孫 嬌，梁靖蓉，曾天笑，郝曉敏，黃佩怡，劉清國

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

原發(fā)性高血壓(Essential hypertension,EH)是一種臨床常見、高發(fā)的慢性疾病。2018年最新修訂的《中國高血壓防治指南》指出，我國人群高血壓的患病率仍呈升高趨勢，知曉率、治愈率和控制率分別為51.6%、45.8%和16.8%，總體仍處于較低水平[1]。除此之外，高血壓可導(dǎo)致心、腦、腎重要器官損傷，嚴(yán)重者可致死或致殘，因此防治高血壓、保護(hù)靶器官具有重要意義。研究表明，針刺治療高血壓效果顯著，施以捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法在降壓的同時可以通過不同生物學(xué)途徑起到臟器保護(hù)作用[2-5]。然而，針刺治療高血壓的中樞機(jī)制研究較少，需要深入挖掘其相關(guān)機(jī)制。在中樞各靶腦區(qū)中，海馬在高血壓初始階段即出現(xiàn)功能紊亂、形態(tài)改變等病理變化[6]，并且相關(guān)研究表明海馬對下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)( Hypothalamus-pituitary-adrenal cortex,HPA)軸具有抑制作用，從而產(chǎn)生降壓作用[7],且海馬中糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)在對HPA軸調(diào)控中起到關(guān)鍵作用[8]。因此，本研究通過觀察自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法干預(yù)下海馬形態(tài)變化、GR及HPA軸各組分，即皮質(zhì)醇(CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)表達(dá)的影響，探討針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法調(diào)控血壓的中樞-外周機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)48只，WKY大鼠16只，均為雄性，9周齡，體質(zhì)量(220±30)g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。所有大鼠均給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲食和進(jìn)水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用完全隨機(jī)數(shù)字表法，將48只SHR等分為模型組、針刺補(bǔ)法組、針刺瀉法組，每組16只，16只WKY大鼠作為空白組。所有實驗操作均按照世界衛(wèi)生組織“涉及動物生物醫(yī)學(xué)研究國際指導(dǎo)原則”進(jìn)行，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物保護(hù)與使用委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：BUCM-4-2018061501-2058)。

1.2 儀器與試劑

中研太和牌針灸針(規(guī)格：0.18 mm×13 mm，北京中研太和醫(yī)藥有限公司)；ACX-XM計重電子秤(上海升亮電子科技有限公司)；無創(chuàng)血壓儀(BP-6，成都泰盟科技有限公司)；顯微鏡(自動化智能型正置研究級顯微鏡，BX53,日本奧林巴斯)；高速冷凍離心機(jī)(20PR-52D,日本日立)；全自動多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，Thermo公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津泰斯特)；自動洗板機(jī)(thermo，USA)；酶聯(lián)免疫試劑盒(貨號：E02G0359、E02A0005、E02C0372、E02C0008，BG公司)。

1.3 針刺干預(yù)

針刺各組均取“太沖穴”(雙側(cè))，于后肢足背1、2趾骨間凹陷處取“太沖穴”，取穴參照《實驗針灸學(xué)》教材[9]。針刺操作由同一人于每日下午2：00—4：00操作完成。具體操作：①捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組：以右手為刺手，直刺雙側(cè)太沖穴1～2 mm，行捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法，持續(xù)3 min，留針20 min,持續(xù)針刺15 d。②捻轉(zhuǎn)瀉法組：以右手為刺手，直刺雙側(cè)太沖穴1～2 mm，行捻轉(zhuǎn)瀉法，其余操作同捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組。③空白組與模型組：每日只進(jìn)行與針刺各組相同的抓捉、固定，并維持20 min。持續(xù)15 d。

1.4 指標(biāo)檢測方法

1.4.1 血壓測量 各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在室溫(22±2)℃條件下，將清醒狀態(tài)下的大鼠置于專用鼠籠中，暴露其尾部，調(diào)節(jié)溫控器恒定約36℃，用無創(chuàng)血壓儀測量大鼠尾動脈收縮壓，連續(xù)測量3次，取其均值。于針刺前1 d，針刺后第3、6、9、12、15 d測量血壓。

測量血壓注意事項：①無創(chuàng)血壓儀應(yīng)提前預(yù)熱，大鼠置于鼠籠中不超過15 min，避免因加熱時間過長而致缺氧死亡；②操作時動作宜輕柔，環(huán)境應(yīng)保持安靜，避免激惹大鼠，以免因操作不當(dāng)而影響血壓;③每次測量血壓時間應(yīng)保持一致，于上午8:00—12:00完成測壓。

1.4.2 HE染色觀察海馬形態(tài)學(xué)變化 針刺治療結(jié)束后，各組隨機(jī)取6只大鼠，用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，進(jìn)行甲醛灌注。大鼠斷頭取下海馬，移入4%、4℃多聚甲醛固定24 h，修塊后充分水洗、脫水、石蠟包埋切片，HE染色后，光鏡下觀察海馬組織病理變化。

1.4.3 ELISA法檢測海馬GR、HPA軸各組分含量表達(dá)變化 將每組剩余10只大鼠，在10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉狀態(tài)下斷頭，腹主動脈取血，斷頭取海馬。經(jīng)4℃ 0.9%氯化鈉溶液漂洗后，濾紙吸干，在冰浴中制成勻漿，4℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液。采用ELISA法測定海馬組織GR、血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(CORT)的變化，操作程序嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療前后收縮壓比較

與空白組比較，其它各組大鼠尾動脈收縮壓在針刺前及針刺后15 d均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，治療第6天，瀉法組收縮壓明顯下降(P<0.05)；治療第9天，補(bǔ)法組收縮壓明顯下降(P<0.05)，瀉法組收縮壓顯著下降(P<0.01)；治療第15天，補(bǔ)法組收縮壓顯著下降(P<0.01)。與補(bǔ)法組比較，治療第12天，瀉法組收縮壓明顯更低(P<0.05)；治療第15天，瀉法組收縮壓顯著更低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠治療前后尾動脈收縮壓比較

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，空白組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞間隙正常，核仁清晰；模型組染色變淺，神經(jīng)元萎縮，排列疏松，出現(xiàn)核固縮；補(bǔ)法組神經(jīng)元丟失，細(xì)胞形態(tài)改變，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)退化；與補(bǔ)法組比較，瀉法組神經(jīng)元較緊密，核仁清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)變化(HE,400×)

2.3 各組大鼠海馬GR變化

與空白組比較，模型組大鼠海馬GR的表達(dá)明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，補(bǔ)法組和瀉法組大鼠海馬GR表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與補(bǔ)法組比較，瀉法組海馬GR表達(dá)降低更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？傮w結(jié)果顯示，各組大鼠海馬GR表達(dá)由小到大依次為空白組<瀉法組<補(bǔ)法組<模型組。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬GR變化

2.4 各組大鼠HPA軸各組分含量變化

與空白組比較，模型組大鼠血漿ACTH、CORT、CRH均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，補(bǔ)法組和瀉法組大鼠ACTH、CORT、CRH均明顯下降(P<0.05或P<0.01)；與補(bǔ)法組比較，瀉法組大鼠ACTH、CRH下降更明顯(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠HPA軸各組分含量變化

3 討論

自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)被認(rèn)為是研究高血壓理想的動物模型，與人類高血壓發(fā)病極其相似[10]。通過對SHR大鼠證侯特征進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠與正常大鼠比較，具有肝陽上亢的表現(xiàn)，與人類原發(fā)性高血壓疾病肝陽上亢證較為接近，表現(xiàn)為易激惹、煩躁等特征[11]?！疤珱_穴”為肝經(jīng)原穴，針刺太沖穴可以起到平肝潛陽作用。此外，《靈樞·經(jīng)脈》記載：“肝足厥陰之脈……上出額，與督脈會于巔”，故肝腦相通，這為本實驗研究高血壓中樞降壓機(jī)制提供理論依據(jù)。因此本實驗選用針刺SHR大鼠雙側(cè)太沖穴的干預(yù)方法，并根據(jù)其發(fā)病特征，研究相關(guān)降壓機(jī)制。

由于高血壓的影響，SHR腦組織形態(tài)會逐漸發(fā)生病理改變，且隨血壓升高而不斷加重[12]。高血壓初始階段，SHR即出現(xiàn)海馬區(qū)功能紊亂、形態(tài)改變、神經(jīng)元丟失等病理變化[13]。SHR大鼠易激惹，可導(dǎo)致HPA軸功能亢進(jìn)，產(chǎn)生皮質(zhì)醇(CORT)類糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致海馬損傷。而海馬又是HPA軸的高位調(diào)節(jié)中樞，海馬中糖皮質(zhì)激素受體(GR)具有興奮HPA軸作用[14]，從而引起血壓升高。通過減少CORT產(chǎn)生，可減輕海馬損傷[8]，同時降低血壓。此外，GR與糖皮質(zhì)激素結(jié)合，還可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖, 血管阻力增加, 血壓上升[15]。在HPA軸的調(diào)節(jié)過程中，當(dāng)下丘腦接受高位中樞信息時，可合成和分泌促垂體腎上腺皮質(zhì)釋放激素(CRH),CRH作用于垂體可使其分泌腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH),ACTH使腎上腺皮質(zhì)分泌皮質(zhì)醇(CORT)[16]。CORT又可加強(qiáng)去甲腎上腺素對心血管收縮、提高心搏出量和左心指數(shù)，使血壓升高[17]。

因此，本實驗以海馬為切入點，以不同針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法針刺SHR大鼠雙側(cè)太沖穴為干預(yù)手段，運用HE染色及Elisa實驗方法，觀察捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法對海馬形態(tài)、GR及HPA軸各組分表達(dá)的影響，探討捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法調(diào)控血壓的中樞-外周降壓機(jī)制。本研究結(jié)果顯示：①針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法能明顯降低SHR血壓，且捻轉(zhuǎn)瀉法降壓效果更顯著;②HE染色提示針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法能減輕SHR大鼠海馬組織損傷，對海馬神經(jīng)元起到保護(hù)作用;③針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法可以通過減少GR表達(dá)，從而抑制HPA軸各組分表達(dá)，達(dá)到降壓效果。綜上，筆者推斷針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法可以通過良性調(diào)控海馬GR及HPA軸各組分表達(dá)，達(dá)到降壓作用，這可能是中樞-外周降壓機(jī)制之一。