翟家振，張元龍，孔令杰

(清華大學(xué) a.精密儀器系；b.自動化系，北京 100084)

熒光顯微在生物醫(yī)學(xué)研究、新型材料表征等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用[1-2]. 熒光顯微具有可特異性標(biāo)記，可對活體細(xì)胞進(jìn)行實時動態(tài)成像等優(yōu)勢，已經(jīng)成為當(dāng)前生物科學(xué)研究必備的技術(shù)手段，是生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)等課程[1]的重要內(nèi)容. 但是，商用熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價格昂貴，這不僅為開設(shè)相關(guān)實驗課程設(shè)置了很高的經(jīng)濟門檻，而且由于大部分商用熒光顯微鏡不支持用戶自行拆裝，不利于開展實驗教學(xué). 本文結(jié)合在神經(jīng)光子學(xué)課程的教學(xué)實踐，介紹了簡易熒光顯微鏡的制作方法及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用. 通過自行設(shè)計并且組裝光學(xué)元器件，可以加深學(xué)生對熒光顯微原理的認(rèn)識. 將自行搭建的熒光顯微鏡應(yīng)用于觀察含熒光蛋白標(biāo)記的腦組織切片，檢驗了系統(tǒng)的性能.

1 熒光顯微鏡的原理

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡是基于樣品的光吸收、相位梯度和雙折射等進(jìn)行成像，成像對比度低. 熒光是當(dāng)分子受到光激發(fā)時，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，經(jīng)弛豫后再回到基態(tài)所輻射出的光. 由于熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與輻射光譜之間存在著斯托克斯位移，可采用濾光片濾出發(fā)射熒光. 熒光顯微技術(shù)通過利用樣本發(fā)射熒光的特性對單個分子物質(zhì)的時空分布進(jìn)行成像，可顯著地提高成像對比度. 此外，可特異性熒光標(biāo)記這一性能使得監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)部含特定熒光團標(biāo)記成分的位置及其擴散系數(shù)、轉(zhuǎn)運特性、環(huán)境因素或與其他生物分子的相互作用等成為可能[1-2].

常見的熒光標(biāo)記物質(zhì)主要有熒光染料、熒光蛋白和量子點等. 其中，熒光蛋白作為活體熒光材料，具有良好的生物兼容性，被廣泛應(yīng)用于生物動態(tài)過程研究. 尤其是自2008年諾貝爾化學(xué)獎授予綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)之后，人們發(fā)展了豐富多彩的熒光蛋白. 當(dāng)前，隨著基因工程技術(shù)的進(jìn)步，采用熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)不僅可以研究特定細(xì)胞或細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化，還可以基于鈣信號或電壓信號等研究生物動態(tài)過程. 對于不同的細(xì)胞或細(xì)胞器，采用不同光譜特性的熒光蛋白分別進(jìn)行特異性標(biāo)記，還可以研究它們之間的動態(tài)相互作用.

2 簡易熒光顯微鏡的制作

圖1為所設(shè)計熒光顯微鏡的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖，主要由光源、透鏡、濾光片、二色鏡、物鏡、目鏡和三維精密載物臺等組成. 上述各元件均可直接從光電器件供應(yīng)商采購，參考型號如表1所示. 通過采用籠式結(jié)構(gòu)，使得所設(shè)計的熒光顯微鏡的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊，相對于商用產(chǎn)品大大降低了成本. 此外，考慮到小動物成像等應(yīng)用，設(shè)計中采用了背向探測的方式.

圖1 簡易熒光顯微鏡的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖

表1 簡易熒光顯微鏡的主要器件列表

與明場顯微鏡不同的是，典型的熒光顯微鏡還需要引入濾光系統(tǒng). 如圖1所示，光源所發(fā)出的光透過透鏡，經(jīng)濾波片1選出所需的激發(fā)波長后被二色鏡反射，再經(jīng)物鏡聚焦后照在生物樣本上. 所激發(fā)出的熒光經(jīng)物鏡收集透過二色鏡,再經(jīng)濾波片2濾出所發(fā)射的微弱熒光后傳至目鏡. 圖像記錄可采用智能手機的攝像頭完成[3].

考慮到黃色熒光蛋白(YFP)已被廣泛應(yīng)用于生物樣品的標(biāo)記，本文選擇藍(lán)色LED光源(M470L3-C1，Thorlabs)作為照明光源，其中心發(fā)射波長為470 nm；相應(yīng)地，激發(fā)、發(fā)射濾光片和二向色鏡選擇Thorlabs公司的MDF-YFP套裝. 為了確保照明均勻，調(diào)整透鏡的位置以實現(xiàn)科勒照明.

3 簡易熒光顯微鏡的應(yīng)用

采用搭建的熒光顯微鏡觀察腦組織切片，檢驗系統(tǒng)的性能. 生物樣品為Thy1-YFP(H)成年轉(zhuǎn)基因小鼠(JAX Stock No.003782)的腦切片，其中YFP主要表達(dá)在腦皮層的第5層及海馬區(qū)的錐形神經(jīng)元[4]. YFP的峰值發(fā)射波長為529 nm，與上述所選擇的濾光片套裝相匹配.

3.1 大視場、低分辨率成像

首先使用低倍率物鏡進(jìn)行大視場觀察. 圖2所示為采用4×、數(shù)值孔徑0.13 的物鏡(Nikon, CFI Plan Fluor 4×)和10×目鏡組合所拍攝的小鼠腦組織冠狀切片熒光圖像，圖3為圖2中虛線框區(qū)域的放大顯示圖.

圖2 用4×、數(shù)值孔徑0.13 的物鏡和10×目鏡組合所拍攝的小鼠腦組織冠狀切片的熒光圖像

圖3 圖2中虛線框區(qū)域的放大顯示圖

可見，其視場范圍可以涵蓋小鼠的整個半腦，但是成像空間分辨率低，僅僅能分辨神經(jīng)元胞體(圖3)，對于更精細(xì)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)(例如樹突、軸突)則難以分辨. 實驗中可進(jìn)一步驗證，僅通過對圖像進(jìn)行數(shù)字放大，無法提高成像的空間分辨率.

3.2 小視場、高分辨率成像

將物鏡切換至高倍率、高數(shù)值孔徑物鏡，可實現(xiàn)小視場、高分辨率成像. 圖4所示為采用10×、

圖4 采用10×，數(shù)值孔徑0.5 的物鏡和10×目鏡組合所拍攝的小鼠腦組織冠狀切片的熒光圖像

數(shù)值孔徑0.5 的物鏡(Nikon, CFI Super Fluor 10×)和10×目鏡組合所拍攝的熒光圖像(與圖3所示區(qū)域相同).

相對于圖2，其視場范圍減小，但是，圖4所示神經(jīng)元的樹突以及由軸突構(gòu)成的纖維束都清晰可見[5].

綜合上述實驗可見，實際成像中需要在光學(xué)顯微系統(tǒng)中成像視場與空間分辨率之間進(jìn)行折中選擇. 為了獲得高分辨率的圖像，成像視場往往受到限制；反之亦然. 此外，通過引入高速圖像記錄器件，所搭建的熒光顯微鏡還可以用于研究生物動態(tài)過程，如小動物在體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動的動態(tài)觀測.

4 結(jié)束語

針對商用熒光顯微鏡價格高昂、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等不利于實驗教學(xué)的缺點，制作了簡易熒光顯微鏡. 通過采用商用可得的光電元器件，設(shè)計搭建了簡易熒光顯微鏡系統(tǒng). 將上述系統(tǒng)應(yīng)用于觀察含熒光蛋白標(biāo)記的腦組織切片，分析討論了不同物鏡放大倍率下成像視場與空間分辨率的關(guān)系. 上述系統(tǒng)可用于普通高校相關(guān)專業(yè)的熒光顯微鏡教學(xué)，并可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究.