安雯婷，郭麗娜，房克峰,姜樂(lè)，徐珊，高志嵩，徐偉立

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊 050051

血管瘤是嬰幼兒時(shí)期最常見(jiàn)的良性腫瘤，盡管其中某些類型如毛細(xì)血管瘤存在緩慢消退的可能，但仍有10%～20%的血管瘤患者存在遺留的外觀損害、破潰、功能障礙等并發(fā)癥，嚴(yán)重的甚至威脅到生命[1,2]，因此早期治療十分必要。現(xiàn)有治療血管瘤的方法很多，包括手術(shù)，激光照射，局部或系統(tǒng)使用皮質(zhì)類激素、β-腎上腺素受體阻斷劑、干擾素、長(zhǎng)春新堿等治療方式[3]。普萘洛爾作為最常見(jiàn)的一種β-腎上腺素受體阻斷劑，目前已成為嬰幼兒血管瘤治療的一線藥物[4]?，F(xiàn)有的針對(duì)普萘洛爾治療血管瘤的研究大多是基于體外細(xì)胞模型，對(duì)于動(dòng)物模型及其給藥方式和量效關(guān)系的探討相對(duì)較少。因此，2015年1月～2018年12月本研究擬通過(guò)建立血管瘤BALB/c裸鼠動(dòng)物模型，探討普萘洛爾治療動(dòng)物模型血管瘤的合理給藥劑量和最佳方案，從而為普萘洛爾治療血管瘤的機(jī)制研究提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 3～5周齡雌性BALB/c裸鼠40只，體質(zhì)量15～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有裸鼠均在隔離器屏障環(huán)境內(nèi)(SPF級(jí))飼養(yǎng)，飼養(yǎng)水及墊料均經(jīng)15磅高壓消毒30 min，飼料經(jīng)紫外線照射30 min。不同濃度(0.01%、0.05%、0.1%)的普萘洛爾溶液(美國(guó)sigma公司)；電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；游標(biāo)卡尺(上海精密儀器儀表有限公司)；全自動(dòng)高壓滅菌器(日本三菱集團(tuán))。

1.2 BALB/c裸鼠血管瘤模型的建立 供體增殖期血管瘤來(lái)源于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院小兒外科住院手術(shù)治療的血管瘤患兒(已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，且獲得家長(zhǎng)知情同意，并對(duì)患者的個(gè)人信息進(jìn)行保密)。無(wú)菌條件下手術(shù)切除患兒血管瘤組織，部分瘤體組織甲醛固定后送病理學(xué)檢查并證實(shí)為增殖期嬰幼兒型毛細(xì)血管瘤。用生理鹽水處理剩余瘤體組織，剔除瘤體皮下纖維結(jié)締組織和脂肪組織，切割成大小為2 mm×2 mm×2 mm的組織塊若干，經(jīng)皮膚切口移植于40只裸鼠腰背部皮下組織內(nèi)，每只2處。移植在超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，并在標(biāo)本離體1 h內(nèi)完成所有移植工作。瘤體植入后定期觀察并測(cè)量記錄瘤體生長(zhǎng)情況，成瘤標(biāo)準(zhǔn)為皮下結(jié)節(jié)直徑大于0.5 cm。

1.3 模型動(dòng)物分組及處理 瘤體移植后第45天將40只荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組(每組8只)：治療組1，腹腔注射0.01%普萘洛爾溶液0.4 mL，1次/d，持續(xù)1周；治療組2，腹腔注射0.05%普萘洛爾溶液0.4 mL，1次/d，持續(xù)1周；治療組3，腹腔注射0.1%普萘洛爾溶液0.4 mL，1次/d，持續(xù)1周；治療組4，經(jīng)口灌胃0.01%普萘洛爾溶液0.4 mL，1次/d，持續(xù)1周；對(duì)照組，腹腔注射蒸餾水0.4 mL，1次/d，持續(xù)1周。

2 結(jié)果

2.1 各組瘤體體積比較 見(jiàn)表1、2。

表1 腹腔注射不同濃度普萘洛爾對(duì)裸鼠瘤體體積的影響

表2 普萘洛爾不同給藥方式對(duì)裸鼠瘤體體積的影響

2.2 各組腫瘤組織HE染色情況比較 組織形態(tài)學(xué)上，對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞富集、纖維組織少，內(nèi)皮細(xì)胞增殖并聚集成團(tuán)，間隔組織少，界限清晰，細(xì)胞呈條索狀或團(tuán)塊狀排列，形態(tài)大小各異，胞核肥大而淡染，呈現(xiàn)增殖的特點(diǎn)。治療組血管瘤的組織結(jié)構(gòu)稀疏，血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少且分散凌亂，細(xì)胞溶解，破碎，局部變性壞死，管腔間有脂肪細(xì)胞、纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞核小而染色淺。且普萘洛爾的給藥濃度越高，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制作用越明顯，見(jiàn)圖1。

2.3 各組體質(zhì)量比較 干預(yù)后第7、14、21天，治療組1、2、3及對(duì)照組兩兩相比，治療組1與治療組4相比，裸鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3、4。

3 討論

嬰幼兒血管瘤是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增生，發(fā)生在皮膚和軟組織的一種良性腫瘤。血管瘤通常在嬰兒出生后1周左右出現(xiàn)；前6個(gè)月為快遞增殖期，瘤體增長(zhǎng)迅速，形成草莓樣斑塊或腫瘤；6個(gè)月后進(jìn)入晚期增殖期，增長(zhǎng)逐漸放緩；1歲后進(jìn)入消退期并最終緩慢消退，7歲時(shí)消退率可達(dá)70%[5,6]。盡管血管瘤是一種自限性疾病，但根據(jù)其風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，部分血管瘤仍需要進(jìn)行治療，以抑制血管內(nèi)皮組織增生和促進(jìn)瘤體消退[7]?！堆芰龊兔}管畸形診斷和治療指南》(2016)指出，高風(fēng)險(xiǎn)血管瘤一線治療藥物為口服普萘洛爾，中風(fēng)險(xiǎn)者可局部外用β-腎上腺素受體阻斷劑，低風(fēng)險(xiǎn)者可隨訪觀察[8]。普萘洛爾自2008年首次被報(bào)道用于嬰幼兒血管瘤治療，如今成為一線治療藥物，但其具體治療機(jī)制仍未完全>闡明[9]。文獻(xiàn)報(bào)道有影響內(nèi)皮細(xì)胞因子、成血管因子、生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)，有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)和蛋白酶促進(jìn)瘤體消退學(xué)說(shuō)，也有促進(jìn)細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)等[10,11]。截至目前，針對(duì)普萘洛爾治療血管瘤的研究大多是利用體外內(nèi)皮細(xì)胞，而利用血管瘤移植動(dòng)物模型的研究相對(duì)較少。

圖1 各組腫瘤組織HE染色(×200)

由于普萘洛爾用于嬰幼兒血管瘤的治療主要基于臨床的意外發(fā)現(xiàn)，通過(guò)動(dòng)物模型研究量效關(guān)系和作用機(jī)制較少。本研究通過(guò)建立嬰幼兒血管瘤裸鼠移植模型來(lái)探討普萘洛爾的合理給藥劑量和給藥方式，采用不同劑量和不同給藥途徑普萘洛爾對(duì)模型裸鼠進(jìn)行干預(yù)，在不同時(shí)期觀察裸鼠移植瘤體體積。結(jié)果表明，對(duì)照組瘤體體積在干預(yù)后14天內(nèi)表現(xiàn)為逐漸增大，第21天時(shí)出現(xiàn)縮小，可能與血管瘤存在自身消退的特點(diǎn)有關(guān)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后第7、14、21天，治療組1、2、3較對(duì)照組瘤體體積小，表明了普萘洛爾對(duì)瘤體增殖的抑制作用。干預(yù)后第14、21天，治療組3較治療組1、2瘤體體積小，表明隨著治療組普萘洛爾給藥劑量的增加，裸鼠瘤體具有更明顯的消退趨勢(shì)，普萘洛爾對(duì)裸鼠血管瘤的生長(zhǎng)抑制作用具有一定的劑量依賴性。從給藥方式對(duì)瘤體消退效果影響來(lái)看，干預(yù)后第7天，治療組1較治療組4瘤體體積小，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；干預(yù)后第14、21天，治療組1較治療組4瘤體體積明顯減小。這可能與腹腔注射只存在肝臟首過(guò)代謝，而灌胃存在胃腸和肝臟首過(guò)代謝有關(guān)，腹腔注射的生物利用度較灌胃高，療效顯著，瘤體體積更小?，F(xiàn)有的血管瘤裸鼠模型研究中，普萘洛爾多采用口服灌胃方式，本研究顯示普萘洛爾口服灌胃方式治療效果略差。本研究采用腹腔注射普萘洛爾的方法顯示了較好的治療效果，提供了一種新的給藥治療途徑。各組病理學(xué)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，治療組瘤體固縮，毛細(xì)血管分布較少，瘤體較治療前顯著縮小，對(duì)照組瘤體血供良好，可見(jiàn)少量小血管進(jìn)入瘤體。結(jié)合HE染色結(jié)果以及瘤體測(cè)量結(jié)果，說(shuō)明普萘洛爾對(duì)裸鼠模型血管瘤具有明顯抑制作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)對(duì)荷瘤小鼠生長(zhǎng)情況進(jìn)行對(duì)比來(lái)評(píng)估給藥毒性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，治療組裸鼠沒(méi)有顯示出體質(zhì)量差異，說(shuō)明4個(gè)普萘洛爾治療組均在安全劑量范圍內(nèi)，毒副作用較輕，耐受性良好，對(duì)裸鼠機(jī)體無(wú)明顯損害。

表3 腹腔注射不同濃度普萘洛爾對(duì)裸鼠體質(zhì)量的影響

表4 普萘洛爾不同給藥方式對(duì)裸鼠體質(zhì)量的影響

本研究成功建立了BALB/c裸鼠血管瘤模型，普萘洛爾可抑制模型裸鼠瘤體生長(zhǎng)，對(duì)裸鼠機(jī)體無(wú)明顯損害，且腹腔注射較灌胃效果顯著。在此基礎(chǔ)上，后續(xù)研究將進(jìn)一步探討普萘洛爾抗血管瘤作用的相關(guān)靶點(diǎn)和機(jī)制，以更好地指導(dǎo)其在血管瘤治療中的應(yīng)用。