曹 華，馮美果，侯 帥，魏科祥

(1.咸寧市中心醫(yī)院，湖北 咸寧 437100； 2.西安市第一醫(yī)院，陜西 西安 710002)

隨著人們對生活質(zhì)量要求的不斷提高，女性圍絕經(jīng)期(perimenopausal period)的相關(guān)癥狀日益受到關(guān)注，其中睡眠障礙是圍絕經(jīng)期的主要癥狀之一[1]，嚴重危害女性的健康。目前循證醫(yī)學對失眠的主要治療方法是口服具有鎮(zhèn)靜、催眠作用的藥物，以達到強制入睡的目的，但是這類藥物不但改變了生理性的睡眠結(jié)構(gòu)，同時還造成了一系列不良反應。中醫(yī)學在治療失眠方面具有獨特的療效，尤其是針灸治療，配穴方法多樣，臨床效果顯著[2-3]。

本研究采用去卵巢配合電刺激的方法復制大鼠圍絕經(jīng)期失眠模型，并采用目前臨床常用的神門、四神聰配穴進行治療，觀察該方法對大鼠睡眠時相的影響，并通過其對腦脊液(Cerebrospinal Fluid，CSF)中前列腺素D2(PGD2)系統(tǒng)及下丘腦腹外側(cè)視前核(VLPO)中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的影響，來探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠30只，雌性，5～7月齡，體質(zhì)量(250 g±20)g，清潔級，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.1.2 試劑與儀器 “華佗牌”針灸針(0.35 mm×25 mm,蘇州醫(yī)療用品有限公司)；大鼠失眠刺激器(哈爾濱電工儀表研究所)；G6805型電針治療儀(上海醫(yī)用電子儀器廠)；多道生理記錄儀(美國Biopac公司)；大鼠腦立體定位儀(美國Stoelting公司)；大鼠Elisa試劑盒(L-PGDS、PGD2、PGE2，R&D Systems，Inc)，YN-05MY型全自動免疫組化染色系統(tǒng)(深圳市永年科技有限公司)，HBS-1096A全自動酶標儀(北京華泰和合有限公司)。

1.2 分組

30只實驗大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀上，剪開頭部毛皮層，鈍性剝離筋膜，暴露頭骨，脫脂棉擦拭，保持頭骨暴露部位表面干燥，用腦立體定位儀分別在(坐標：AP-2,R2；AP+2,R2)用牙科電鉆鉆孔，并植入金屬探針，使之與硬腦膜接觸，但不穿透硬腦膜為宜[4-5]。將肌電電極植入頸部(近顱骨處)肌肉，用牙科水泥固定微型插座，縫合毛皮層，腹腔注射青霉素4萬U/d，連續(xù)5 d，恢復21 d后，按照體質(zhì)量區(qū)組化隨機分為3組：假手術(shù)組、模型組與電針組，每組10只。

1.3 模型復制

模型組和電針組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，仰位固定，剪開腹部毛皮層，鈍性剝離肌肉層，結(jié)扎雙層輸卵管后，切除雙側(cè)卵巢，逐層縫合肌肉層及毛皮層[6]，腹腔注射青霉素4萬U/d，連續(xù)5 d后，恢復21 d(手術(shù)恢復5 d后，逐只檢查雌性大鼠陰道涂片，連續(xù)5 d，以不出現(xiàn)角化細胞為卵巢摘除成功的標志)。假手術(shù)組大鼠按照上述手術(shù)操作，不結(jié)扎，亦不切除卵巢。將3組大鼠置于電刺激器中，8 h連續(xù)電刺激足底(電流：0.5 mA，波寬：15 ms，頻率：1 Hz，每隔30 min刺激30 s)后，采用多道生理記錄儀監(jiān)測大鼠12 h肌電圖和腦電圖(8:00—20:00)。

1.4 電針方法

電針組大鼠在模型復制的同時(卵巢摘除手術(shù)后第6天)開始針刺治療，每日1次，連續(xù)治療21 d，電針神門、四神聰穴位，平刺4～5 mm后連接電針治療儀，頻率：50次/s，調(diào)整刺激強度使大鼠針刺局部肌肉輕微抽搐，并保持大鼠相對安靜為度，每次15 min。假手術(shù)組和模型組大鼠每日同時進行抓放操作，但不進行電針刺激。

1.5 生化檢測

1.5.1 酶聯(lián)免疫法測定CSF中L-PGDS、PGD2、PGE2水平 各組大鼠肌電圖和腦電圖監(jiān)測后，將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，用腦立體定位儀固定，采用微量注射器于枕骨大孔處傾斜45°進針0.3～0.4 cm，抽取大鼠腦脊液100 μL，采用Elisa方法測定腦脊液中前列腺素D2(Prostaglandin D2，PGD2)、L型前列腺素D合成酶(L-PGD synthetase，L-PGDS)、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)的濃度。

1.5.2 免疫組化法檢測VLPO部位GABA的表達 腦脊液采樣后，將實驗大鼠斷頭取腦，在冰浴上分離大鼠下丘腦VLPO部位。將VLPO組織包埋后，進行冠狀連續(xù)冰凍切片，切片厚度40 μm，用ABC法進行免疫組化染色，加入兔抗鼠c-fos(1∶1 000)抗體，在37℃條件下孵育2 h，采用生物素標記羊抗兔IgG，在37℃條件下溫育1.5 h，復合物同樣在37℃溫育1 h后，DAB顯色。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 實驗結(jié)果

2.1 電針神門、四神聰對失眠大鼠各睡眠時相持續(xù)時間的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LS、SWS、REMS和TS均明顯縮短(P<0.05)；與模型組相比，電針組大鼠SWS和REMS顯著延長(P<0.05)，LS、TS雖有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05) 。見表1。

表1 電針神門、四神聰對失眠大鼠各睡眠時相持續(xù)時間的影響

2.2 電針神門、四神聰對失眠大鼠各睡眠時相所占比例的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠REMS所占睡眠總時間的比例顯著降低(P<0.05)，LS和SWS所占比例變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組相比，電針組大鼠REMS所占睡眠總時間的比例明顯升高(P<0.05)，LS和SWS所占比例變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 電針神門、四神聰對失眠大鼠各睡眠時相所占比例的影響

2.3 電針神門、四神聰對失眠大鼠腦脊液中L-PGDS、PGD2、PGE2水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠CSF中L-PGDS、PGD2水平明顯降低，PGE2顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，電針組大鼠CSF中L-PGDS、PGD2水平顯著升高(P<0.05)，PGE2水平雖有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 電針神門、四神聰對失眠大鼠CSF中L-PGDS、PGD2、PGE2水平的影響

2.4 電針神門、四神聰對失眠大鼠下丘腦VLPO部位GABA表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠VLPO部位GABA神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著下降(P<0.05)。與模型組相比，電針組大鼠VLPO部位GABA神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、表4。

表4 電針神門、四神聰對失眠大鼠腦VLPO部位GABA表達的影響

3 討論

女性絕經(jīng)后，體內(nèi)雌激素水平的斷崖式下跌是圍絕經(jīng)期綜合征的主要病因[7]。睡眠障礙是圍絕經(jīng)期的常見癥狀，中醫(yī)學認為睡眠障礙屬于不寐范疇，《難經(jīng)·四十六難》中闡明了睡眠障礙的病機，“血氣衰，肌肉不滑，榮衛(wèi)之道澀，故晝?nèi)詹荒芫?，夜不得寐也”，因此治療當以順氣機、滋心陰、安神定志為主[8]。針灸對于情志因素導致的失眠，療效獨特。神門穴屬手少陰心經(jīng)，位于尺側(cè)腕屈肌與指淺屈肌之間，匯集前臂內(nèi)側(cè)皮神經(jīng)和尺側(cè)神經(jīng)，中醫(yī)認為，神門是心經(jīng)之原穴，為心氣出入之門戶，針刺神門可養(yǎng)心安神，為治療失眠的主要穴位，臨床常用于治療驚悸、怔仲、失眠、健忘等神志病證；四神聰屬經(jīng)外奇穴，位于百會四周各1寸，共有四穴，匯集枕大神經(jīng)、耳顳神經(jīng)及眶上神經(jīng)的分支，中醫(yī)認為，四神聰位于督脈，循行線上督脈入絡于腦，具有調(diào)神醒腦開竅之功，可通過調(diào)節(jié)大腦功能失衡狀態(tài)，以改善睡眠，臨床常用于治療失眠、健忘、眩暈、頭痛等[9-10]。電針神門、四神聰、具有協(xié)同入眠、調(diào)節(jié)自律神經(jīng)、補益心氣、安定心神的作用。

摘除大鼠雙側(cè)卵巢是經(jīng)典的復制圍絕經(jīng)期大鼠模型的方法[11]，廣泛用于動物實驗中。睡眠障礙不僅包括入睡困難，還包括嗜睡、睡眠質(zhì)量差、多夢、易醒、醒后疲勞等。睡眠時相是常用的分析實驗動物睡眠結(jié)構(gòu)的方法，其中SWS期睡眠主要緩解軀體疲勞，REMS期睡眠對大腦疲勞的恢復有著十分重要的意義，LS屬于淺睡眠是由覺醒向深睡眠過渡的階段，相對而言，對機體的作用不如SWS期睡眠和REMS期睡眠關(guān)鍵[12]。本研究中，電針組大鼠SWS和REMS顯著延長，REMS所占TS的比例亦顯著提高，結(jié)果表明，電針治療不僅增加了去卵巢失眠大鼠緩解軀體、大腦疲勞睡眠的時間，同時還部分恢復了大鼠的生理性睡眠結(jié)構(gòu)。

PGD2最早是在1973年被發(fā)現(xiàn)的PGs家族成員，是一種包含有20個碳的不飽和脂肪酸，近年研究表明，其與睡眠的關(guān)系十分密切[13]。經(jīng)典的實驗研究表明，將PGD2注射入猴第3腦室后，發(fā)現(xiàn)SWS期睡眠和REMS期睡眠時間明顯延長[14]，這與本研究的結(jié)果相對應，由此可見腦內(nèi)PGD2是內(nèi)源性的促進睡眠物質(zhì)。PGE2同樣是體內(nèi)主要的PGs之一，其為脂類炎性介質(zhì)，具有較高的生物活性，體內(nèi)合成底物是花生四烯酸，由PGE2合成酶和過氧化酶聯(lián)合催化而成[15]，在體內(nèi)屬于內(nèi)源性的促進覺醒物質(zhì)[16]。腦內(nèi)的PGD2和PGE2的動態(tài)平衡對維持生理性的睡眠-覺醒具有重要的意義[17]。PGDS是PGD2合成的關(guān)鍵酶，PGDS又可分為2種亞型:H-PGDS和L-PGDS。H-PGDS的主要作用是催化外周PGD2的合成，而在中樞PDG2主要由L-PGDS催化產(chǎn)生，因此腦內(nèi)的L-PGDS是調(diào)節(jié)睡眠覺醒周期的關(guān)鍵物質(zhì)。中樞的PGD2與受體結(jié)合后，通過調(diào)節(jié)基底前腦細胞外腺苷激活VLPO部位增加GABA的表達抑制中樞興奮促進睡眠[18]。由此可知，GABA是一種中樞抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[19]，局部含量升高具有促進睡眠的作用。本研究中，電針組大鼠CSF中L-PGDS、PGD2水平顯著升高，VLPO部位GABA的表達也顯著增加，結(jié)果可見，電針治療后大鼠CSF中促睡眠物質(zhì)明顯增加，且部分恢復了PGD2-PGE2的動態(tài)平衡，進而對大鼠生理性睡眠結(jié)構(gòu)的改善發(fā)揮明顯的促進作用。

綜上，電針神門、四神聰可以顯著改善去卵巢大鼠的睡眠質(zhì)量，其作用機制與增加CSF中促睡眠物質(zhì)、部分恢復PGD2-PGE2的動態(tài)平衡以及增加PGD2下游信號通路中VLPO部位抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的表達有關(guān)。