王敬珅，郝志強(qiáng)，楊 恒，汪 淵，李永樂，錢 彪，鄭麗英，冷 欣，王艷軍，張志強(qiáng)

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江西 贛州 341000；3贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科研管理科，江西 贛州 341000；4新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第九師醫(yī)院泌尿外科，新疆 塔城 834601；5新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十三師紅星醫(yī)院泌尿外科，新疆 哈密 839000；6新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第七師醫(yī)院泌尿外科，新疆 奎屯 833200)

納米細(xì)菌(Nanobacteria，NB)是直徑為納米級(jí)的革蘭陰性菌，呈球桿狀，無莢膜和鞭毛[1-3]。Kajander研究發(fā)現(xiàn)95%以上腎結(jié)石患者的血液、尿液和結(jié)石中存在NB[4]。由于體內(nèi)NB的清除是通過腎臟完成的，且NB具備生物礦化能力，可黏附血液中的鈣磷離子形成結(jié)石，因此，關(guān)于NB與腎結(jié)石形成的研究越來越成為熱點(diǎn)[5-7]。

褚浩等證明了NB可通過早期損傷腎臟誘導(dǎo)結(jié)晶形成[8]。腎小管損傷是結(jié)石形成的重要原因，損傷后基底膜暴露于小管液中，細(xì)胞的晶體黏附性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞與細(xì)菌的黏附量增加，從而形成結(jié)石[7,9]。劉鑫總結(jié)認(rèn)為是氧自由基介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，胞膜破壞，細(xì)胞碎片脫落入管腔，促進(jìn)了鈣鹽晶體的聚集、成核和生長[10]。本試驗(yàn)研究探討氧自由基與腎結(jié)石形成的關(guān)系，并探究四環(huán)素是否有助于腎結(jié)石的防治。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器：人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購自武漢大學(xué)保藏中心。DMEM培養(yǎng)基，1640培養(yǎng)基，胎牛血清，PBS緩沖液，一水草酸鈣(Calcium oxalate monohydrate,COM)，納米級(jí)羥基磷灰石(Nanograde hydroxuapatite,nHAP)，四環(huán)素，過氧化氫(H2O2)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、Na+/K+ATP酶試劑盒、Ca2+/Mg2+ATP酶試劑盒，phalloidin-FITC。細(xì)胞孵育箱，倒置相差顯微鏡，透射電子顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡，酶標(biāo)儀。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2NB培養(yǎng)與鑒定：于新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科收集臨床確診腎結(jié)石且未應(yīng)用藥物或手術(shù)治療患者的尿液，將無菌條件下獲得的尿液2 ml用生理鹽水稀釋5倍，4℃離心45 min(14 000 g)；取管底2 ml混勻，以0.45 μm濾紙過濾后，再以生理鹽水稀釋5倍，4℃離心45 min(14 000 g)；取管底1 ml液體充分混勻后，經(jīng)0.22 μm的濾紙加壓過濾。將濾液1 ml注入含DMEM培養(yǎng)液、10%γ-FBS和1%HEPES緩沖液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，5～7 d換1次液。倒置相差顯微鏡觀察NB生長，篩選出無污染的標(biāo)本，用吸管吹打均勻后，吸入EP管。12 000 r/min，離心20 min，棄上清液，再加入無菌注射用水1.5 ml吹打混勻。重復(fù)上面步驟共計(jì)清洗NB 3次，應(yīng)用透射電鏡掃描(負(fù)染法)鑒定。

1.3實(shí)驗(yàn)分組：選取HK-2細(xì)胞，隨機(jī)分為五組，空白對照組(胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞)，NB組(NB菌液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞)，一水草酸鈣(Calcium oxalate monohydrate,COM)組(5 mmol/L COM懸液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞)，納米級(jí)羥基磷灰石(Nanograde hydroxuapatite,nHAP)組(nHAP、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞)和四環(huán)素組(四環(huán)素、NB菌液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞)。

1.4各組細(xì)胞透射電子顯微鏡觀察：分別于6 h、12 h、24 h提取各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，離心后轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，PBS浸泡10 min后棄上清；加入預(yù)冷的3%戊二醛固定2 h，PBS洗2次，3 min/次；再加入1%鋨酸固定2 h，PBS洗2次，3 min/次；梯度酒精脫水，經(jīng)Epon812：環(huán)氧丙烷=1∶1浸透，包埋后80℃聚合過夜。行超薄切片、染色。于透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)變化。

1.5細(xì)胞損傷因子指標(biāo)檢測：分別在6 h、12 h、24 h取各組細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明書分別檢測H2O2、MDA、LDH含量；向吸盡培養(yǎng)液的細(xì)胞中加入0.25%胰蛋白酶并反復(fù)吹打?qū)⒓?xì)胞消化，轉(zhuǎn)移至EP管中，分別加入PBS緩沖液400 μl。用超聲粉碎機(jī)粉碎，ATP酶試劑盒比色法測定各組細(xì)胞Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性。

1.6激光共聚焦顯微鏡檢測晶體滯留實(shí)驗(yàn)：將HK-2細(xì)胞接種于鋪有清潔蓋玻片的24孔板內(nèi)，共同培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后取出各組樣本，加入COM懸液(每孔內(nèi)COM濃度200 mg/L)，輕搖5～10 s，使COM晶體與底部細(xì)胞充分接觸。3 min后吸凈蓋玻片上方液體，加入飽和草酸鈉溶液漂洗3次。將蓋玻片從孔板中取出，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2次，5 min/次，搖床輕晃；加入5 mg/L的phalloidin-FITC 50 μl，室溫避光孵育20 min；PBS洗2次，5 min/次；甘油封片。在488 nm和633 nm激發(fā)光下逐一觀察各組玻片并進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞透射電子顯微鏡觀察結(jié)果：電鏡結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)過程中，空白對照組(圖2A,B,C和D)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整正常，膜外微絨毛(黑色箭頭)數(shù)量豐富，排列規(guī)則；雙層核膜(黃色箭頭)結(jié)構(gòu)正常，核周隙正常；線粒體(紅色箭頭)形態(tài)正常，未見腫脹或萎縮；細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)正常。

對照組：A,B,C,D；NB組：E,F,G,H；COM組：I,J,K,L；nHAP組：M,N,O,P；四環(huán)素組：Q,R,S,T

實(shí)驗(yàn)開始12 h后，NB組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，微絨毛結(jié)構(gòu)稍紊亂，局部絨毛消失(黑色箭頭，圖2E)；細(xì)胞核畸形，染色質(zhì)輕度分布不均，局部染色質(zhì)凝集(黃色箭頭，圖2E)；核外膜局部區(qū)域降解(藍(lán)色箭頭，圖2E)；部分線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹，脊結(jié)構(gòu)模糊不清(紅色箭頭，圖2F)；胞漿中偶見髓樣小體(圖2F)。nHAP組細(xì)胞膜局部區(qū)域結(jié)構(gòu)破損，微絨毛結(jié)構(gòu)消失(黑色箭頭，圖2M)，絨毛結(jié)構(gòu)消失；部分線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹，脊結(jié)構(gòu)模糊不清(紅色箭頭圖2N)。胞漿中見髓樣小體(綠色箭頭，圖2N)。四環(huán)素組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，微絨毛結(jié)構(gòu)稍紊亂，局部絨毛消失(圖2Q，黑色箭頭)，絨毛結(jié)構(gòu)消失；細(xì)胞核畸形，染色質(zhì)輕度分布不均，局部染色質(zhì)凝集(圖2Q，黃色箭頭)；核外膜局部區(qū)域降解(圖2R，藍(lán)色箭頭)；部分線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹，脊結(jié)構(gòu)模糊不清(圖2R，紅色箭頭)。胞漿中偶見髓樣小體(圖2R，綠色箭頭)。COM組細(xì)胞膜局部區(qū)域結(jié)構(gòu)紊亂，微絨毛分布不均，局部區(qū)域絨毛消失(圖2I，黑色箭頭)；細(xì)胞核染色質(zhì)邊集(圖2I，藍(lán)色箭頭)；線粒體結(jié)構(gòu)正常，脊結(jié)構(gòu)清晰。胞漿中偶見自噬小體。

實(shí)驗(yàn)開始24 h后，NB組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破損，胞核裸露在外(粉色箭頭，圖2G)；微絨毛基本消失(黑色箭頭，圖2G)，線粒體數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)腫脹，脊模糊不清(紅色箭頭，圖2H)；胞漿中可見較多髓樣小體(綠色箭頭，圖2H)，胞漿中自噬小體數(shù)量較多(棕黃色箭頭，圖2H)。nHAP組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，核膜結(jié)構(gòu)正常；微絨毛分布不均，局部區(qū)域絨毛消失(圖2O，黑色箭頭)；細(xì)胞核染色質(zhì)邊集(圖2O，藍(lán)色箭頭)；線粒體結(jié)構(gòu)腫脹，脊模糊不清，局部區(qū)域降解(圖2P，藍(lán)色箭頭)。胞漿中偶見髓樣小體(圖2P，綠色箭頭)；胞漿中可見自噬小體(圖2P，棕黃色箭頭)。四環(huán)素組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，微絨毛基本消失(圖2S，黑色箭頭)；線粒體數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)腫脹，脊模糊不清(圖2S，紅色箭頭)。胞漿中可見較多髓樣小體(圖2T，綠色箭頭)；胞漿中自噬小體數(shù)量較多(圖2T，棕黃色箭頭)。COM組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破損，微絨毛分布紊亂，絨毛消失；細(xì)胞核膜階段性溶解，核膜結(jié)構(gòu)模糊不清(圖2L，藍(lán)色箭頭)；線粒體結(jié)構(gòu)腫脹，脊模糊不清(圖2L，紅色箭頭)。胞漿中見髓樣小體(圖2L，綠色箭頭)及自噬小體(圖2L，黃色箭頭)。

圖2 激光共聚焦顯示細(xì)胞晶體黏附情況(×100)

2.2各組細(xì)胞細(xì)胞損傷因子指標(biāo)檢測結(jié)果：如表1所示，共培養(yǎng)12 h和24 h后，NB組和COM組細(xì)胞的Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性均低于對照組(P<0.05)，而nHAP組僅在12h時(shí)低于空白對照組(P<0.05)，四環(huán)素組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的酶活性均高于NB組(P<0.05)。

表1 各時(shí)間點(diǎn)各組Na+/K+ATP和Ca2+/Mg2+ATP酶活性比較

如表2所示，在各時(shí)間點(diǎn)，COM組LDH含量均高于對照組(P<0.05)，NB組、nHAP組、四環(huán)素組的LDH含量顯著低于COM組(P<0.05)。共培養(yǎng)12 h和24 h后，NB組和COM組培養(yǎng)液中H2O2和MDA的含量顯著高于對照組(P<0.05)，nHAP組中H2O2和MDA的含量與對照組無明顯差異(P>0.05)，干擾組中H2O2和MDA的含量顯著低于NB組(P<0.05)。

表2 各時(shí)間點(diǎn)各組培養(yǎng)液LDH、H2O2和MDA含量比較

2.3激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果：如圖2所示，培養(yǎng)6 h時(shí)，NB組、COM組可觀察到少量晶體黏附，隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長，兩組細(xì)胞晶體黏附量進(jìn)一步增加。共培養(yǎng)6 h和12 h時(shí)，nHAP組未觀察到明顯的晶體黏附現(xiàn)象，當(dāng)共培養(yǎng)24 h時(shí)，可觀察到少量晶體黏附。各時(shí)間點(diǎn)，干擾組中晶體黏附量均顯著少于NB組。

3 討論

腎結(jié)石發(fā)病率居高不下，大量研究證實(shí)腎結(jié)石的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及尿過飽和度、晶體的形成和晶體的生長成熟等多種因素，其中晶體與尿上皮細(xì)胞的黏附是腎結(jié)石形成的關(guān)鍵步驟[5,7,9,11,12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NB對HK-2細(xì)胞的損傷程度與nHAP組相似(透射電鏡觀察和ATP酶活性檢測)，12 h時(shí)兩組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，但NB組細(xì)胞核已經(jīng)出現(xiàn)畸形；24 h時(shí)NB組線粒體腫脹、核膜溶解和胞核裸露的細(xì)胞數(shù)較nHAP組明顯增多，NB和nHAP對細(xì)胞的損傷程度也隨著作用時(shí)間而加重，主要表現(xiàn)為刷狀緣排列紊亂，細(xì)胞膜逐漸破壞，說明NB對HK-2細(xì)胞的損傷并不僅僅是羥基磷灰石殼損傷。NB組和COM組細(xì)胞的Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性均低于nHAP組，而LDH水平升高，說明細(xì)胞膜的完整性和連續(xù)性遭到破壞，NB組和COM組H2O2和MDA水平顯著升高說明損傷過程有脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的參與。這一結(jié)果與既往的研究結(jié)果相同，Hong Xin[7]通過比色法檢測發(fā)現(xiàn)，在12 h和24 h，NB組CAT比對照組和nHAP組均高，在24 h時(shí)，CAT含量比COM組含量更高，MDA 和Na+/K+ATP酶活性檢測結(jié)果與本文類似。因此可以認(rèn)為，氧化反應(yīng)介導(dǎo)了NB對HK-2細(xì)胞的損傷。而在激光共聚焦顯微鏡的觀察下，隨著時(shí)間的增加，NB組和COM組的晶體黏附量逐漸增高，但nHAP組未觀察到明顯的晶體黏附，進(jìn)一步說明單純的形成納米羥基磷灰石殼不足形成結(jié)石，而氧化反應(yīng)可能是NB損傷HK-2細(xì)胞的重要因素。目前文獻(xiàn)[10,13]歸納氧化反應(yīng)參與NB形成腎結(jié)石的依據(jù)是氧自由基通過過氧化反應(yīng)增強(qiáng)COM晶體與細(xì)胞膜的黏附，同時(shí)可損傷線粒體，腎臟細(xì)胞損傷時(shí)發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步加重腎損傷，另外氧自由基還可干擾腎小管上皮細(xì)胞膜極性，加速鈣鹽晶體沉積，促使結(jié)石生長。甘瓊枝等[14](腎上皮細(xì)胞損傷使草酸鈣晶體黏附增強(qiáng)的分子機(jī)制)通過共聚焦顯微鏡觀察研究非洲綠猴腎上皮細(xì)胞(Vero)在損傷后晶體黏附分子透明質(zhì)酸的表達(dá)增強(qiáng)，透明質(zhì)酸不但可以通過靜電作用力與草酸鈣晶體結(jié)合,而且可以通過氫鍵與草酸鈣中的草酸根(Oxalate)作用,導(dǎo)致?lián)p傷細(xì)胞對晶體的滯留能力大大增強(qiáng),從而增加了結(jié)石形成的危險(xiǎn)。

四環(huán)素是可以穿透NB的鈣質(zhì)外殼從而殺滅NB的抗菌藥，在治療牙周病、慢性前列腺炎等NB相關(guān)的疾病方面取得一定成效[15-16]。Shoskes[16]等探討NB在Ⅲ型慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用，結(jié)果表明，comET治療[四環(huán)素+乙二胺四乙酸(EDTA)+營養(yǎng)素]3個(gè)月后，國家衛(wèi)生研究院慢性前列腺炎癥狀指數(shù)顯示，12例(80%)患者病情改善率達(dá)25%，其中8例(53%)指數(shù)改善率超過50%。表明四環(huán)素在治療NB相關(guān)的慢性前列腺炎方面有效。胡衛(wèi)國[17]通過尾靜脈注射NB建立大鼠腎結(jié)石模型，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素灌胃可以減少大鼠24 h尿LDH以及腎小管結(jié)晶數(shù)，推測四環(huán)素可能有抑制腎結(jié)石形成的作用。但目前為止，尚缺乏相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)的證據(jù)。本研究通過體外共培養(yǎng)NB和HK-2細(xì)胞，在同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)，四環(huán)素組的細(xì)胞膜損傷和線粒體腫脹程度均較NB組輕，Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性的抑制程度低，晶體滯留量少，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素可以抑制NB對HK-2細(xì)胞的損傷并減少損傷后的晶體滯留。這一結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了四環(huán)素在腎結(jié)石的預(yù)防和治療方面的有效性，對于該病在臨床上的診治具有積極的意義。

綜上所述，NB導(dǎo)致腎結(jié)石形成的過程為：腎小管上皮細(xì)胞損傷后引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，為鈣鹽晶體的黏附提供有效位點(diǎn)；同時(shí)，釋放氧自由基物質(zhì)，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，損傷線粒體，加重過氧化反應(yīng)，干擾胞膜極性；并且，損傷后的細(xì)胞表達(dá)出透明質(zhì)酸等負(fù)電荷晶體黏附分子與鈣磷晶體等陽性離子結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)了鈣鹽晶體的黏附、聚集和生長，最終形成結(jié)石。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究可探討，NB對動(dòng)物或人體產(chǎn)生的炎性反應(yīng)是否與腎結(jié)石形成相關(guān)，同時(shí)四環(huán)素能否預(yù)防早中期腎結(jié)石的進(jìn)展有待進(jìn)一步確定。