。唐夢杰等[81]用CE-C4D測定中藥材連翹中齊墩果酸、熊果酸和白樺脂酸,檢出限為1.0～1.4 μg/mL。

2.3 中藥指紋圖譜

CE中藥指紋圖譜的研究發(fā)揮了CE分離復(fù)雜樣品的優(yōu)勢,這方面的研究文獻(xiàn)較多。Hou等[82]提出結(jié)合CE指紋譜與線性定量分析法(linear quantitative profiling)評價苦參的質(zhì)量一致性。張蕾等[83]以硼酸鹽-SDS-無水乙醇為分離緩沖液,建立了新疆紫草的MEKC指紋圖譜,確定了6個特征峰,其中兩個峰被識別為左旋紫草素和乙酰紫草素。孫姍等[84]用CZE建立了苣荬菜的指紋圖譜,確認(rèn)9個共有峰,并識別其中3個峰分別為綠原酸、蘆丁和槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷。李成思等[85]用MEKC建立有12個共同峰的藏藥白花龍膽指紋圖譜。郭鵬等[86]采用場放大進(jìn)樣的CE方法測定了中藥附子的指紋圖譜,所采集的10批藥材中有8個共有峰,識別出其中苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿3個峰。陳寶龍等[87]用MEKC建立了山楂藥材的指紋圖譜,確定包括金絲桃苷在內(nèi)的16個共有峰。王玲嬌等[88]建立了木香順氣丸CE指紋圖譜,以橙皮苷為參照峰,確定了14個共有指紋峰。孫姍等[89]用CE研究了白車軸草的毛細(xì)管電泳指紋圖譜,確認(rèn)了10個共有峰。惠陽等[90]建立了中藥材高良姜黃酮類提取物的MEKC特征圖譜，確定了15個共有峰,并識別其中6個峰分別為兒茶精、山柰酚、槲皮素、高良姜素、山柰素-4′-甲醚和姜黃素。

張政等[91]建立了CE檢測全蝎酶解液中蛋白類成分(>10 kDa)的指紋圖譜分析方法,并對10批樣品做了相似度評價,初步確定了以25個峰為共有峰的指紋圖譜。陳莉等[92]建立了中成藥康復(fù)新液(從美洲大蠊制得)的CE指紋圖譜,確定了8個共有峰。

2.4 中藥多糖分析

依明·尕哈甫等[93]經(jīng)α-萘胺-氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)衍生,用CE測定了牛舌草多糖水解后的單糖組成。張建等[94]以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)為衍生試劑,用CZE測定不同蟲草菌粉制劑中蟲草粗多糖的單糖組成。

2.5 中藥分析其他方面

Alzoman等[95]建立了CE測定三花六道木(Abeliatriflora)植物葉子粗提物中黃芩苷和咖啡酸的方法。Tascon等[96]建立了CE同時測定常見植物中去氫駱駝蓬堿(harmine)、駱駝蓬堿(harmaline)、哈爾酚(harmol)、去甲駱駝蓬堿(harmalol)、去甲氧去氫駱駝蓬堿(harmane)和去甲哈爾滿(norharmane)6種具有精神活性的β-carboline類生物堿的方法,用該方法分析駱駝蓬種子輸液，檢出了前3種成分。楊霞等[97]用CE同時檢測決明子中大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲大黃素甲醚和橙黃決明素5種蒽醌類化合物。王博等[98]用MEKC同時測定了小青龍顆粒中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿與芍藥苷的含量。

盧恒等[99]還建立了人參中銅和鎘離子的MEKC-LIF測定方法。樣品用濃硝酸-過氧化氫徹底消解后,用熒光絡(luò)合劑異硫氰酸熒光素酯-偶氮乙二胺四乙酸柱前絡(luò)合其中的Cu2+與Cd2+,以pH 9.3的硼酸鹽-SDS為分離緩沖液分離,激發(fā)波長為483 nm，在520 nm波長下熒光檢測。

中藥作為復(fù)雜樣品,為CE的研究提供了廣闊的舞臺。目前需要考慮CE是否可以深入研究中藥這類復(fù)雜樣品在HPLC分析中遇到的難題。其中,CE-MS分析中藥的研究值得關(guān)注。

3 體內(nèi)藥物分析

Kubáň等[100]綜述了CE用于非傳統(tǒng)體液樣品(母乳、呼吸冷凝物、汗液、唾液、羊水、腦脊液或干血斑)中1 000 Da以下小分子(離子)成分的分析。Silva等[101]綜述了測定體液樣品中搖頭丸成分的分析方法。

3.1 新方法研究

Opekar等[102]提出一種可從漢密爾頓(Hamilton)進(jìn)樣器進(jìn)樣分析μL級臨床樣品的CE分析自動微進(jìn)樣器。注射器針頭的出口與分離毛細(xì)管的進(jìn)樣口對準(zhǔn)并相距數(shù)百μm,進(jìn)樣時從注射器中擠出的一滴樣品在毛細(xì)管的入口被捕獲進(jìn)入到毛細(xì)管,洗掉多余的樣品溶液后采用CE分離。方法測定總量10 μL鼠血漿中的抗寄生蟲藥戊烷脒(pentamidine),使用C4D檢測器的定量限是8 μmol/L。Emara等[103]建立了毛細(xì)管柱內(nèi)衍生化結(jié)合熒光檢測的快速MEKC測定人血清中嗎啡的方法。在含有鐵氰化鉀的背景電解質(zhì)中,嗎啡被氧化成高熒光產(chǎn)物偽嗎啡,方法檢出限為1.14 ng/mL,并用于單次口服硫酸嗎啡控釋片后血清中嗎啡的測定。Wu等[104]將熒光染料7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸作為衍生化試劑用于405 nm半導(dǎo)體LIF檢測,氫氯噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮衍生后經(jīng)MEKC基線分離后的檢出限分別為0.24、0.29、和0.23 nmol/L,用于加標(biāo)人尿液樣品的分析。

3.2 體內(nèi)藥物分析的檢測靈敏度

CE-MS和CE在線濃縮的方法得到較多應(yīng)用。Piestansky等[105]研究和比較了兩種用于監(jiān)測人尿中戒煙藥伐尼克蘭(varenicline)的CE方法。一種是CZE-MS快速分析方法(分析時間7 min),另一種是低成本的基于在線樣品濃縮的CZE-UV方法,兩法都做了方法驗證。

3.2.1CE-MS

Hernández-Mesa等[106]用CE-MS/MS建立了經(jīng)分子印跡固相萃取處理的尿液樣品中11種5-硝基咪唑類化合物及其代謝物的分析方法，檢出限為9.6～130.2 μg/L。vidrnoch等[107]用非水CE-MS/MS建立了同時測定人血清中9種苯二氮卓類藥物(bentazepam、etizolam、deschloroetizolam、diclazepam、flubromazepam、flubromazolam、nimetazepam、phenazepam、pyrazolam)的方法。采用25 mmol/L醋酸銨和100 mmol/L三氟乙酸的乙腈溶液為分離電解質(zhì),測定的LOD在1.5～15.0 ng/mL之間。Tejada-Casado等[108]用MEKC-MS/MS建立了同時測定動物尿液中13種苯并咪唑的新方法。使用在線掃集模式改善靈敏度,LOD低于70 μg/L。

Sun等[109]將構(gòu)建的新型電致化學(xué)發(fā)光傳感器與毛細(xì)管電泳聯(lián)用,測定了人血漿中鹽酸喹那普利(quinapril)及其代謝物鹽酸喹普利拉(quinaprilat), LOD分別為3.6 ng/mL和3.9 ng/mL。李享等[110]基于堿性溶液中待測組分對[Ag(HIO6)2]5-(二(過碘酸氫)合銀(Ⅲ)配離子)-魯米諾體系化學(xué)發(fā)光的抑制作用,建立了測定人血清中萬古霉素和去甲萬古霉素的SPE-CE-間接化學(xué)發(fā)光檢測方法，檢出限均為2.5 μg/mL。該團(tuán)隊的朱懷嬌等[111]則利用嗎啡對相同體系化學(xué)發(fā)光的抑制作用,建立了檢測尿液與血液中嗎啡含量的CE-間接化學(xué)發(fā)光檢測方法,檢出限為0.75 mg/L。Saar-Reismaa等[112]用CE熒光檢測快速分析3種致幻成分,包括唾液樣本收集過程,可在大約15 min內(nèi)完成搖頭丸濫用的檢測。

3.2.2在線濃縮

3.3 其他體內(nèi)藥物分析研究

李興華等[121]建立了高效毛細(xì)管電泳-紫外檢測法快速分離測定10-羥基喜樹堿、6-巰基嘌呤、5-氟尿嘧啶3種抗腫瘤藥物的方法。劉曉鳳等[33]用CE測定給藥大鼠血漿中頭孢地尼濃度，并計算了藥動學(xué)參數(shù),定量限為0.2 μg/mL。胡小波等[122]建立了血漿直接進(jìn)樣測定大鼠血漿中丙吡胺游離濃度和總濃度的CE方法。Liu等[123]建立簡便的CZE方法,在自殺基因抗腫瘤療法中,可同時檢測攜帶CD/5-FC自殺基因系統(tǒng)的人細(xì)胞中5-氟胞嘧啶及其目標(biāo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物5-氟尿嘧啶。有關(guān)手性藥物體內(nèi)分析已在1.7節(jié)提及。

體內(nèi)藥物分析對檢測靈敏度有較高要求,LC-MS/MS具有優(yōu)勢地位。CE的樣品使用量少,通過在線濃縮與CE-MS/MS建立起新的技術(shù)特色,在體內(nèi)藥物分析領(lǐng)域有較好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

4 生物制品藥物分析

CE已經(jīng)成為生物藥(包括單克隆抗體)完整狀態(tài)和middle-up途徑分析表征的基本工具。Kahle等[124]綜述了蛋白質(zhì)電荷異質(zhì)性分析的3種CE技術(shù):cIEF、全柱成像cIEF(icIEF)和CZE,討論了各方法實驗參數(shù)對分析結(jié)果影響的研究進(jìn)展,總結(jié)了各方法精密度的進(jìn)展,提出開發(fā)cIEF分析方法時的參數(shù)和范圍,對相關(guān)實驗具有較好的實用價值。陳泓序等[125]從純度分析、等電點(pI)測定、電荷異質(zhì)性分析和N-寡糖分析幾方面詳細(xì)綜述了CE在單克隆抗體藥物分析中的應(yīng)用。高凡等[126]綜述了MEKC與MEKC-MS在蛋白質(zhì)分離分析方面的研究進(jìn)展。

4.1 CE-SDS

《中國藥典》2015版中收錄的“單抗分子大小變異體測定法”(通則3127)是目前單克隆抗體純度檢測的主要方法,使用含有十二烷基硫酸鈉和親水性聚合物的分離緩沖液,稱為CE-SDS。Gu等[127]使用計算機模擬和CE-SDS實驗，評估了基線干擾對治療性蛋白藥物純度測定的影響,認(rèn)為基線干擾源自樣品分析中的熱干擾以及背景電解質(zhì)的基線特征。他們還提供了改善準(zhǔn)確度的實驗建議。

Zhang等[128]采用SDS-毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)和柱頭場放大樣品堆積在線預(yù)濃縮技術(shù),僅用25 ng總蛋白實現(xiàn)了基于分子大小的蛋白質(zhì)分析。在214 nm下,病毒外殼蛋白的檢出限為0.2 ng/mL (3.3 pmol/L),靈敏度增強3個數(shù)量級,可與銀染SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)相媲美。方法已用于分析不同血清型和轉(zhuǎn)基因的腺相關(guān)病毒(AAV)產(chǎn)品的純度。

Beckman等[129]使用CE-SDS分析RTP-1(一種Fc-Adnectin融合蛋白,約80 kDa)時,分離度和峰對稱性不理想,將SDS換成十六烷基硫酸鈉(sodium hexadecyl sulfate, SHS)后,其分離度和塔板數(shù)分別提高了2.3倍和8倍(見圖3)。

圖 3 凝膠緩沖溶液中添加和不添加0.2% SHS的RTP-1蛋白CGE電泳圖[129]Fig. 3 CGE electropherograms of RTP-1 comparing results with or without 0.2% SHS added to the gel buffer solution[129] CGE: capillary gel electrophoresis ; SHS: sodium hexadecyl sulfate; SDS: sodium dodecyl sulfate.

Kahle等[130]使用不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)混合物比較了主要的商品化CE儀器用于CE-SDS蛋白分析的性能,有助于用戶根據(jù)實際需求選購。

劉振東等[131]研究優(yōu)化了分析非還原單克隆抗體藥物純度的前處理條件,認(rèn)為高pH的樣品緩沖液中封閉劑降解,易使未封閉的游離巰基介導(dǎo)鏈間二硫鍵斷裂,會導(dǎo)致樣品處理過程中出現(xiàn)非預(yù)期降解。鄧欽培等[132]用CE-SDS建立了測定人絨促性素(hCG)解離亞基的測定方法,并用于工藝開發(fā)及穩(wěn)定性研究中檢測影響其活性的亞基解離現(xiàn)象。

4.2 生物制品的CE-MS研究

CE-MS聯(lián)用是生物藥物分析的熱點。Sanchez-Hernandez等[133]提出在CE-SDS與MS聯(lián)用分析抗體時在線消除SDS干擾的方法。通過在樣品進(jìn)樣區(qū)帶后注入陽離子表面活性劑的甲醇-水溶液,利用陽離子表面活性劑與SDS在管內(nèi)相對移動和結(jié)合,除去與抗體結(jié)合的SDS,使抗體的CE峰變窄變強。例如含有0.2% (v/v) SDS的樣品中,使用十六烷基三甲基溴化銨或苯扎氯銨分別可恢復(fù)97%和95%的質(zhì)譜峰強度。該方法也被用于其他蛋白質(zhì)和溶于10%SDS中的抗體,以及其他包含SDS的基質(zhì)。

Le-Minh等[134]提出在天然活性條件下的CE-MS方法,在沒有去活和去折疊的活性條件下分析完整的治療藥物英利昔單抗。非去活的實驗條件保護(hù)了單抗的構(gòu)象差異和自締合,CE毛細(xì)管使用了聚凝胺(polybrene)-硫酸葡聚糖-聚凝胺3層涂層,鞘流液為異丙醇-水-醋酸,單次分析可以同時檢測天然的和去折疊的單體以及二聚體。

圖 4 用CIEF-MS方法分析英夫利昔單抗的變體[135]Fig. 4 Identified variants of infliximab by cIEF-MS[135]cIEF: capillary isoelectric focusing.

Wang等[135]用3處通孔的小塑料離心管構(gòu)建流動溶液接口建立了高分辨cIEF-MS聯(lián)用方法,不用抗對流劑甘油時pI的分辨率可以達(dá)到0.02 pH。以英夫利昔單抗制劑為樣品,用軌道阱(Orbitrap)質(zhì)譜成功分離了4個變體,并在10-6質(zhì)量精度下識別出13個英夫利昔單抗分子量變體(見圖4)。該研究團(tuán)隊的Cheng等[136]使用類似的此前建立的非水CE-MS聯(lián)用接口,以含20 mmol/L甲酸銨的乙腈-甲醇-甲酸(20∶78∶2, v/v/v)為分離緩沖液、含2 mmol/L甲酸銨的乙醇溶液為接口溶液,分離了6種高疏水性抗菌肽temporin樣品。該團(tuán)隊[75]還將此非水CE-MS接口用于中藥成分。

Haselberg等[137]用低流量無鞘CE-MS在完整和middle-up策略(使用內(nèi)切蛋白酶IdeS)分析完整和酶切后的單克隆抗體。通過分析兩種單價納米抗體Nb1和Nb2(各自包含Myc-6xHis標(biāo)記)以及兩種Nb1結(jié)構(gòu)域的二價抗體(Nb1-35 GS-Nb1)對系統(tǒng)進(jìn)行評價,并用于分析幾種具有不同電荷和糖基化差異的單抗藥物。

Camperi等[138]對人絨毛膜促性腺激素(hCG)進(jìn)行了完整水平的CE表征,CE分離兩種hCG生物類似藥物:Ovitrelle(重組r-hCG)和Pregnyl(分離自孕婦尿液),結(jié)果兩者峰數(shù)、遷移時間和峰強度均不相同,說明不同來源的hCG藥物中含有不同性質(zhì)和比例的亞型。經(jīng)cIEF分析,兩者pI范圍分別為3.4～4.7和4.5～5.2。他們進(jìn)一步開發(fā)出CZE方法，可以區(qū)分對應(yīng)不同的hCG亞型的至少6個峰,建立了可用于hCG各種異構(gòu)體指紋識別的CZE-MS聯(lián)用分析方法。

4.3 全柱成像毛細(xì)管等電聚焦法

icIEF在檢測多肽與蛋白質(zhì)藥物的等電點以及電荷異質(zhì)性方面有明顯優(yōu)勢,應(yīng)用較多。Goyon等[139]用icIEF測定了23個美國食品和藥品管理局(FDA)和歐洲藥物管理局(EMA)批準(zhǔn)的pI范圍從6.1到9.4的單克隆抗體治療藥物,并建議icIEF可以作為此類測定的參考技術(shù)。Demirdirek等[140]報道了監(jiān)測靜脈輸液中葡萄糖參與的蛋白糖化產(chǎn)物的icIEF方法,顯示其能夠檢測不穩(wěn)定的席夫堿糖基加合物。

武剛等[141]考察了icIEF測定單抗等電點的實驗條件(包括添加尿素、聚焦時間、pI標(biāo)記物)對icIEF測定抗HER2單抗、抗VEGF單抗的主峰等電點測定的影響,認(rèn)為pI標(biāo)記物的選擇對等電點測定結(jié)果影響較大,測得等電點受到pI標(biāo)記物標(biāo)注等電點準(zhǔn)確性的影響。他們[142]還在icIEF分析單抗電荷異質(zhì)性時組織國內(nèi)多家質(zhì)控實驗室對該方法進(jìn)行驗證,并制備出用于icIEF的系統(tǒng)適用性對照品。

李響等[143]用icIEF有效分離了IL-15融和蛋白的12個電荷異構(gòu)體,并證明唾液酸化程度差異是電荷異質(zhì)性產(chǎn)生的主要原因。他們[144]還比較了icIEF與CZE兩種分析重組人促紅素電荷異構(gòu)體含量的方法,認(rèn)為兩者均可滿足rhEPO電荷異構(gòu)體的質(zhì)控需求。孟曉光等[145]用icIEF檢測多肽與蛋白質(zhì)藥物的等電點,人血紅蛋白的4種主要電荷異構(gòu)體實現(xiàn)了基線分離,評價了進(jìn)口及國產(chǎn)貝伐單抗一致性。周朝明等[146]用國產(chǎn)icIEF儀器測定了多肽KR-1、胰島素、融合蛋白疫苗重組人乳頭瘤病毒的等電點。

4.4 抗體藥物分析

Ladner等[147]將單抗的胰蛋白酶消化和電泳分離水解物在線自動化聯(lián)用,用于3種單克隆抗體(曲妥珠單抗、英夫利昔單抗和托西珠單抗)的分析，結(jié)果與離線消化的譜圖相當(dāng),可用于單克隆抗體藥物的質(zhì)量控制。Said等[148]利用無鞘CE-MS/MS,從整體、middle-up和bottom-up不同的分析策略對抗體偶聯(lián)藥物本妥昔單抗(brentuximab vedotin)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。Hutanu等[149]使用鹽酸胍溶液沖洗以避免管壁蛋白質(zhì)的吸附,通過加入特異性配體,利用部分填充毛細(xì)管的親和CE法分離了兩種相似單克隆抗體的混合物。

王文波等[150]用CZE建立IgG2型單抗電荷異質(zhì)性分析方法時,使用含有羥丙基甲基纖維素的6-氨基己酸-三乙基四胺緩沖液作為分離緩沖液,改善了樣品的分離。黃碧君等[151]用CE測定重組人源化IgG2抗體的純度,使用的是商品化的SDS-MW Analysis Kit分離緩沖液。

4.5 N-寡糖分析

CE已經(jīng)具有分離相同單糖序列但位置不同的寡糖同分異構(gòu)體,并可區(qū)分單糖之間的α連接和β連接。Lu等[152]詳細(xì)綜述了2014～2018年初CE分離N-寡糖的進(jìn)展和主要應(yīng)用。Szigeti等[153]提出用溫度梯度技術(shù)改進(jìn)熒光標(biāo)記N-寡糖CE分離的選擇性。在15～45 ℃的溫度區(qū)間內(nèi)以5 ℃為間隔梯度升溫,分離了3種寡糖的混合物，顯示溫度是CE寡糖分離的重要實驗參數(shù)。李鳳等[154]以8-氨基芘-1,3,6-三磺酸鈉(APTS)為熒光衍生試劑,分別建立中藥多糖中單糖組成的CE分析方法，以及人血清中糖蛋白N-寡糖的CE指紋譜分析方法。Savicheva等[155]還通過對APTS的結(jié)構(gòu)改造,得到用于還原糖分析、具有更高熒光強度和更多負(fù)電荷的CE激光誘導(dǎo)熒光衍生試劑。

4.6 二硫鍵分析

表征二硫鍵的連接位置仍然是分析肽/蛋白質(zhì)藥物的一個重要問題。Delvaux等[156]結(jié)合CZE-MS、離子遷移譜-MS和理論計算,研究了具有兩個分子內(nèi)二硫鍵,但存在不同半胱氨酸連接方式的3種多肽的二硫鍵異構(gòu)體,在水相(CZE)和氣相(離子遷移譜)中的分離。

4.7 生物制品分析的其他方面

Liang等[157]提出一種用于改善CZE分離高濃度組分的擴展速度間隙技術(shù)(stretching velocity gap, S-VGCE),其機理是高濃度的樣品成分先被拉伸成較寬的區(qū)帶,再通過電切換的切割效應(yīng)將樣品分成多個短區(qū)帶,然后將這些短區(qū)帶分離開。Liang等[157]將該技術(shù)用于分離含有溶菌酶、牛血清白蛋白和核糖核酸酶組成的混合蛋白質(zhì)樣品。Maldaner等[158]以雷尼替丁為內(nèi)標(biāo),用CZE分析了重組人甲狀旁腺素(rhPTH 1-34),線性范圍為0.25～250 μg/mL。Kpaibe等[159]報道了蛇毒液指紋圖譜的CZE分析方法,使用改性涂層毛細(xì)管以避免蛇毒中大量蛋白質(zhì)和肽的吸附,可用于不同批次蛇毒液的質(zhì)量控制。Yao等[160]建立了CZE分離測定門冬酰胺酶(埃希)及其酸性變體的方法,定量限為1.9%。

van Tricht等[161]用CE直接定量檢測上下游加工樣品中完整的腺病毒顆粒,用于開發(fā)基于腺病毒疫苗期間的分析監(jiān)測。使用由125 mmol/L Tris、338 mmol/L三甲基甘氨酸和0.2%(v/v)聚山梨酯-20組成的緩沖液(pH 7.7),將腺病毒顆粒從復(fù)雜的混合物中分離出來。生產(chǎn)過程中5個具有代表性的樣品中腺病毒的定量測定結(jié)果為0.5×1011～1.5×1011腺病毒顆粒/mL (約80～250 pmol/L)。

中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞是常用于單抗生產(chǎn)的蛋白表達(dá)系統(tǒng),Wang等[162]建立了同時檢測CHO細(xì)胞中7種氧化還原和能量相關(guān)代謝物的毛細(xì)管電泳方法。采用在線聚焦技術(shù),7種代謝物的檢出限為0.050～0.688 mg/L,并用于兩種不同培養(yǎng)條件下CHO細(xì)胞提取物的分析。

Hu等[163]報道了一種利用毛細(xì)管電泳一體化固定化酶反應(yīng)器在線檢測青霉素酶活性和抑制作用的方法,可用于細(xì)菌耐藥性的治療和診斷。Chen等[164]以青霉素G為底物,建立了CE分析絲氨酸-β-內(nèi)酰胺酶和金屬-β-內(nèi)酰胺酶的方法,并對在線和離線兩種方法都做了方法認(rèn)證。

吳克等[165]用CE紫外間接檢測法測定了四價輪狀病毒疫苗原液中蔗糖的含量,分離緩沖液為含CTAB的2,6-吡啶二羧酸-NaOH溶液(pH 12.6)。李響等[166]用CZE測定了重組人干擾素α-1b滴眼液中間甲酚的含量。

在生物制品分析方面,CE-SDS、icIEF已經(jīng)形成了方法優(yōu)勢并成為蛋白類藥物法定分析方法難以替代的一部分,CE-MS也具備了在生物制品分析中解決實際問題的能力。生物制品在新藥研發(fā)和生產(chǎn)過程中提出了很多需要解決的分析問題,未來在這方面CE將會得到越來越多的應(yīng)用。

5 結(jié)論

CE在藥物分析方面仍然具有特色和優(yōu)勢,并顯示出較大的發(fā)展空間。CE-MS在不斷改進(jìn)接口技術(shù)的同時,在藥物分析各方面都得到廣泛應(yīng)用,MS和MS/MS強大的定性能力與優(yōu)越的檢測靈敏度彌補了CE的短板,而CE對包括生物大分子在內(nèi)的強極性生物活性成分的分離能力也使CE-MS顯示出獨特的優(yōu)勢。用于蛋白類藥物分析的icIEF和CE-SDS在應(yīng)用中逐漸走向成熟,成為生物制品分析的有力工具,在作為國內(nèi)外研發(fā)熱點的抗體藥物研究方面更具優(yōu)勢,兩者均已經(jīng)實現(xiàn)與MS聯(lián)用,并會顯示出更多應(yīng)用潛力。廣泛應(yīng)用的在線樣品濃縮技術(shù)使檢測靈敏度不再成為CE分析的難題。對分析重復(fù)性的改進(jìn)以及便攜式儀器的出現(xiàn)可能使國內(nèi)CE儀器擁有走向世界的技術(shù)特色,也為CE更多進(jìn)入日常藥品檢測實驗室以及快檢現(xiàn)場提供了想象空間。

這些研究成果顯示,CE分析的多個重要瓶頸問題(例如靈敏度、重復(fù)性、定性能力等)已經(jīng)出現(xiàn)突破的跡象,令人期待。相對于其他色譜分析方法,CE技術(shù)的掌握還普遍存在一定難度,將這些成果和方法用于解決藥物分析中存在的很多具體問題還需要各方面的耐心和投入。在應(yīng)用研究過程中不斷產(chǎn)生的新問題和新思路,以及CE在方法學(xué)和其他領(lǐng)域研究成果的應(yīng)用,推進(jìn)著CE藥物分析的不斷發(fā)展。

致謝 感謝上海市食品藥品檢驗所季申教授在中藥分析方面的討論。