紀(jì) 欣，白 靜，艾 靜，于加平

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101)

復(fù)合納米磁珠是一種高通量的材料，可以快速提取生物中的核酸樣本。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，核酸提取需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題也變成了用簡(jiǎn)單、快速、適合大眾的方法從多種生物組織中來(lái)獲得高產(chǎn)量和高品質(zhì)的基因組DNA[1]。納米磁珠就是指具有納米的超順磁微球，是一種新型的納米材料。使用這種材料提取DNA與傳統(tǒng)的分離方法相比，能將DNA從復(fù)雜的生物樣品中快速分離出來(lái)，能夠?qū)崿F(xiàn)分離和富集的同時(shí)進(jìn)行，有效地提高了分離速度和富集效率[2]，同時(shí)也使分析檢測(cè)的靈敏度大大提升。

1 試劑和儀器

1.1 試劑

二價(jià)鐵鹽、三價(jià)鐵鹽、氨丙基三乙氧基硅烷、十一烯酸、十二烷基硫酸鈉、四乙氧基硅烷、鹽酸、氨水、油酸(均為北京化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，純度為分析純)。

1.2 儀器

透射電子顯微鏡(JEM-2100UHR型，日本JE-OL公司生產(chǎn))，紅外光譜儀(Avatar-360型，美國(guó)尼高力公司生產(chǎn))，電子天平(JA2002，上海精天電子儀器有限公司生產(chǎn))，烘干箱(DZF-6020型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn))，超聲波清洗儀(KL-040型，深圳市科力超聲波洗凈設(shè)備有限公司生產(chǎn))，水浴搖床(YXQ.SG41.280，海生銀醫(yī)療儀器儀表廠生產(chǎn))。

2 試驗(yàn)方法

2.1 氨基納米磁珠的制備

量取100 mL水于500 mL三口瓶中，繼續(xù)進(jìn)行超聲溶解10 min。通入N2，加入3.80 g FeCl2·4H2O，溶解后再超聲超10 min[3]。迅速加入9 mL氨水并伴隨劇烈的攪拌，觀察到有Fe3O4粒子生成后開始緩慢加入油酸15 mL，在70℃的溫度下，劇烈攪拌1 h。所得產(chǎn)物備依次用水和丙酮洗滌多次，直至清洗看到磁性納米顆粒。將所得產(chǎn)物進(jìn)行干燥備用。將干燥后的磁流體粉末稱取0.74 g，溶于6 mL石油醚[4]中，將其所得的產(chǎn)物進(jìn)行超聲10 min左右，使其均勻分散。在24 mL水中使用移液器量取550μL十一烯酸加入，使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0。親水性磁流體的制備：取反應(yīng)后的磁性顆粒溶液4 mL，逐滴加入到十一烯酸鈉溶液中，進(jìn)行1 h的劇烈攪拌即可得到。取一定量的過(guò)硫酸鉀、所制備的水溶性磁流體及450 μL石油醚放置于單口瓶中，通N2排盡瓶?jī)?nèi)空氣后進(jìn)行密封。將單口瓶置于水浴搖床中70℃加熱24 h。制備的磁性微球分別用水和乙醇洗滌2～3次，分散于乙醇溶液中備用。取1 g磁性微球加入100 mL 80%的乙醇水溶液中，將其分散均勻。依次加入0.4 mL氨水和0.25 mL四乙氧基硅烷，室溫超聲3 h。產(chǎn)物依次用無(wú)水乙醇和蒸餾水進(jìn)行洗滌，洗滌完成后進(jìn)行干燥，即得表面硅羥基包覆的磁性微球。取1 g表面硅羥基修飾的磁性微球分散于100 mL 80%的乙醇水溶液中，加入0.4 mL氨水和0.25 mLγ-氨丙基三乙氧基硅烷，室溫超聲3 h。所得產(chǎn)物用無(wú)水乙醇和蒸餾水洗滌，干燥后即得表面氨基包覆的磁性微球[5]。

2.2 過(guò)硫酸鉀的量對(duì)納米磁珠粒徑大小的影響

在2.1試驗(yàn)方法基礎(chǔ)上，固定溫度為70℃、加入0.25 mL四乙氧基硅烷的條件下，分別稱取0.010 00 g、0.015 00 g、0.020 00 g過(guò)硫酸鉀的量，制備復(fù)合氨基納米磁珠。

2.3 四乙氧基硅烷的量對(duì)納米磁珠粒徑大小的影響

在2.1方法基礎(chǔ)上，固定在溫度為70℃、加入0.015 00 g過(guò)硫酸鉀的條件下，分別加入0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL的四氧基硅烷，制備復(fù)合氨基納米磁珠。

2.4 溫度的變化對(duì)納米磁珠粒徑大小的影響

在2.1方法基礎(chǔ)上，固定加入0.25 mL四乙氧基硅烷、0.015 00 g過(guò)硫酸鉀的條件下，改變水浴搖床的溫度為80℃、70℃、60℃，制備復(fù)合氨基納米磁珠。

3 結(jié)果與分析

3.1 氨基納米磁珠制備的結(jié)果

取1 g制備完成的氨基納米磁珠，將其在無(wú)水乙醇溶液中進(jìn)行分散，加入適量的茚三酮，密封后進(jìn)行加熱，可以觀察到三角瓶中的溶液由黃色逐漸變?yōu)樽仙?，即證明所制備磁性微球上含有氨基。

3.2 運(yùn)用電鏡對(duì)制備的納米磁珠進(jìn)行表征

3.2.1 過(guò)硫酸鉀的量對(duì)納米磁珠粒徑大小的影響

按2.2方法制得氨基納米磁珠，經(jīng)電鏡掃描，結(jié)果如圖1所示。圖1A1、A2、A3分別為0.010 00 g、0.015 00 g、0.020 00 g 過(guò)硫酸鉀所制備的氨基納米磁珠。由圖可知，含量為0.015 00 g 的過(guò)硫酸鉀所修飾的納米磁珠粒徑大小均一，分散性較好，因此本試驗(yàn)加入0.015 00 g 的過(guò)硫酸鉀為宜。

3.2.2 四乙氧基硅烷的量對(duì)納米磁珠粒徑大小的影響

按2.3方法制得氨基納米磁珠，經(jīng)電鏡掃描，結(jié)果如圖2所示。圖2B1、B2、B3分別為0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL四乙氧基硅烷所制備的氨基納米磁珠。由圖可知，0.25 mL四乙氧基硅烷所修飾的納米磁珠粒徑大小均一，均為400 nm左右，從而使用0.25 mL四乙氧基硅烷對(duì)納米磁珠進(jìn)行修飾可以保證納米粒子的高吸附量，并減小修飾對(duì)磁性納米顆粒的影響，故應(yīng)當(dāng)加入0.25 mL四乙氧基硅烷。

3.2.3 溫度的變化對(duì)納米磁珠粒徑大小的影響

按2.4方法制得氨基納米磁珠，經(jīng)電鏡掃描，結(jié)果如圖3所示。圖3C1、C2、C3分別為80℃時(shí)、70℃時(shí)、60℃時(shí)所制備的氨基納米磁珠。由圖可知，當(dāng)溫度為70℃時(shí)，所制備的納米磁珠粒徑均勻，粒徑大小普遍為400 nm，分布較均勻，故本研究認(rèn)為應(yīng)采用70℃為宜。

圖1 不同量過(guò)硫酸鉀制備氨基納米磁珠的電鏡掃描圖Fig.1 Scanning electron microscope of amidogen nanometer beads prepared by different volume of potassium persulfate

圖2 不同量四乙氧基硅烷制備氨基納米磁珠的電鏡掃描圖Fig.2 Scanning electron microscope of amidogen nanometer beads prepared by tetraethoxy-silicanen of different volumes

圖3 不同溫度制備氨基納米磁珠的電鏡掃描圖Fig.3 Scanning electron microscope of amidogen nanometer beads prepared under different temperatures

3.3 利用紅外光譜對(duì)制備的納米磁珠進(jìn)行表征

通過(guò)TEM可得在70℃，加入0.015 00 g過(guò)硫酸鉀、0.25 mL四乙氧基硅烷的氨基納米磁珠為最佳，使用此試劑含量的條件下將所制得的磁性納米顆粒通過(guò)磁分離和超聲分散的方式，分別使用去離子水和無(wú)水乙醇進(jìn)行3次以上的清洗，一直到紅外光譜儀檢測(cè)無(wú)有機(jī)物被洗出之后，所得的磁性微球粉末干燥后進(jìn)行KBr壓片制樣，然后使用紅外光譜儀測(cè)定磁性微粒的紅外光圖譜。如圖4所示。圖4為氨基納米磁珠的紅外圖譜，在548 cm-1處有一強(qiáng)吸收峰，對(duì)應(yīng)Fe3O4的Fe-O特征伸縮吸收峰，圖中峰形完整，說(shuō)明了磁性納米顆粒成功結(jié)合。811 cm-1和1 387 nm-1分別為Si-O-Si的對(duì)稱和不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，1 289 cm-1處為Si-O-Si的彎曲振動(dòng)峰，說(shuō)明四乙氧基硅烷修飾成功。2 932 cm-1處為C-H對(duì)稱振動(dòng)峰，2 331 cm-1處為N-H鍵變形振動(dòng)峰，說(shuō)明氨基納米磁珠制備成功。

圖4 紅外光圖譜Fig.4 Infrared spectrum

4 結(jié)論

以Fe3O4納米材料為磁性核，以共沉淀法研制的復(fù)合納米磁珠，再以三價(jià)鐵鹽和二價(jià)鐵鹽為原料在堿性條件下制備Fe3O4納米材料，經(jīng)電鏡表征和紅外表征確定過(guò)硫酸鉀的量為0.015 00 g、四乙氧化硅烷0.25 mL、水浴加熱70℃所制得的氨基納米磁珠粒徑大小均勻，利用所得到的納米磁珠對(duì)DNA進(jìn)行提取，所提取的DNA的純度較高，所制備的復(fù)合納米磁珠性能比較穩(wěn)定。

氨基納米磁珠為分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)學(xué)的研究提供一種高性能的分離純化材料，進(jìn)而為其發(fā)展提供強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)?？蔀樾滦偷纳锾崛》蛛x手段提供所需高效材料的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。制備新型、高性能、穩(wěn)定的多種物質(zhì)包埋式納米磁珠為生命科學(xué)、食品科學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的研究提供一種高效的材料。