李 玲，龔金炎，袁海娜，方若思，楚秉泉，肖功年,，Namsoo HAN

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2.韓國忠北大學(xué)食品科學(xué)與工程專業(yè)，韓國 忠清北道 清州 28644）

乳酸菌是降解可發(fā)酵性碳水化合物產(chǎn)生乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱。目前，乳酸菌可分為20 個(gè)屬，共有200多種。乳酸菌可作為各種不同發(fā)酵食品的發(fā)酵劑，如酸奶、奶酪和蔬菜發(fā)酵食品[1-3]。其中，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroidesATCC8293）是一種G＋C含量低于50%的異型發(fā)酵乳酸菌。在發(fā)酵過程中產(chǎn)生檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸和芳香族化合物，能夠有效地提升發(fā)酵食品的品質(zhì)，作為發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵食品產(chǎn)業(yè)中[4-6]。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是乳酸菌產(chǎn)生乳酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其催化丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸。根據(jù)催化產(chǎn)物不同，LDH分為D-LDH（EC：1.1.1.28）和L-LDH（EC：1.1.1.27）兩種，分別產(chǎn)生D-乳酸和L-乳酸[7]。LDH也是乳酸菌產(chǎn)生苯乳酸的關(guān)鍵酶，LDH轉(zhuǎn)化苯丙酮酸產(chǎn)生苯乳酸[8]。苯乳酸是一種新型的抑菌物質(zhì)，能夠抑制多種食源性致病菌和真菌。苯乳酸也分為D-苯乳酸和L-苯乳酸，其中D-苯乳酸比L-苯乳酸有更高的抗菌活性[9]。苯乳酸的抑菌譜寬、抑菌能力強(qiáng)，具有良好的溶解性和熱穩(wěn)定性，非常有潛力發(fā)展成一種新型的生物防腐劑用于食品、飼料等領(lǐng)域[10-11]。在前期研究中，從不同乳酸菌中篩選高產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌，其中，腸膜明串珠菌ATCC8293生產(chǎn)苯乳酸的效率達(dá)到80%[12]。結(jié)果表明，腸膜明串珠菌ATCC8293參與苯乳酸代謝的LDH的活性高。腸膜明串珠菌ATCC8293中含有7 種LDH，經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，其中3 種基因LEUM_1756、LEUM_2043、LEUM_0445能夠有效表達(dá)[12]。對LEUM_1756基因已測定酶學(xué)特性，證實(shí)了LEUM_1756是腸膜明串珠菌ATCC8293中的關(guān)鍵LDH。LEUM_2043基因的轉(zhuǎn)錄量和翻譯量是LEUM_1756的70%和40%，表明該基因也能參與乳酸和苯乳酸的生產(chǎn)代謝[13]。因此，對腸膜明串珠菌ATCC8293的次要關(guān)鍵酶LDH（LEUM_2043）進(jìn)行進(jìn)一步研究，為利用腸膜明串珠菌生產(chǎn)乳酸和苯乳酸提供理論依據(jù)。

目前，有關(guān)乳酸菌LDH的酶學(xué)性質(zhì)研究已很多，大多是將基因?qū)氲酱竽c桿菌（Escherichia coli），得到重組純化酶，研究酶學(xué)性質(zhì)。已對來自植物乳桿菌、乳酸片球菌、詹氏乳桿菌的LDH進(jìn)行酶學(xué)特性研究[14-17]。雖然對LDH的研究很多，但是對于腸膜明串珠菌的LDH的研究卻很少，不同LDH性質(zhì)也存在較大差異。本研究將采用基因工程的方法，以腸膜明串珠菌ATCC8293為研究對象，克隆ldh基因，并導(dǎo)入E.coli中表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA柱親和層析進(jìn)行純化。測定純化后酶的比活力，并且研究酶學(xué)性質(zhì)，包括最適pH值和溫度、對不同底物的酶活力及動(dòng)力學(xué)常數(shù)。鑒于其在合成乳酸中的關(guān)鍵作用，可為高效生產(chǎn)乳酸、苯乳酸等有效成分物質(zhì)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

腸膜明串珠菌ATCC8293 美國ATCC微生物菌種保藏中心；E.coliMC 1061、E.coliBL21(DE3)、質(zhì)粒pETDuetTM-1 德國Novagen公司；MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基 美國BD Difco公司。

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA快速回收純化試劑盒、膠回收試劑盒 韓國Bioneer公司；ExTaqDNA聚合酶、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoR I和PstI 日本TaKaRa公司；BCA試劑盒 美國Pierce Biotechnology公司；氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、丙酮酸、D-/L-乳酸、還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、α-酮丁酸、草酰乙酸、苯丙酮酸、2-酮戊二酸、乙酰丙酸 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ni-NTA柱 瑞典GE Healthcare公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀韓國Younglin公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒pETldh的構(gòu)建

以腸膜明串珠菌ATCC8293基因組為模板，用LEUM_2043-N（5’-TTGAATTCAATGAAAATTTTAATG TACAAT-3’）和LEUM_2043-C（5’-TTCTGCAGCCGC AAAATTTCGTTTTC-3’）作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收，同時(shí)在1%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定其分子質(zhì)量大小。純化的ldh基因產(chǎn)物插入到pETDuetTM-1質(zhì)粒（5 420 bp）的EcoR I和PstI酶切位點(diǎn)上，得到表達(dá)質(zhì)粒pETldh（6 394 bp）。將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliMC 1061感受態(tài)細(xì)胞中，在氨芐青霉素質(zhì)量濃度為100 μg/mL的LB培養(yǎng)基中選菌落經(jīng)酶切鑒定后挑取陽性重組子進(jìn)行測序。

1.3.2 組菌pETldh的蛋白表達(dá)及純化

為過表達(dá)重組質(zhì)粒pETldh，將其轉(zhuǎn)化到至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。將E.coliBL21(DE3)/pETldh接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，250 r/min、37 ℃培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.5，加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體發(fā)酵液12 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清液。菌體以裂解液（10 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl、20 mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.4）洗滌，再超聲裂解10 min。將裂解液12 000 r/min、4 ℃離心5 min，上清液作為粗酶液。依據(jù)重組蛋白的His標(biāo)簽，粗蛋白用Ni-NTA柱進(jìn)行親和層析純化。用洗脫液（500 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.4）洗脫，4 ℃保存使用。蛋白樣品經(jīng)變性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析表達(dá)與純化水平。

1.3.3 LDH活力測定

丙酮酸還原反應(yīng)的總反應(yīng)體系3 mL：0.5 mmol/L NADH、10 mmol/L丙酮酸、0.01 mL酶液、0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）。由于反應(yīng)過程中需要輔酶NADH的參與，根據(jù)NADH在340 nm波長處吸光度的減少速率定義酶活力。1 min減少1 μmol NADH所需酶量為1 個(gè)酶活力單位；1 mg酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)（U/mg）為比活力。使用BCA試劑盒測定蛋白含量。

采用HPLC分析該酶的反應(yīng)產(chǎn)物。色譜條件：色譜柱Shodex ORpac CRX853（8.0 mm×50 mm，6 μm）；檢測器：紫外檢測器；流動(dòng)相：1.00 mmol/L CuSO4溶液；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；波長：250 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.4 溫度和pH值對LDH的影響

分別在不同pH值緩沖液測定酶活力，最適pH值定義為最高酶活力（以相對酶活力100%計(jì)）所對應(yīng)的pH值。緩沖液配制如下：pH 6.0～7.0為100 mmol/L磷酸緩沖液，pH 8.0～10.0為100 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 11.0～13.0為100 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。分析溫度對LDH的影響，將反應(yīng)液分別在10、20、30、40、50 ℃進(jìn)行反應(yīng)，最適溫度定義為最高酶活力（以相對酶活力100%計(jì)）所對應(yīng)的溫度。

1.3.5 LDH對不同底物的酶活力及動(dòng)力學(xué)常數(shù)測定

由于LDH具有較寬的底物譜系，因此，選取與丙酮酸結(jié)構(gòu)相似的5 種底物（乙酰丙酸、苯丙酮酸、α-酮丁酸、草酰乙酸、2-酮戊二酸）測定LDH對不同底物的酶活力，以丙酮酸用作底物時(shí)為最高酶活力（以相對酶活力100%計(jì)）。測定LDH分別對丙酮酸及輔酶NADH的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，反應(yīng)在最適溫度和pH值條件下，丙酮酸濃度為1、2、4、5、10 mmol/L（NADH濃度0.5 mmol/L），NADH濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L（丙酮酸濃度10 mmol/L），計(jì)算Km、Vmax、Kcat。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次3 個(gè)平行，采用SigmaPlot 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

利用設(shè)計(jì)的引物對LDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得996 bp的PCR產(chǎn)物。純化的ldh基因產(chǎn)物插入到pETDuetTM-1質(zhì)粒（5 420 bp）的酶切位點(diǎn)上，獲得重組質(zhì)粒pETldh（6 394 bp）。對其進(jìn)行雙酶切之后，在1%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定得到相應(yīng)的目的基因的片段被切出。同時(shí)基因測序結(jié)果與目的基因一致，表明ldh基因成功克隆到pETDuetTM-1質(zhì)粒獲得重組載體pETldh。

2.2 ldh基因誘導(dǎo)表達(dá)分析

將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pETldh轉(zhuǎn)入到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。E.coliBL21(DE3)/pETldh在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對菌體蛋白經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析。未加入IPTG的E.coliBL21(DE3)/pETldh菌體作為對照組。結(jié)果顯示，與對照組相比，重組菌株經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后在分子質(zhì)量約37 kDa處有一條明顯蛋白帶出現(xiàn)，說明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pETldh成功實(shí)現(xiàn)ldh基因的表達(dá)（圖1）。通過Ni-NTA親和層析柱純化后的蛋白條帶單一，與預(yù)測分子質(zhì)量相似。

圖1 重組D-LDH的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purification of expressed LDH

2.3 LDH活力及反應(yīng)產(chǎn)物分析

表1 LDH在純化前后的酶活力Table 1 Summary of LDH purification

如表1所示，LDH粗酶液對丙酮酸的比活力為40.77 U/mg，經(jīng)過純化之后比活力達(dá)到67.45 U/mg。其酶活力遠(yuǎn)低于來自同一種腸膜明串珠菌內(nèi)其他LDH（LEUM_1756）的比活力（4 450 U/mg）[12]，但是相對于來自其他腸膜明串珠菌亞種或其他乳酸菌屬的LDH，其酶活力較高，如來自腸膜明串珠菌NCDO（0.6、0.9 U/mg，2 種基因LDH，下同）、鼠李糖乳桿菌（0.02、0.21 U/mg）的LDH[18-19]。近年來，有研究利用帶有高活性LDH的微生物有效合成乳酸，作為聚乳酸、苯乳酸等物質(zhì)的前提物質(zhì)[20-21]。

利用純化后的LDH催化丙酮酸與NADH反應(yīng)后，用HPLC檢測LDH能否轉(zhuǎn)化丙酮酸生成乳酸，并且確定產(chǎn)生乳酸是D-型或L-型。由圖2a可以看出，D-乳酸和L-乳酸分別在第10分鐘和第8分鐘的保留時(shí)間檢測到。由圖2c可以看出，在第10分鐘左右明顯出現(xiàn)D-乳酸的峰，說明LDH可還原丙酮酸生成D-乳酸的D-LDH。研究表明，腸膜明串珠菌作為主要發(fā)酵劑的蔬菜發(fā)酵中主要產(chǎn)生D-乳酸，是一種生產(chǎn)D-型乳酸或苯乳酸代表性乳酸菌[22-23]。因此，可推測腸膜明串珠菌中含有的LDH中，主要表達(dá)的基因均為D-型ldh。已證實(shí)酶特性的蛋白質(zhì)表達(dá)量高的2 個(gè)ldh基因LEUM_1756和LEUM_2043均表達(dá)為D-LDH。

圖2 LDH還原丙酮酸生成乳酸的HPLCFig.2 HPLC analysis of lactic acid produced from pyruvate with LDH

2.4 LDH的最適pH值和溫度

如圖3a所示，LDH活力在pH 7.0～9.0之間相對穩(wěn)定；在pH值小于6.0或大于10.0時(shí)酶活力顯著降低；在pH 7.0時(shí)具有最大酶活力。其在pH 7.0時(shí)具有相對高活性，這與His-標(biāo)簽純化系統(tǒng)的最適pH值相同，能夠減少純化過程中的復(fù)雜操作。大部分來自乳酸菌的LDH都在pH 6.6～8.0之間相對穩(wěn)定，這與乳酸菌最適生長pH值有關(guān)[24]。如圖3b所示，LDH在30～50 ℃相對穩(wěn)定；在40 ℃時(shí)具有相對高活性；溫度大于50 ℃時(shí)顯著降低；60 ℃之后，相對酶活力降到60%以下。來自同種腸膜明串珠菌內(nèi)其他LDH（LEUM_1756）和其他乳酸菌的D-LDH相比，其酶對溫度穩(wěn)定性范圍相對較寬[25-26]。

圖3 pH值（a）和溫度（b）對LDH活力的影響Fig.3 Effects of pH (a) and temperature (b) on LDH activity

2.5 不同底物酶活力及動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表2 LDH對不同底物的相對酶活力Table 2 Relative activity of LDH with different substrates

表2結(jié)果顯示，LDH對多種底物的催化能力不同，大小順序?yàn)椴蒗Ｒ宜幔颈奖幔睛?酮丁酸＞2-酮戊二酸。腸膜明串珠菌LDH對不同底物的相對酶活力與發(fā)酵乳桿菌LDH很相似[27]。其中，對草酰乙酸（16.19 U/mg）和苯丙酮酸（11.47 U/mg）的催化能力較強(qiáng)，對其他底物的催化能力很低，如對α-酮丁酸和2-酮戊二酸的活力為8.09 U/mg和1.35 U/mg。來自腸膜明串珠菌的LDH對苯丙酮酸的活力高于來自詹氏乳桿菌的LDH（7、9 U/mg），證實(shí)了腸膜明串珠菌ATCC8293苯乳酸生產(chǎn)率優(yōu)于其他乳酸菌菌種[17]。但是，其對α-酮丁酸的活力低于來自詹氏乳桿菌的LDH（41、68 U/mg）[17]。利用LDH對其他底物的特性，已成功實(shí)現(xiàn)苯乳酸、羥基丁酸等有效成分的高效生物合成[28-29]。

以丙酮酸和NADH為底物，在該酶最適反應(yīng)條件下測定酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。LDH對丙酮酸和NADH的Km分別為1.27 mmol/L和0.48 mmol/L，對于丙酮酸的Kcat和Kcat/Km分別為421 s-1和3.31×105L/（mol·s）。雖然本研究測定的D-LDH的Kcat/Km值比來自同種腸膜明串珠菌的另一種D-LDH（LEUM_1756）值低，但是比來自其他乳酸菌如詹氏乳桿菌、乳酸片球菌的LDH的值高出3 倍和2 倍多[25,30]。結(jié)果表明，來自腸膜明串珠菌的D-LDH對丙酮酸的親和力和催化效率高，有利于利用腸膜明串珠菌生產(chǎn)D-乳酸及D-苯乳酸具有潛力。

3 結(jié) 論

本研究以腸膜明串珠菌ATCC8293基因組為模板，成功構(gòu)建了攜帶乳酸和苯乳酸合成途徑關(guān)鍵酶ldh基因的重組表達(dá)載體pETldh，實(shí)現(xiàn)其在E.coliBL21(DE3)中的高效異源表達(dá)。與其他乳酸菌LDH的酶學(xué)性質(zhì)比較，腸膜明串珠菌LDH具有高的比活力，是轉(zhuǎn)化丙酮酸為D-乳酸的D-LDH，并且對丙酮酸底物的親和力和催化效率遠(yuǎn)大于其他乳酸菌LDH。此外，其對pH值和溫度穩(wěn)定性范圍相對較寬。本研究進(jìn)一步提供了利用腸膜明串珠菌高效生產(chǎn)乳酸和苯乳酸的理論依據(jù)。