劉建林,趙小蓉,汪萍,劉康,別俊

1川北醫(yī)學(xué)院,四川南充 637000;2南充市中心醫(yī)院

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類由mRNA 3′及5′末端首尾相連形成的無蛋白編碼功能的RNA分子，主要由內(nèi)含子或外顯子通過反向拼接或套索內(nèi)含子的方式產(chǎn)生[1]。長期以來，限于檢測技術(shù)的制約，circRNA被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄后加工過程中的錯誤產(chǎn)物，并未引起重視。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)circRNA廣泛存在于真核細(xì)胞中，且穩(wěn)定表達(dá)，在人類細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用[2]。目前研究表明，circRNA在很多腫瘤中存在異常表達(dá)，且與腫瘤分期及類型存在相關(guān)性[3]，提示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，有望為腫瘤的診斷、治療提供新的思路。circRNA在腫瘤中的作用已成為非編碼RNA家族中新的研究熱點。現(xiàn)對circRNA的形成機(jī)制、生物學(xué)特征、功能及其在腫瘤中作用等方面進(jìn)行闡述。

1 circRNA

1.1 形成分類及特征 circRNA主要有內(nèi)含子環(huán)化和外顯子環(huán)化兩類形成方式。根據(jù)生成合成機(jī)制circRNA可以分為三種類型：外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA和外顯子—內(nèi)含子circRNA。目前成環(huán)機(jī)制有：在mRNA前體上，連續(xù)的組裝小核糖體蛋白催化外顯子下游的5′供體位點連接到上游的3′受體位點，首尾插接形成環(huán)化，通過剪切形成circRNA；部分circRNA外顯子兩側(cè)內(nèi)含子中含有反向互補(bǔ)序列，在剪切位點上形成RNA雙鏈，通過可變剪切形成帶內(nèi)含子和不帶內(nèi)含子兩種circRNA；RNA結(jié)合蛋白(RBPs)是一類涉及基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的蛋白，是circRNA的基本功能元素，通過將RPBs結(jié)合到外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子上，促進(jìn)circRNA的形成。不同于線性RNA，circRNA是共價閉合的單鏈環(huán)狀RNA分子，無5′帽和3′poly(A)尾巴。這種結(jié)構(gòu)特征使得circRNA對核糖核酸酶[如核糖核酸外切酶R(RNase R)和核酸外切酶]的消化具有抗性，相比線性mRNA的穩(wěn)定性更高、半衰期更長[4]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，circRNA多由外顯子組成，少數(shù)由內(nèi)含子環(huán)化形成，在物種間進(jìn)化上具有高度保守性[5]；且在一定組織細(xì)胞來源及不同發(fā)育階段中具有時序特異性[6]。

1.2 功能 研究發(fā)現(xiàn)circRNA可充當(dāng)miRNA海綿，從而發(fā)揮生物學(xué)作用[7]。circRNAs是一類競爭性內(nèi)源RNAs，可以與miRNA結(jié)合而在轉(zhuǎn)錄后水平上影響miRNAs的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致miRNA相關(guān)靶基因表達(dá)水平發(fā)生改變[8,9]。同時circRNAs通過多種途徑參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，部分外顯子—內(nèi)含子circRNA可以與U1小核糖核蛋白(snRNP)相互作用，通過與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合，促進(jìn)親本基因轉(zhuǎn)錄[10]。剪接因子外顯子可以環(huán)化形成circRNA，它與前體mRNA的線性剪接競爭，影響線性RNA的形成，起到調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的作用。此外，circRNA作為非編碼RNA，被認(rèn)為無法依靠帽子相關(guān)翻譯機(jī)制進(jìn)行翻譯，并且，先前的多核糖體梯度分析和核糖體譜分析表明，大多數(shù)circRNA與多核糖體無關(guān)。然而最近一些研究通過構(gòu)建了一個包含無限閱讀框的環(huán)狀RNA，證明這種circRNA可以模仿原核生物中RNA翻譯進(jìn)行DNA滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)[11]，這提示circRNA可以編碼蛋白質(zhì)，具有翻譯功能。

近來研究發(fā)現(xiàn)，circRNA參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，例如促分裂原激活蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B和Wnt/β-catenin途徑[12,13]。作為上游的調(diào)節(jié)分子，circRNA通過與miRNA競爭釋放下游分子而發(fā)揮作用。目前已發(fā)現(xiàn)circRNA參與腫瘤發(fā)生、增殖、凋亡和侵襲等過程，有望通過干預(yù)circRNA水平來達(dá)到治療腫瘤的目的。腫瘤細(xì)胞具有免疫原性，但腫瘤可以逃避免疫監(jiān)視。實際上，在腫瘤發(fā)展的整個過程中，細(xì)胞必須克服內(nèi)部和外部免疫的障礙才能成為腫瘤，只有癌細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視并通過各種免疫逃逸機(jī)制克服免疫功能時，腫瘤才能進(jìn)展或殺死宿主?，F(xiàn)有報道指出，circRNA可以用作競爭性內(nèi)源RNA來幫助腫瘤逃避免疫監(jiān)視，且在免疫檢查點治療期間，circRNA表達(dá)的變化可能會影響治療的效果[14]，但具體機(jī)制尚不明確。

2 circRNA對各類腫瘤的作用

2.1 乳腺癌 Fang等[15]通過微陣列分析了人類乳腺癌和良性組織中circRNA的水平，發(fā)現(xiàn)circRNA circ-Ccnb1在癌癥樣品中被下調(diào)。Chen等[16]通過實驗表明，三陰性乳腺癌(TNBC)細(xì)胞系中的circEPSTI1(hsa_ circRNA_000479)水平上升，是TNBC患者生存的獨立預(yù)后指標(biāo)。上述研究提示異常表達(dá)的circRNR有助于TNBC的早期診斷及預(yù)后判斷。此外，Chen等[16]研究還發(fā)現(xiàn)，circEPSTI1作為miRNA海綿，可與miR-4753和miR-6809結(jié)合，調(diào)節(jié)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病11A基因表達(dá)，影響TNBC細(xì)胞增殖和凋亡。Gao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，circ_0006528在TNBC組織和細(xì)胞系中過度表達(dá)，且與晚期腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)。circ_0006528作為競爭性內(nèi)源RNA，可通過miR-7-5p海綿作用并激活絲分裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來促進(jìn)TNBC進(jìn)展。表明circRNA可通過其miRNA海綿作用，影響TNBC相關(guān)靶基因的表達(dá)及其信號通路，參與TNBC的發(fā)生發(fā)展。

2.2 肺癌 Dai等[18]發(fā)現(xiàn)，circ0006916在惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及肺癌細(xì)胞和組織中下調(diào)，其通過與miR-522-3p結(jié)合并抑制PH結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸重復(fù)序列的蛋白磷酸酶1活性而成為肺癌的腫瘤抑制因子，通過減緩細(xì)胞周期進(jìn)程來抑制細(xì)胞增殖。Zhu等[19]報道，hsa_circ_0013958在肺腺癌組織中明顯上調(diào)，同時被鑒定為miR-134的海綿，能夠上調(diào)癌基因細(xì)胞周期蛋白D1，在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。表明circRNA可通過其miRNA海綿作用，參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，并對肺癌的嚴(yán)重程度起預(yù)測作用。融合基因是由染色體異常易位引起的兩個分離基因的雜交。融合基因棘皮微管相關(guān)蛋白樣4(EML4)—間變性淋巴瘤激酶(ALK)存在于4%～5%的NSCLC病例中，并通過激活A(yù)LK產(chǎn)生致癌活性[20]。融合基因不僅編碼與腫瘤發(fā)生有關(guān)的融合蛋白，而且產(chǎn)生非編碼RNA，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[20]。例如，混合譜系白血病(MLL)/AF9融合基因(f-circM9)產(chǎn)生的circRNA(F-circEA)就具有促增殖和促癌活性。值得注意的是，F(xiàn)-circEA主要存在于EML4-ALK陽性NSCLC患者血漿中,表明F-circEA可能是診斷EML4-ALK陽性NSCLC患者的潛在生物標(biāo)志物。

2.3 結(jié)直腸癌 circRNR表達(dá)譜在結(jié)直腸癌細(xì)胞系和組織中有顯著的豐度變化，與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移、侵襲、預(yù)后等密切相關(guān)。Hsiao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，circCCDC66在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高，并與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后有關(guān)。circCCDC66可通過與miR-33b、miR-93和miR-185結(jié)合來調(diào)節(jié)癌基因C-myc的表達(dá)。Zeng等[22]研究報道，circHIPK3在大腸癌組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)，并且與轉(zhuǎn)移和晚期臨床分期呈正相關(guān)。circHIPK3基因敲除可顯著抑制大腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制大腸癌的生長和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。上調(diào)的circHIPK3可通過增加miR-7靶向原癌基因胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)、表皮生長因子受體(EGFR)、陰陽因子1(YY1)的表達(dá)，有效逆轉(zhuǎn)miR-7誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞惡性表型的衰減。Li等[23]研究指出，circITGA7在大腸癌中具有腫瘤抑制作用，通過抑制Ras信號通路并促進(jìn)ITGA7的轉(zhuǎn)錄來抑制大腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

2.4 食管癌 Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，circ-TTC17在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)細(xì)胞和組織中明顯過表達(dá)，共有20個miRNAs(如miR-153、miR-217、miR-224和miR-370)和相應(yīng)的靶mRNA與circ-TTC17發(fā)生相互作用,并且體外實驗表明，circ-TTC17促進(jìn)了ESCC細(xì)胞的增殖和遷移。上調(diào)的circ-TTC17有可能成為將來ESCC診斷、治療和預(yù)后的新生物標(biāo)記物。放療期間獲得的放射抵抗被認(rèn)為是局部腫瘤復(fù)發(fā)或治療失敗的最重要原因。Su等[25]調(diào)查circRNA在食管癌放射抵抗中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn),與人類親代細(xì)胞系KYSE-150相比，人類抗輻射食管癌細(xì)胞系KYSE-150R中有57個circRNA顯著上調(diào)，而17個circRNA則下調(diào)，這些失調(diào)的circRNA可能參與了放射抗性的發(fā)展。隨后的circRNAmiR共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析表明，circRNA_001059和circRNA_000167是潛在circRNA/miRNA網(wǎng)絡(luò)中最重要的因素。這些結(jié)果提示，異常表達(dá)的circRNA與食管癌細(xì)胞的抗輻射性有關(guān)。

2.5 其他腫瘤 circRNA不僅在實體腫瘤中發(fā)揮作用，而且可參與血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)生發(fā)展。Guarnerio等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中，PML-RARa融合基因不僅可以翻譯融合蛋白，還可以形成circRNA f-circM9融合蛋白。功能增強(qiáng)測定和功能喪失測定表明，f-circM9發(fā)揮原癌基因作用，有助于急性早幼粒細(xì)胞白血病中的細(xì)胞轉(zhuǎn)化。另外，f-circRNA賦予了體內(nèi)治療抗性，并與其他致癌因子(如融合蛋白)協(xié)同作用，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)展。2020年，Wu等[27]首次報道線粒體circRNA促癌功能研究，結(jié)果顯示mc-COX2是在慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)血漿中高度表達(dá)的重要mt-circRNA(線粒體基因組衍生的circRNA)，且在CLL患者的血漿外泌體中高表達(dá)。其生物學(xué)和臨床特征也提示mc-COX2的上調(diào)與白血病的發(fā)生和CLL患者的生存率呈正相關(guān)；功能研究發(fā)現(xiàn)，通過沉默CLL細(xì)胞中的mc-COX2基因，可以增強(qiáng)抗腫瘤作用。這提示mt-circRNA在CLL中具有促癌作用，且在血漿中表達(dá)，為液體活檢方面提供了可能。雖然在血液系統(tǒng)腫瘤中circRNA報道較少，但已初步成為血液腫瘤領(lǐng)域研究熱點。

綜上所述，circRNA通過miRNA海綿作用、蛋白質(zhì)結(jié)合分子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物、參與腫瘤逃逸及免疫等生物學(xué)功能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并與腫瘤預(yù)后轉(zhuǎn)歸有著密切關(guān)系。血漿和組織樣品中存在大量的circRNA，circRNA有望成為癌癥篩查及臨床診斷、治療和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物；未來circRNA在腫瘤早期篩查、腫瘤治療等領(lǐng)域具有巨大潛力。