楊慶偉，梁海鵬，陳小鵬，張志峰，劉延慶

(1.慶陽市人民醫(yī)院腫瘤外科，甘肅 慶陽 745000；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225001)

南蛇藤(Celastrus orbiculatus)系衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物[1～3]，在我國分布廣泛，長江以南地區(qū)多見。南蛇藤含有多種藥理活性成份(萜類、苷類及脂肪類化合物)，具有抗腫瘤、抗炎、抗微生物、抗氧化、抗纖維化和抗生育等作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)南蛇藤總萜(主要為二萜和三萜類化合物)對消化道腫瘤表現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性，對胃癌和肝癌抗瘤研究多有報道[4～6]。本研究通過南蛇藤總萜作用于人食道癌Eca-109細(xì)胞，觀察其在體外對人食道癌Eca-109細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的影響，明確其抗瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物

南蛇藤粉碎成粉烘干，95%乙醇加熱回流提取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑得到浸膏，拌入硅藻土，真空低溫抽干，再用乙酸乙酯熱水浴加熱回流，過濾，回收得到乙酸乙酯浸膏。其主要成份為南蛇藤總萜(二萜類和三萜類)。二甲基亞砜助溶，其濃度小于0.05%，以無血清培養(yǎng)基配成實(shí)驗(yàn)所需要濃度工作液。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，MTT粉劑為Sigma公司產(chǎn)品，PI(碘化丙啶)為上海晶美公司產(chǎn)品。鼠抗人MMP-9單抗和鼠抗人COX-2單抗為北京中杉公司產(chǎn)品，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗鼠IGg為碧云天生物公司產(chǎn)品，人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒為博士德生物公司產(chǎn)品。

1.3 儀器

倒置相差顯維鏡為產(chǎn)自日本的Olympus產(chǎn)品，酶標(biāo)儀為產(chǎn)自芬蘭的Labsystems Dragon產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為產(chǎn)自美國BD公司的FACSAria產(chǎn)品， CO2恒溫孵箱為產(chǎn)自美國的REVCO產(chǎn)品，恒溫水浴鍋產(chǎn)自于上海申生科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度分別為10、20、40、80、160μg/mL的南蛇藤總萜，對照組用等體積的DMEM培養(yǎng)基替代。細(xì)胞由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物研究所提供，常規(guī)培養(yǎng)于10%小牛血清、100KU/L青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 MTT試驗(yàn)： 取對數(shù)生長期人食道癌Eca-109細(xì)胞，以1×104個/孔接種于96空培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度分別為10、20、40、80、160μg/mL的南蛇藤總萜，對照組用等體積的DMEM培養(yǎng)基替代。在37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)24h后，加入MTT工作液(5mg/mL)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去各孔內(nèi)液體，每孔加入100uL二甲基亞砜，微波振蕩器振蕩10min后，使細(xì)胞內(nèi)和周圍紫色顆粒充分溶解，室溫放置10min。于全自動酶標(biāo)儀測定各孔A570nm值，每組重復(fù)6復(fù)孔，計算腫瘤細(xì)胞生長抑制率(IR)=(1-藥物組A值/對照組A值)×100%。

選取濃度為40μg/mL的南蛇藤總萜作用于人食道癌Eca-109細(xì)胞24、48、72、96h，MTT法測定各孔A570nm值，計算細(xì)胞抑制率。對照組用等體積的DMEM培養(yǎng)基替代。

1.4.3 細(xì)胞凋亡率測定：人食道癌Eca-109細(xì)胞以3×105個/孔接種于六空培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度分別為10、20、40、80μg/mL的南蛇藤總萜，對照組用等體積的DMEM培養(yǎng)基替代。在37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)作用24h、48h后，離心去上清，收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5mL的EP管中，加入10uL PI,混勻后于室溫下避光10min，流式細(xì)胞儀測定凋亡率。

1.4.4 對基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白和環(huán)氧化酶-2(COX-2)蛋白表達(dá)的影響。取食道癌Eca-109細(xì)胞接種于50mL細(xì)胞瓶中，培養(yǎng)過夜，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度分別為5、10、20、40μg/mL的南蛇藤總萜，對照組用等體積的DMEM培養(yǎng)基替代。在37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)作用24h后，收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5mL的EP管中，加入含有0.1%多聚甲醛的PBS固定，后加入含有0.1% Triton X-100的PBS,分別加入鼠抗人MMP-9單抗和鼠抗人環(huán)氧化酶-2單抗，常溫下留置30min后加入羊抗鼠FTTC-IgG,靜置后上流式細(xì)胞儀檢測。FI(Fluresence Index ,FI)代表熒光指數(shù)，具體公式如下FI=檢測管細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度/對照管細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。對照管FI=1，如FI>1.為陰性表達(dá)，F(xiàn)I<1.為陽性表達(dá)。

1.4.5 對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)測定。取人食道癌Eca-109細(xì)胞接種于50mL細(xì)胞瓶中，在在37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)作用24h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度分別為5、10、20、40μg/mL的南蛇藤總萜繼續(xù)培養(yǎng)48h，對照組用等體積的DMEM培養(yǎng)基替代，后分別吸取培養(yǎng)上清留置待用。具體操作按照ELISA試劑盒要求執(zhí)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細(xì)胞增殖的抑制作用

不同濃度的南蛇藤總萜作用于人食道癌Eca-109細(xì)胞24h后，MTT結(jié)果顯示，南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細(xì)胞有抑制作用，當(dāng)藥物濃度為160μg∕mL時，最大抑制率為44.69%，存在量效關(guān)系，見表1。選取濃度為南蛇藤總萜40μg∕mL作用于人食道癌Eca-109細(xì)胞，分別孵育24h、48h、72h、96h后，結(jié)果顯示藥物作用96后，南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細(xì)胞最大抑制率可達(dá)40.18%，南蛇藤總萜抑瘤效果存在時間依賴性，見表2。

2.2 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細(xì)胞凋亡的影響

選取南蛇藤總萜10、20、40、80μg/mL各不同濃度作用于人食道癌Eca-109細(xì)胞，分別孵育24h、48h后，通過流式細(xì)胞法檢測南蛇藤總萜誘導(dǎo)人食道癌Eca-109細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，隨著南蛇藤總萜濃度的增加，人食道癌Eca-109細(xì)胞的凋亡率在逐步升高，24h作用后最大凋亡率30.64%，48h作用后最大凋亡率37.31%，南蛇藤總萜可以誘導(dǎo)人食道癌Eca-109細(xì)胞凋亡，呈濃度和時間依賴關(guān)系。與對照組比較，存在差異性。見表3。

表1 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細(xì)胞 增殖的抑制作用

表2 不同作用時間南蛇藤總萜(40μg∕mL)對人食道癌 Eca-109細(xì)胞增殖的抑制作用

表3 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細(xì)胞 凋亡的影響

2.3 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細(xì)胞MMP-9和COX-2的影響

選取濃度分別為5、10、20、40μg/mL南蛇藤總萜作用于人食道癌Eca-109細(xì)胞24h后，通過流式細(xì)胞儀法檢測MMP-9和COX-2 FI值的變化。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增大，MMP-9和COX-2的FI值在逐步減小，存在量效關(guān)系，與對照組比較存在差異性。當(dāng)南蛇藤總萜40μg/mL時MMP-9 的FI值(0.60±0.02)，當(dāng)南蛇藤總萜40μg/mL時COX-2的FI值(0.51±0.05), 說明南蛇藤總萜能夠下調(diào)MMP-9和COX-2蛋白的表達(dá),尤其在下調(diào)COX-2蛋白的表達(dá)表現(xiàn)出更好的優(yōu)越性。見表4。

表4 南蛇藤總萜對人食道癌MMP-9、COX-2、VEGF的影響

2.4 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細(xì)胞VEGF的影響

不同濃度的南蛇藤總萜作用于人食道癌Eca-109細(xì)胞48h后，通過ELISA法檢測VEGF的變化，結(jié)果顯示，南蛇藤總萜能夠下調(diào)VEFG的表達(dá)，存在量效關(guān)系。當(dāng)南蛇藤總萜濃度為40μg/mL時，VEGF的含量降至(288.31±15.18)pg/mL，與對照組(490.62±20.73)pg/mL存在差異性。見表4。

3 討論

全球食管癌發(fā)病率居世界惡性腫瘤第8位，在36種癌癥死亡例數(shù)中排在第6位，是世界上最常見和最致命的癌癥之一[7,8]。我國是食管癌高發(fā)國家[9]，發(fā)病率排在全球前5，雖然我國多年來非常重視食管癌的診療工作，但90%確診的食管癌患者為中晚期，因而藥物的治療在食管癌的綜合治療中扮演著重要角色。南蛇藤總萜目前對胃癌和肝癌抑瘤報道較多，表現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性。本研究結(jié)果顯示南蛇藤總萜能夠抑制人食道癌Eca 109細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)人食道癌Eca細(xì)胞凋亡，其抑瘤效果存在劑量和時間依賴性。COX-2是體內(nèi)一種分解花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素過程的限速酶，它以促進(jìn)多種途徑參與消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，不僅在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而且在消化道腫瘤細(xì)胞內(nèi)多有高表達(dá)[10]。COX-2的高表達(dá)可改變與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的基因表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的形成和發(fā)生。有研究顯示[11]，下調(diào)COX-2蛋白的表達(dá)，可以抑制VEGF和MMP-9的生成，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，南蛇藤總萜能夠誘導(dǎo)人食道癌Eca109細(xì)胞凋亡，下調(diào)COX-2、VEGF和-MMP-9的表達(dá)，我們是否可以認(rèn)為南蛇藤總萜下調(diào)COX-2蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致了其下游分子VEGF和MMP-9出現(xiàn)低表達(dá),同時南蛇藤總萜對VEGF和MMP-9亦有抑制作用，抑制了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移?？梢哉J(rèn)為南蛇藤總萜對人食道癌Eca109細(xì)胞增殖的抑制和凋亡的影響，與南蛇藤總萜下調(diào)"COX-2-VEGF-MMP-9"信號通路密切相關(guān)。當(dāng)然，腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多基因、多步驟協(xié)同作用的復(fù)雜過程，其過程可能涉及多個癌基因和抑癌基因的突變，以及各種酶類物質(zhì)的改變，其抗瘤機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。