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        TYP-5豬冷凍精液試劑使用方法

        2020-09-17 09:02:16金穗華農(nóng)業(yè)部牛冷凍精液質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心南京
        中國畜牧業(yè) 2020年10期
        關(guān)鍵詞:細(xì)管凍精保護(hù)劑

        文│金穗華[農(nóng)業(yè)部牛冷凍精液質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南京)]

        豬冷凍精液可以長期保存,能顯著提高種公豬利用率,擴(kuò)大其基因傳播范圍,同時也是豬遺傳資源生物技術(shù)靜態(tài)保存的主要方法之一。在豬冷凍精液生產(chǎn)過程中,選擇合適的冷凍保護(hù)劑對改善解凍后精子復(fù)蘇率、活力、頂體完整率、存活時間、畸形率等精液質(zhì)量指標(biāo)至關(guān)重要。

        自制豬冷凍精液試劑簡單方便,可以按照需要的數(shù)量隨時配制。自制試劑大多使用BTS(beltsville thawing solution)配方,該配方為EDTA 0.125克,檸檬酸三鈉0.6克,氯化鉀0.075克,碳酸氫鈉0.125克,葡萄糖3.7克,青霉素鈉0.06克,硫酸鏈霉素0.1克,純化水100毫升。應(yīng)用BTS配方生產(chǎn)的冷凍精液解凍后精子復(fù)蘇率達(dá)到50%左右,頂體完整率能達(dá)到40%。

        國內(nèi)市面上效果較好、使用較多的豬冷凍精液保護(hù)劑為TYP-5田園奧瑞豬凍精試劑套裝。TYP-5田園奧瑞豬凍精試劑套裝2018年上市,性能穩(wěn)定高效,所生產(chǎn)的豬冷凍精液復(fù)蘇率達(dá)到70%~90%,頂體完整率60%~80%,廣泛應(yīng)用于豬冷凍精液商品化生產(chǎn)和地方品種豬冷凍精液保種。凍精試劑的正確使用方法和步驟至關(guān)重要,使用不當(dāng)可能導(dǎo)致精子“全軍覆沒”。

        一、TYP-5豬冷凍精液試劑介紹

        1.TYP-5豬冷凍精液試劑組成。TYP-5豬冷凍精液試劑套裝含有A、B、C、D、E五種精液冷凍不同階段的成分,分別為:A為預(yù)稀釋劑、B為冷凍冷藏基礎(chǔ)營養(yǎng)液、C和D為冷凍輔助劑、E為解凍劑。B+蛋黃對應(yīng)為冷藏保護(hù)劑、B+C+D+蛋黃對應(yīng)為冷凍保護(hù)劑。其中,預(yù)稀釋劑和解凍劑為冷凍精液專用,有別于常溫豬精液稀釋粉(表1)。

        表1 TYP-5豬冷凍精液試劑套裝組成表

        二、TYP-5豬冷凍精液試劑使用方法

        1.采精預(yù)稀釋。將豬凍精試劑A溶于1升雙蒸水中,充分混勻,預(yù)熱至37℃,將鮮采原精稀釋一倍。一袋豬凍精試劑A稀釋3~4頭份種公豬精液。同時,檢測原精質(zhì)量,記錄密度、體積、活率(運(yùn)動精子率)、活力(前向運(yùn)動精子率)和畸形率,用于凍精的精液活率應(yīng)在90%以上,活力在80%以上,畸形率在10%以下。(每袋豬凍精試劑A拆開后為成分不同、質(zhì)量也不相同的A1和A2兩小包,必須同時使用)。

        2.將稀釋后的鮮精于室溫(25℃)靜置1小時,轉(zhuǎn)入17℃恒溫箱,平衡2~3小時,最長不超過24小時。有條件的推薦使用程控平衡儀,可以程序化精準(zhǔn)控制降溫溫度、降溫時間、降溫速率等。

        3.將一瓶豬凍精試劑B溶于400毫升雙蒸水中,充分溶解,制成基礎(chǔ)液,稀釋6~8頭份種公豬精液。

        4.取新鮮雞蛋,去蛋清,將完整蛋黃置于滅菌無絨吸水紙上,將剩余蛋清吸凈,用注射器抽取蛋黃100毫升,加入配好的基礎(chǔ)液中,充分混勻,制成I液。

        5.取I液276毫升,加入豬凍精試劑C(18毫升),豬凍精試劑D(6毫升),制成Ⅱ液300毫升。

        6.將I液置于17℃、Ⅱ液置于4℃恒溫箱冷藏,待用。

        7.鮮精充分平衡后,搖勻,防止精子假死,17℃條件下800~900克離心10~15分鐘,去掉上清液。離心前記錄離心瓶重W0(克),去上清后,離心瓶加精子重W1(克),估得精子體積V1(毫升)=W1-W0。

        筆者提出了一種新型綜掘巷道新型超前支護(hù)設(shè)備,具有高度和寬度可伸縮調(diào)整、適應(yīng)不同巷道截面尺寸等功能,并利用特殊結(jié)構(gòu)處理的伸縮梁與頂梁,使得支架在展開時能夠與頂板良好接觸。同時論述了該裝備的關(guān)鍵組成部分,即超前支架的結(jié)構(gòu)及工作原理,并進(jìn)行了應(yīng)力分析,分析的結(jié)果為綜掘巷道超前支護(hù)提供了技術(shù)支撐。

        8.用17℃的I液重懸浮精子,使精子密度達(dá)到20億/毫升。在離心較為徹底的情況下可以忽略上清中的精子,但若離心不徹底,上清精子較多,則總精子應(yīng)該減去上清中的部分,即加入I液的體積V2=原精總精子數(shù)(億)-上清液體積(毫升) ×上清液精子密度(億/毫升)/20(億/毫升)-V1(毫升)。若精清分離不徹底,可能會使V2/V1過小,甚至出現(xiàn)負(fù)值,影響精液后續(xù)的降溫,此時應(yīng)調(diào)低凍精目標(biāo)密度,或者重新離心,使得V2/V1≥1。

        9.I液重懸浮后的精子置于盛有17℃水的燒杯中,于4℃冰箱或低溫操作柜中降溫平衡,注意用溫度計監(jiān)測溫度,使精液在2.5~3小時緩慢降溫至4~5℃,并在4~5℃平衡0.5~1小時。有條件的推薦使用程控平衡儀,可以程序化精準(zhǔn)控制降溫溫度、降溫時間、降溫速率等。

        10.精液在4℃平衡后,加入Ⅱ液,稀釋一倍,其體積V3=V1+V2?;靹蚝罅⒓丛诘蜏夭僮鞴裰羞M(jìn)行0.5毫升細(xì)管灌裝操作,并在細(xì)管托架上碼好。

        11.在精液進(jìn)行0.5毫升細(xì)管灌裝的同時啟動程序冷凍儀,將腔室溫度降至4~5℃。另一邊同時將兩個水浴鍋分別設(shè)置50℃和30℃(26~32℃),并按照需要量每20毫升雙蒸水溶解1克豬凍精試劑E,于30℃(26~32℃)水浴鍋預(yù)熱備用。

        12.灌裝完畢后,迅速將碼好的細(xì)管精液放入冷凍儀中,設(shè)置豬冷凍精液降溫曲線,啟動冷凍程序,待程序跑完后取出冷凍精液細(xì)管浸入液氮中。冷凍降溫速率控制在4℃至1℃為1.5℃/分鐘,1℃以后降溫速率達(dá)到-30℃/分鐘。如果使用熏蒸法手工制作,精液細(xì)管所在位置溫度控制在-120~-80℃。

        三、TYP-5豬冷凍精液解凍劑使用方法

        1.每頭豬至少取2支細(xì)管解凍進(jìn)行檢測。細(xì)管在50℃解凍16秒,剪去細(xì)管兩端,將精液移入4毫升離心管中,用預(yù)熱好的解凍稀釋液稀釋。

        2.冷凍精液在3 0℃(26~32℃)恢復(fù)15~20分鐘后在顯微鏡下檢測凍精解凍后質(zhì)量。同時,根據(jù)解凍情況決定精液是否留存。

        3.將決定留存的精液裝入拇指管和紗布袋中,轉(zhuǎn)入液氮罐儲存,并做好標(biāo)記。標(biāo)記信息至少包括日期和豬號。

        4.輸精時,解凍精液用配好的解凍稀釋液稀釋約10倍,在30分鐘內(nèi)進(jìn)行子宮深部輸精,建議一個輸精劑量的有效精子總數(shù)不低于同等條件下的鮮精有效精子總數(shù)。

        四、TYP-5豬冷凍精液試劑保存

        1.儲存環(huán)境最好為陰涼干燥,避免高溫和潮濕。長期儲存2~8℃;短期儲存于室溫保存。

        2.有效期。6個月。

        五、TYP-5豬冷凍精液試劑使用注意事項

        1.凍精試劑開封后盡快使用。

        2.避免高溫和反復(fù)凍融。

        3.使用新鮮雞蛋卵黃。

        4.豬凍精試劑D冷藏會出現(xiàn)結(jié)晶,使用前可用30~40℃溫水加熱使之重新溶解。

        受非洲豬瘟疫情及新冠肺炎疫情影響,豬鮮精運(yùn)輸調(diào)配受阻和生物安全隱患影響到生豬生產(chǎn)的繁殖需求,豬冷凍精液長期保存的特點(diǎn)恰好可以有效彌補(bǔ)繁殖的短板。目前,豬冷凍精液技術(shù)研究越來越多并逐步進(jìn)入商品化生產(chǎn)應(yīng)用階段,科學(xué)配制更優(yōu)化的冷凍精液試劑配方,提高精子抗氧化和抗凍耐凍能力,改善精子凍后活力質(zhì)量,有助于豬冷凍精液的推廣應(yīng)用,對加快恢復(fù)生豬生產(chǎn)、大力推動養(yǎng)殖業(yè)轉(zhuǎn)型升級具有重要意義和重大價值。

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