郭小婧，張東輝

(長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid， CLA)是含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸在不同位置和立體構(gòu)型上形成的異構(gòu)體的總稱(chēng)。天然和人工合成的 CLA有28種異構(gòu)體，其中以c9,t11-CLA及t10,c12-CLA為研究最多、發(fā)揮生理功能較好的2種主要異構(gòu)體。大量的研究表明，c9,t11-CLA和t10,c12-CLA具有抗癌、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、提高免疫力、防治糖尿病、減肥等多種生理功能[1]，這使得CLA作為營(yíng)養(yǎng)保健品逐漸被廣大消費(fèi)者所喜愛(ài)。但是，目前國(guó)內(nèi)外銷(xiāo)售的CLA制品主要以游離脂肪酸形態(tài)存在，其口感不佳、穩(wěn)定性差、易氧化變質(zhì)，氧化酸敗產(chǎn)生的某些小分子物質(zhì)對(duì)人體健康不利，從而限制了應(yīng)用。為了提高CLA的穩(wěn)定性，可對(duì)CLA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，而合成CLA酯類(lèi)衍生物就是一種很好的選擇。CLA酯類(lèi)衍生物是指CLA發(fā)生酯化反應(yīng)后生成的CLA酯，主要包括共軛亞油酸乙酯、共軛亞油酸甘油酯、共軛亞油酸植物甾醇酯以及其他酯類(lèi)衍生物。與CLA相比，CLA酯類(lèi)衍生物具有優(yōu)異的親脂性，更易于被人體吸收，其穩(wěn)定性和口感均能大幅度提高，且具有與CLA同等或更優(yōu)的生理功能。CLA 酯類(lèi)衍生物具有抗氧化、減肥、降低血脂血糖、降低膽固醇、抗癌等多種作用，對(duì)CLA酯類(lèi)衍生物的開(kāi)發(fā)，將增加CLA產(chǎn)品的種類(lèi)，拓寬CLA的應(yīng)用領(lǐng)域，提高CLA產(chǎn)品的附加值。CLA 酯類(lèi)衍生物可作為多功能添加劑，在化妝品、食品、醫(yī)藥以及飼料行業(yè)中均有廣闊的應(yīng)用前景。本文介紹了CLA酯類(lèi)衍生物的種類(lèi)及合成方法、分離純化方法、檢測(cè)方法、儲(chǔ)存穩(wěn)定性及其應(yīng)用，以期為CLA酯類(lèi)衍生物的深入研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 共軛亞油酸酯類(lèi)衍生物的種類(lèi)及合成方法

1.1 共軛亞油酸乙酯及其合成方法

共軛亞油酸乙酯(Conjugated linoleic acid ethyl ester，CLAEE)是CLA與乙醇酯化而成。CLAEE的合成方法包括化學(xué)合成法和酶催化法。化學(xué)合成法是利用硫酸、對(duì)甲苯磺酸等催化CLA與乙醇直接酯化或利用乙醇鉀、乙醇鈉等催化高含亞油酸油脂(如紅花籽油)的乙酯轉(zhuǎn)化成CLAEE。Niezgoda等[2]利用硫酸催化t10,c12-CLA與乙醇酯化生成CLAEE，將1.12 mmolt10,c12-CLA加入10 mL 4%硫酸溶液中，于磁力攪拌器中50℃反應(yīng)4 h條件下，得到t10,c12-CLAEE，氣相色譜檢測(cè)其轉(zhuǎn)化率為98%。畢艷蘭等[3]以乙醇鉀為催化劑催化紅花籽油乙酯制備CLAEE，在真空度-0.1 MPa、乙醇鉀添加量5%、110℃下反應(yīng)3 h，制得CLAEE相對(duì)含量為(75.44±1.18)%，得率為(69.50±3.09)%的產(chǎn)物，主要成分為c9,t11-CLAEE及t10,c12-CLAEE。酶催化法是利用酶催化CLA與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，常用的脂肪酶有Novozyme 435、AY30、Candidarugosalipase (CRL)、Lipase fromCandidacylindracea。Yu等[4]利用MSU-H為載體固定CRL催化CLA與乙醇合成CLAEE，在CLA 4.7 mmol、乙醇4.7 mmol、80 mg固定在MSU-H(13.3)的CRL、反應(yīng)溫度45℃、反應(yīng)時(shí)間8 h、轉(zhuǎn)速120 r/min條件下，反應(yīng)總酯化率為67.8%，其中c9,t11-CLA的酯化率為95.2%，t10,c12-CLA的酯化率為48.6%。將CRL固定于15%NH2-Si(p)后催化CLA與乙醇酯化，總酯化率為27.8%，其中c9,t11-CLA的酯化率為55.5%，而t10,c12-CLA的酯化率為17.9%[5]。由此可見(jiàn)，固定化的CRL優(yōu)先利用c9,t11-CLA合成CLAEE，且c9,t11-CLA的酯化率是t10,c12-CLA的2～3倍，適合用于工業(yè)生產(chǎn)c9,t11-CLAEE或從CLA混合物中分離c9,t11-CLA。

1.2 共軛亞油酸甘油酯及其合成方法

共軛亞油酸甘油酯(Conjugated linoleic acid glycerides，CLAG)是指CLA與甘油發(fā)生酯化后的產(chǎn)物，有共軛亞油酸甘油單酯(Conjugated linoleic acid monoglycerides，CLA-MG)、共軛亞油酸甘油二酯(Conjugated linoleic acid diglycerides ， CLA-DG )和共軛亞油酸甘油三酯( Conjugated linoleic acid triglycerides，CLA-TG)。其中CLA-MG包含α-甘油單酯和β-甘油單酯，CLA-DG包含1，3-甘油二酯和1，2-甘油二酯。目前CLAG主要通過(guò)以下兩種方式獲得：化學(xué)合成和酶催化法?；瘜W(xué)合成CLAG是指CLA與甘油直接酯化或含亞油酸油脂(如紅花籽油)經(jīng)共軛化后與甘油酯發(fā)生酯交換反應(yīng)生成CLAG。王雪等[6]在亞臨界水的狀態(tài)下，將CLA和甘油直接酯化合成CLAG，在CLA和甘油物質(zhì)的量比2∶1、反應(yīng)壓力13 MPa、反應(yīng)溫度250℃和反應(yīng)時(shí)間40 min條件下得到CLAG，其中CLA轉(zhuǎn)化率為96.3%。大連醫(yī)諾生物股份有限公司[7]先將紅花籽油甲酯共軛化反應(yīng)制得CLA甲酯，再用甲醇鈉催化CLA甲酯與三醋酸甘油酯發(fā)生酯交換反應(yīng)生成CLA-TG，可以得到純度為95%以上的CLA-TG。酶法合成CLAG是指在脂肪酶的作用下，CLA與甘油發(fā)生酯化反應(yīng)或CLA(酯)與甘油(酯)發(fā)生酯醇、酯酸和酯酯交換反應(yīng)所得，常用于制備CLAG的脂肪酶有Lipozyme TL IM、Novozyme 435、Lipases B fromCandidaAntarctica、Rhizomucormiehei(RML)、Thermomyceslanuginosus(TLL)、Lipozyme RM IM等。黃楚楚等[8]通過(guò)固定化脂肪酶Lipozyme TL IM催化CLA乙酯與單油酸甘油酯(GMO)發(fā)生反應(yīng)生成1，3-DAG，在20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Lipozyme TL IM、CLA乙酯與GMO物質(zhì)的量比3∶1、220 r/min、50℃水浴搖床中反應(yīng)2 h條件下生成1，3-DAG，其中CLA含量為66.39%。Lian等[9]利用固定在ECR1030樹(shù)脂上的脂肪酶MAS1-H108A催化CLA與甘油酯化反應(yīng)，在酶用量50 U/g、CLA與甘油物質(zhì)的量比3∶1、反應(yīng)溫度55℃和反應(yīng)時(shí)間24 h條件下，合成了富含CLA的甘油三酯(TAG)，其中CLA含量高達(dá)69.19%，TAG含量為95.21%，DAG含量為4.39%。此外，固定化的MAS1-H108A使用10次后催化活性仍保持初始活性的95.11%，說(shuō)明固定化的MAS1-H108A具有很好的催化活性和可重復(fù)利用性，有望利用其在工業(yè)中生產(chǎn)CLAG。

1.3 共軛亞油酸植物甾醇酯及其合成方法

植物甾醇是由1個(gè)五元環(huán)和3個(gè)六元環(huán)組成的三萜類(lèi)物質(zhì)，最常見(jiàn)的有β-谷甾醇、大豆甾醇及菜油甾醇等。游離型植物甾醇不溶于水，脂溶性也很差，不易被人體吸收利用。共軛亞油酸植物甾醇酯(Conjugated linoleic acid phytosterol ester，CLAPE)既可以改善甾醇的脂溶性，又兼具兩者的生物學(xué)功能。CLAPE是由CLA與植物甾醇直接酯化或CLA甲酯(或乙酯) 與植物甾醇通過(guò)酯交換得到，反應(yīng)過(guò)程一般需要使用催化劑，可分為化學(xué)催化劑和酶。常用的化學(xué)催化劑有十二烷基硫酸鈉、甲醇鈉等。董濤[10]以十二烷基硫酸鈉催化CLA與植物甾醇合成CLAPE，在N2保護(hù)下，當(dāng)CLA與植物甾醇物質(zhì)的量比為 1.2∶1時(shí)，添加2%十二烷基硫酸鈉，于110℃反應(yīng)3 h，制得CLAPE，該條件下酯化率達(dá)77.1%。李春榮等[11]利用甲醇鈉催化CLA甲酯與植物甾醇通過(guò)酯交換反應(yīng)合成CLAPE，在CLA甲酯150 g、植物甾醇90 g、甲醇鈉1.0 g、真空度1.330～2.67 kPa、120℃條件下反應(yīng)2 h，CLAPE產(chǎn)率為94%，其中CLAPE含量為96%?；瘜W(xué)催化劑雖反應(yīng)迅速，但反應(yīng)能耗過(guò)高，對(duì)設(shè)備要求高。常用的酶催化劑有CRL、Novozym 435、Pseudomonas、Chirazyme L-2 c.-f. C2等。Li等[12]通過(guò)固定化Chirazyme L-2 c.-f. C2催化β-谷甾醇與CLA酯化合成共軛亞油酸β-谷甾醇酯，在β-谷甾醇濃度50 μmol/mL、底物物質(zhì)的量比 1∶1、Chirazyme L-2 c.-f. C2用量20 mg/mL、轉(zhuǎn)速150 r/min、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間72 h條件下，得到產(chǎn)率為 72.6%的共軛亞油酸β-谷甾醇酯。湯桂云等[13]使用脂肪酶CRL催化合成共軛亞油酸大豆甾醇酯，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化的反應(yīng)條件為大豆甾醇與CLA物質(zhì)的量比1∶3、 脂肪酶CRL添加量6%、反應(yīng)溫度50℃和反應(yīng)時(shí)間48 h，在優(yōu)化條件下共軛亞油酸大豆甾醇酯產(chǎn)率為 98.94%。由此可見(jiàn)，CRL能高效催化CLAPE的合成，后續(xù)可采用固定化技術(shù)提高其催化效率，同時(shí)保持其重復(fù)利用率，加快其在CLAPE合成的工業(yè)化應(yīng)用。

1.4 共軛亞油酸薄荷醇酯及其合成方法

共軛亞油酸薄荷醇酯(Conjugated linoleic acid l-menthyl ester，CLAME)是由CLA與L-薄荷醇發(fā)生酯化反應(yīng)所生成的物質(zhì)，多用于分離純化CLA異構(gòu)體c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。CLAME的合成多用酶作為催化劑，常用的酶為褶皺假絲酵母脂肪酶AY30與OF。Jafari等[14]優(yōu)化了無(wú)溶劑體系中CLA(c9,t11-CLA+t10,c12-CLA)與L-薄荷醇酯化的條件，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間23.12 h、反應(yīng)溫度32.65℃、脂肪酶AY30用量 135.40 U、CLA與L-薄荷醇物質(zhì)的量比1∶1.7、體系pH 7.7時(shí)，c9,t11-CLA的轉(zhuǎn)化率為93.6%。Giua等[15]檢測(cè)了CLA 4種不同異構(gòu)體在褶皺假絲酵母脂肪酶催化下與L-薄荷醇酯化后的含量，將脂肪酶250 μg、 CLA 10 mg、L-薄荷醇5.7 mg混合溶于100 μL正己烷中反應(yīng)10 min后，N2吹干正己烷，加入3 μL水，然后在磁力攪拌器中30℃分別反應(yīng)8、16、24、32、48 h，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)16 h的總酯化率最高，為48%，產(chǎn)物含c9,t11-CLA(40.99±3.69)%、c11,t13-CLA(28.66±2.48)%、t10,c12-CLA (17.66±4.13)%、t8,c10-CLA (12.70±2.00)%，反應(yīng)8 h生成的CLAME中c9,t11-CLA含量最高，為(50.16±3.12)%。由此可見(jiàn)，褶皺假絲酵母脂肪酶在催化CLA與L-薄荷醇酯化反應(yīng)過(guò)程中，對(duì)底物CLA異構(gòu)體具有選擇性，催化c,t-CLA合成CLAME的反應(yīng)選擇性優(yōu)于t,c-CLA，且對(duì)c9,t11-CLA的選擇利用性高于c11,t13-CLA，所以CLAME的制備反應(yīng)可以用于分離CLA的4種異構(gòu)體。

1.5 共軛亞油酸其他酯類(lèi)衍生物及其合成方法

共軛亞油酸維生素C酯是CLA與維生素C(L-抗壞血酸)反應(yīng)合成的產(chǎn)物。Yang 等[16]利用脂肪酶Novozym 435催化合成共軛亞油酸維生素C酯， 將2.11 mmol/mLL-抗壞血酸、2 mmol/mL CLA、15% Novozym 435加入三氟乙酸甲酯中于70℃反應(yīng)32 h，合成共軛亞油酸維生素C酯的產(chǎn)率約為200 g/L。

共軛亞油酸左旋肉堿酯是CLA與左旋肉堿(L-肉堿)反應(yīng)合成的產(chǎn)物。Li等[17]研究了無(wú)溶劑體系中CLA與L-肉堿生成共軛亞油酸左旋肉堿酯的條件，在1 mmol CLA、1 mmolL-肉堿、150 mg 脂肪酶 AY30、50%水、150 mg 4 ?分子篩、45℃反應(yīng)24 h條件下合成了共軛亞油酸左旋肉堿酯，最大轉(zhuǎn)化率為60.9%。

共軛亞油酸蔗糖酯是CLA或CLAEE與蔗糖反應(yīng)合成的物質(zhì)。楊國(guó)龍[18]用K2CO3催化蔗糖與CLAEE合成共軛亞油酸蔗糖酯，在反應(yīng)時(shí)間3.5 h、 CLAEE與蔗糖物質(zhì)的量比3∶1 或4∶1、反應(yīng)溫度125℃、催化劑K2CO3用量 7%(以底物總物質(zhì)的量為基準(zhǔn))、相轉(zhuǎn)移催化劑四丁基溴化銨用量16%(以底物總物質(zhì)的量為基準(zhǔn))、促進(jìn)劑亞油酸鉀用量16%(以底物總物質(zhì)的量為基準(zhǔn))、反應(yīng)壓力小于0.004 MPa、攪拌速度不小于400 r/min條件下，最終產(chǎn)率為80%左右。

共軛亞油酸冰片酯是CLA與冰片酯化合成的物質(zhì)。王羽倫[19]以脂肪酶AYS為催化劑，在無(wú)溶劑體系中合成共軛亞油酸冰片酯，優(yōu)化的反應(yīng)條件為：2.5 mmol CLA與1 mmol冰片混勻，脂肪酶AYS 用量為冰片質(zhì)量的40%，pH 7.0緩沖液用量為30%，180 r/min，40℃反應(yīng)48 h。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，酯化率為(79.2±0.5)%。

隨著化學(xué)合成技術(shù)的提升以及酶法催化效率的提高，CLA酯類(lèi)衍生物的合成已越來(lái)越多，除上述所述CLA酯類(lèi)衍生物外，還包括共軛亞油酸甲酯、共軛亞油酸葡萄糖酯、共軛亞油酸乳糖酯等，種類(lèi)繁多。CLA酯類(lèi)衍生物的合成方法中，傳統(tǒng)化學(xué)合成法因操作簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟、成本低等優(yōu)點(diǎn)更易應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，但存在產(chǎn)物復(fù)雜、純化困難、環(huán)境污染等缺點(diǎn)需要改進(jìn)。酶法具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、副產(chǎn)物少、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，但存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、酶活性不穩(wěn)定、成本高等問(wèn)題，亟待解決。

2 共軛亞油酸酯類(lèi)衍生物的分離純化方法

CLAEE、CLAPE、CLAME等由于酯化反應(yīng)產(chǎn)物相對(duì)簡(jiǎn)單，所以其分離和分析相對(duì)容易。但是CLAG的反應(yīng)底物甘油有3個(gè)—OH，可以與CLA生成甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯，產(chǎn)物復(fù)雜，因此CLAG的分離純化相對(duì)復(fù)雜。CLA酯類(lèi)衍生物的分離純化方法主要有超臨界CO2萃取技術(shù)，分子蒸餾法，硅膠柱層析法，柱層析、薄層色譜和液相色譜結(jié)合法，模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)等。分離純化方法的選擇需要根據(jù)樣品所需純度而定，對(duì)純度要求高的樣品可選擇多種純化方法組合使用。

2.1 超臨界CO2萃取技術(shù)

超臨界CO2萃取技術(shù)是指在超臨界狀態(tài)下，待分離的物質(zhì)與CO2充分接觸后，根據(jù)其沸點(diǎn)高低、極性大小而依次溶解，然后通過(guò)節(jié)流膨脹、減壓、升溫等操作使CO2和萃取物分離，從而實(shí)現(xiàn)提純的目的。許鵬[20]利用超臨界CO2分別萃取純化了CLAEE和CLAG，發(fā)現(xiàn)當(dāng)壓力為10 MPa、溫度梯度為35～56℃時(shí)，CLAEE的含量由67.2%提高到93.6%。利用超臨界CO2萃取CLAG時(shí)發(fā)現(xiàn)[21]，當(dāng)分離塔內(nèi)無(wú)溫度梯度時(shí)，產(chǎn)物分離速率最快，但效果較差，分離塔溫度梯度為10℃、壓力為12.75 ～16 MPa時(shí)，脫酸效果最好，且超臨界CO2萃取技術(shù)對(duì)CLAG中各組分具有選擇性萃取的效果，其中對(duì)轉(zhuǎn)化率為90.64%的CLAG(CLA-MG、CLA-DG、CLA-TG的含量分別為35.34%、54.41%、10.19%)進(jìn)行萃取后，CLA-MG、CLA-DG、CLA-TG的最高含量分別可達(dá)40.35%、67.08%、18.99%，可見(jiàn)超臨界CO2萃取技術(shù)對(duì)CLA-DG的萃取效果最好。

2.2 分子蒸餾法

分子蒸餾法是由于待分離物中各組分分子平均自由程的不同而實(shí)現(xiàn)分離的方法，適用于沸點(diǎn)高、黏度高、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)分離。Cao等[22]采用分子蒸餾法獲得了高純度的CLA-TG，先使用脂肪酶SMG1將CLAG中的CLA-MG和CLA-DG水解成游離脂肪酸，再通過(guò)分子蒸餾法獲得高純CLA-TG，在分子蒸餾塔溫度150℃、進(jìn)料溫度60℃、物料流速2.7 g/min、冷凝溫度25℃、薄膜蒸餾刮板轉(zhuǎn)速250 r/min、蒸餾壓力8.1 Pa時(shí)，可得到純度為99.8%的CLA-TG。

2.3 硅膠柱層析法

硅膠柱層析法是依據(jù)待分離物中各組分在硅膠上的吸附力不同而使其分離的方法。孫慧娟[23]先采用薄層色譜法對(duì)酯化產(chǎn)物CLAPE進(jìn)行定性分析，然后使用硅膠柱層析法對(duì)其進(jìn)行分離純化，結(jié)果表明，當(dāng)以石油醚(沸程60～70℃)-乙醚-乙酸(體積比80∶20∶1)為展開(kāi)劑，硅膠柱中流動(dòng)相流速為1.5 mL/min，填充高度為 65 cm，樣品最大上樣量為 5 g 時(shí)，樣品中各組分均能得到較好的分離， CLAPE純度可達(dá)到 90%。

2.4 柱層析、薄層色譜和液相色譜結(jié)合法

柱層析、薄層色譜和液相色譜結(jié)合法主要用來(lái)分離純化CLAG，先利用柱層析法把CLAG混合樣品中的幾種不同組分分離，再用薄層色譜法初步鑒定各種餾分的成分，最后使用液相色譜對(duì)分段收集產(chǎn)物進(jìn)一步分離純化。劉珍珠[24]使用柱層析、薄層色譜和液相色譜結(jié)合法實(shí)現(xiàn)了CLAG的分離純化，柱層析法中用10%乙醚石油醚溶液洗脫得到餾分1， 30%乙醚石油醚溶液洗脫得到餾分2，100%乙醚溶液洗脫得到餾分3。再使用薄層色譜法對(duì)比標(biāo)樣初步鑒定餾分1、2、3分別為CLA-TG、CLA-DG、CLA-MG，使用的展開(kāi)劑為石油醚-乙醚-冰醋酸(體積比 30∶70∶1)。液相色譜法中用正己烷-異丙醇(體積比為9∶1)分別溶解餾分1、2、3，流動(dòng)相A為正己烷，流動(dòng)相B為異丙醇，當(dāng)正己烷-異丙醇體積比為95∶5時(shí)， CLA-TG、1,3-CLA-DG 和1,2-CLA-DG能依次得到分離，當(dāng)正己烷-異丙醇體積比為90∶10時(shí)，可分離出CLA-MG。

2.5 模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)

模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)是多個(gè)色譜柱串聯(lián)而成的裝置。自然資源部第一海洋研究所[25]發(fā)明了一種利用模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)純化高濃度CLAEE的方法。該色譜系統(tǒng)為四區(qū)模擬移動(dòng)床，每區(qū)均串聯(lián)2根色譜柱，色譜柱固定相為C18硅膠，洗脫液為甲醇-水(或乙醇-水或乙腈-水)(質(zhì)量比80∶20)，該法使純度80%的CLAEE純化為純度97%以上的高純品。

總之，超臨界CO2萃取技術(shù)具有綠色環(huán)保、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，但維持超臨界狀態(tài)需要很高的操作壓力，設(shè)備昂貴，分離CLA酯類(lèi)衍生物的成本相對(duì)較高。分子蒸餾法蒸餾壓力低、受熱時(shí)間短、工藝簡(jiǎn)單、分離效率高、不污染環(huán)境、且能回收利用未反應(yīng)的CLA，是分離純化CLA酯類(lèi)衍生物的一種經(jīng)濟(jì)合理的方法，但分離相對(duì)分子質(zhì)量相近的物質(zhì)效果較差。柱層析法成本低廉、分辨率高、選擇性好、速度快，因此適用于雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，同時(shí)由于其耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑用量大、處理能力小，現(xiàn)多用于實(shí)驗(yàn)室階段。模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)產(chǎn)品純度高、溶劑消耗少、可連續(xù)操作、可自動(dòng)控制，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，但對(duì)后續(xù)產(chǎn)品需要脫除溶劑，同時(shí)設(shè)備投資高。

3 共軛亞油酸酯類(lèi)衍生物的檢測(cè)方法

3.1 氣相色譜法

氣相色譜法(GC)是根據(jù)樣品中各組分在固定相中吸附力和溶解力的不同而實(shí)現(xiàn)各成分的分離檢測(cè)。GC法檢測(cè)CLA酯類(lèi)衍生物應(yīng)選用強(qiáng)極性的長(zhǎng)石英毛細(xì)管色譜柱，常用的色譜柱有CP-Sil 88(100 m×0.25 mm×0.2 μm)、DB-23(60 m×0.25 mm×0.15 μm)、SP-2560(100 m×0.25 mm×0.2 μm)等，檢測(cè)器常選用氫離子火焰檢測(cè)器(FID)、質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)等，采用程序升溫方式。惠菊[26]使用GC法測(cè)定了CLAG中CLA的含量，檢測(cè)條件為：CP-Sil 88毛細(xì)管色譜柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；FID檢測(cè)器；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器溫度250℃；空氣壓力50 kPa；氫氣壓力60 kPa；氮?dú)鈮毫?20 kPa；程序升溫為70℃保持4 min， 13℃/min升溫至175℃保持27 min， 4℃/min升溫至215℃保持31 min。檢測(cè)結(jié)果顯示，CLAG中CLA含量為17.1%，其中含c9,t11-CLA (8.12±0.28)%，t10,c12-CLA(9.01±0.21)%。

3.2 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)檢測(cè)方法

由于CLA異構(gòu)體較多，人們常用銀離子高效液相色譜法(Ag+-HPLC)檢測(cè)CLA及其酯類(lèi)衍生物(尤其是甘油酯)，檢測(cè)器一般采用紫外檢測(cè)器(UV)、示差折光檢測(cè)器(RID)和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 (ELSD)，檢測(cè)方法選擇正相色譜法和反相色譜法均可。劉珍珠等[27]使用反相高效液相色譜配ELSD測(cè)定了CLAG中各組分含量，實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相A為正己烷，流動(dòng)相B為正己烷-異丙醇-乙酸乙酯-甲酸(體積比80∶10∶10∶0.1)，上樣量10 μL，流量1 mL/min，梯度洗脫，氮?dú)饬髁?.5 mL/min，漂移管溫度40℃。檢測(cè)結(jié)果顯示，共軛亞油酸甘油酯樣品中CLA-TG、1,3-CLA-DG 、1,2-CLA-DG和CLA-MG含量分別為 79.49%、 10.08%、9.22%、0.55%，各甘油酯的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.5%、4.7%、4.5%、3.5%，檢出限分別為 0.06、0.2、0.2、0.25 mg/L。

3.3 高效液相色譜-傅里葉紅外光譜分析

以上3種檢測(cè)方法是CLA酯類(lèi)衍生物的常用方法。氣相色譜法具有樣品用量少、 前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、選擇性高、靈敏度高和分離效率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于CLAEE、CLAPE、CLAME等的檢測(cè)，但CLAG 的沸點(diǎn)很高，難以汽化，GC檢測(cè)CLAG重現(xiàn)性較差，且GC測(cè)定需對(duì)樣品先進(jìn)行甲酯化，檢測(cè)結(jié)果無(wú)法確定CLA的酯型。高效液相色譜法具有操作簡(jiǎn)單、便于自動(dòng)化、高效快速、保護(hù)樣品不被破壞等優(yōu)點(diǎn)，適用于大分子物質(zhì)和熱不穩(wěn)定物質(zhì)，可用于CLA酯類(lèi)衍生物的檢測(cè)。FTIR具有分辨率高、對(duì)樣品無(wú)破壞性、 操作簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)，多用于CLA酯類(lèi)衍生物的結(jié)構(gòu)分析鑒定。除以上介紹的檢測(cè)方法外，還包括常用的紫外光譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法以及核磁共振法等。上述方法在分析不同物質(zhì)時(shí)，應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)和各分析方法的特點(diǎn)合理選擇，也可將多種方法結(jié)合使用。

4 共軛亞油酸酯類(lèi)衍生物的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

CLA酯類(lèi)衍生物在儲(chǔ)存和應(yīng)用加工過(guò)程中會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)，生成的過(guò)氧化脂質(zhì)對(duì)人體健康不利，為了防止CLA酯類(lèi)衍生物的氧化并維持其穩(wěn)定性，常通過(guò)添加抗氧化劑、微膠囊化或加工成膠丸等方式增強(qiáng)其穩(wěn)定性。

劉美玉等[28]研究了CLAEE和CLAG的氧化穩(wěn)定性，結(jié)果顯示CLAG的穩(wěn)定性強(qiáng)于CLAEE，當(dāng)添加0.02%的維生素E時(shí)二者的氧化穩(wěn)定性提高。

羅文靜[29]對(duì)內(nèi)容物為CLAEE的CLA軟膠囊進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，發(fā)現(xiàn)CLAEE在高溫、高濕和強(qiáng)光環(huán)境下均具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，而其囊殼則穩(wěn)定性相對(duì)較差。這表明將CLAEE制成軟膠囊后可以增強(qiáng)其氧化穩(wěn)定性。

劉明[30]比較了塑料瓶和鋁聽(tīng)2種包裝形式下CLAG的穩(wěn)定性，并研究了不同形態(tài)下的CLAG應(yīng)用于烘焙時(shí)對(duì)產(chǎn)品感官的影響，檢測(cè)了2種不同形態(tài)的CLAG的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：塑料瓶和鋁聽(tīng)包裝的CLAG的顏色、脂肪酸組成及過(guò)氧化值均十分穩(wěn)定，且塑料瓶包裝的CLAG的氣味穩(wěn)定，但鋁聽(tīng)包裝的CLAG保存2個(gè)月后便有哈喇味；相同CLA含量的CLAG及CLAG微囊粉烘焙制備的面包，在氣味、口味及外觀上無(wú)明顯差異，但用CLAG(CLA含量 3%)烘焙制備的餅干有明顯的哈喇味，同時(shí)CLAG及CLAG微囊粉對(duì) 200℃以上短暫(6～9 min)的高溫均具有一定的耐受性，但CLAG微囊粉較CLAG的耐高溫性更強(qiáng)。由此可看出，CLAG的塑料包裝優(yōu)于鋁聽(tīng)包裝，將CLAG制成微囊粉有利于保持CLAG的穩(wěn)定性。

孫慧娟[23]考察了CLAPE在油脂中的溶解度及過(guò)氧化值，CLAPE相比植物甾醇在植物油中的溶解度提高了 20～30 倍，且CLAPE的抗氧化效果較植物甾醇強(qiáng)，當(dāng)CLAPE的添加量為 0.10 mg/g時(shí)，顯著提高了豬油和花生油的氧化穩(wěn)定性。另外，0.02%的維生素E可以提高CLAPE的抗氧化效果，而維生素C對(duì)維生素E和CLAPE的氧化穩(wěn)定性沒(méi)有增效作用。這表明CLAPE具有一定的抗氧化性，且0.02%的維生素E可作為CLAPE的抗氧化劑。

5 共軛亞油酸酯類(lèi)衍生物的應(yīng)用

CLA酯類(lèi)衍生物較CLA性質(zhì)穩(wěn)定、口感好、易于儲(chǔ)存，且易被人體消化吸收，同時(shí)也具有CLA的各項(xiàng)生理功能，可作為功能添加劑加入藥品、食品、化妝品和飼料中，具有廣泛的應(yīng)用前景。

5.1 在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用

CLA酯類(lèi)衍生物具有抗氧化、減肥、降低血脂血糖、降低膽固醇、抗癌等多種作用。CLAEE、CLAG、CLAPE均具有抗氧化作用，且抗氧化效果較CLA強(qiáng)。共軛亞油酸左旋肉堿酯、CLAG均具有減肥功能，且CLAG比CLA更易被淋巴細(xì)胞吸收，1%的CLAG能顯著減少小鼠體內(nèi)血清甘油三酯含量，并抑制高脂血癥的發(fā)生[31]。趙樹(shù)法[32]以小鼠為模型比較了游離CLA與CLAG在降血脂及減肥活性上的差異，結(jié)果顯示兩者均具減肥功能，減肥效果無(wú)顯著差異，但CLAG在降低血脂、血糖方面優(yōu)于CLA，CLAG對(duì)血糖、瘦素、TNF-腫瘤壞死因子、胰島素均有降低作用，而CLA僅能降低瘦素、TNF-腫瘤壞死因子，對(duì)血糖有增高作用。CLAG、CLA對(duì)肝臟甘油三酯、總膽固醇均有降低作用，兩者效果無(wú)顯著差異。體外實(shí)驗(yàn)證明，CLAPE可以通過(guò)抑制膽固醇在小腸內(nèi)的吸收，從而有效降低膽固醇含量[33]。CLAG、CLAPE均具有抗癌功能[34-35]，許浮萍[34]證明了CLAG(CLA含量47%)對(duì)人體前列腺淋巴結(jié)癌細(xì)胞LNCaP的增殖有抑制作用，且CLAG與CLA標(biāo)樣(CLA含量80%)具有同等的抗癌功能。共軛亞油酸冰片酯具有抗腫瘤的作用，對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用強(qiáng)于CLA[19]。鑒于CLA酯類(lèi)衍生物的上述生理功效，可將其作為藥品或藥品輔料應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)中。

5.2 在食品行業(yè)中的應(yīng)用

CLA酯類(lèi)衍生物可作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑或抗氧化劑應(yīng)用于食品行業(yè)中。CLAG、CLAPE均已被我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為脂類(lèi)新資源食品，可直接食用或添加至乳制品、飲料、烘焙食品、食用油等產(chǎn)品中。如將CLAG作為膳食補(bǔ)充劑直接添加到乳制品(尤其是液態(tài)制品)中，得到具有優(yōu)良口感的功能性乳制品[36]；利用CLAPE的抗氧化性制備富含復(fù)配型天然抗氧化劑的玉米油，可延長(zhǎng)玉米油的貨架期[37]。

5.3 在化妝品行業(yè)中的應(yīng)用

CLAEE能夠美白皮膚、防止皮膚細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化及紫外線引起的自由基損傷，可作為功能化妝品的助劑使用。CLAEE是一種高效低毒的抗氧化劑，抗氧化性較CLA強(qiáng)，細(xì)胞毒性較CLA弱，兩者的乳膏體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)證明，CLA的攝取量在3 h內(nèi)幾乎達(dá)到飽和，而CLAEE的攝取量在24 h內(nèi)持續(xù)增加，且攝取量遠(yuǎn)大于CLA[38]。共軛亞油酸維生素C酯能清除自由基、抗氧化、消炎、減少紫外線對(duì)皮膚的損傷、平滑皺紋，可用于制作洗面奶、洗滌劑、口紅、保濕霜、防曬霜等多種日用護(hù)膚品和化妝品[39]。

另外，CLA酯類(lèi)衍生物還可以用于動(dòng)物飼料添加劑，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，預(yù)防動(dòng)物疾病，提高動(dòng)物產(chǎn)品的品質(zhì)。

6 結(jié)束語(yǔ)

CLA酯類(lèi)衍生物因具有眾多的生理功能，且穩(wěn)定性和口感較CLA好，已受到研究者的廣泛關(guān)注。目前已有部分CLA酯類(lèi)衍生物投入生產(chǎn)，但工業(yè)生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成法，其對(duì)設(shè)備要求高、產(chǎn)物難分離，且生產(chǎn)有“三廢”排放。酶法合成CLA酯類(lèi)衍生物反應(yīng)條件溫和、特異性強(qiáng)、無(wú)污染廢棄物，是未來(lái)極具前景的生產(chǎn)方法，后續(xù)需提高酶的熱穩(wěn)定性及使用率，降低生產(chǎn)成本，加速酶法生產(chǎn)CLA酯類(lèi)衍生物的工業(yè)化。CLA酯類(lèi)衍生物的分離檢測(cè)需要根據(jù)樣品量、純度要求、經(jīng)濟(jì)成本等選擇最合適的方法，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際條件，對(duì)于純度要求較高的產(chǎn)品，建議選擇兩種或多種分離純化方法組合。另外，模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)上樣量大，可以連續(xù)操作，產(chǎn)物純化率高，應(yīng)加大研究力度，推動(dòng)其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。CLA酯類(lèi)衍生物雖已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和飼料行業(yè)，但如何進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其貨架期還值得深入研究，以提升CLA酯類(lèi)衍生物的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。