梁鑫 梁波 張仁懷 呂自力 艾華偉 鄭飛 單旭東 陳浩然

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/附屬生殖婦幼醫(yī)院，四川 成都 610041；2. 四川省人口和計劃生育科學(xué)研究所，四川 成都 610041；3. 成都遠(yuǎn)睿生物技術(shù)有限公司，四川 成都 610000；4. 河南多美康生物藥業(yè)有限公司，河南 鄭州 450000）

膠原蛋白是結(jié)締組織中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白， 對維護(hù)細(xì)胞、組織和器官的正常生理功能具有十分顯著的作用[1-4]。膠原蛋白具有多種生物活性，參與細(xì)胞的遷移、分化和增殖，同時其抗原性弱，生物相容性良好，在燒創(chuàng)傷的治療，創(chuàng)面止血、骨質(zhì)疏松、眼角膜疾病等的治療以及人造代血漿等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域皆有廣泛的用途[5-9]。因此，近年來，膠原蛋白作為人體含量最多、最豐富的天然蛋白質(zhì)，在營養(yǎng)、保健和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用價值被越來越多的消費(fèi)者所認(rèn)可[10]。

目前已發(fā)現(xiàn)的膠原包括27種，其中在真皮中分布最為廣泛的是I、Ⅲ型膠原[1,11]。成人皮膚中I型膠原約占80%，Ⅲ型約占20%，而胎兒和嬰兒皮膚中約60%的膠原為Ⅲ型。I型膠原在體內(nèi)構(gòu)成有橫紋的粗徑原纖維，是瘢痕組織纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)，在愈合的傷口中大量存在，使傷口處皮膚質(zhì)地堅硬而沒有彈性。而Ⅲ型膠原蛋白則是皮膚中網(wǎng)狀纖維的主要組成部分，其含量越高則纖維束越細(xì)。在創(chuàng)傷修復(fù)中，Ⅲ型膠原的比例高則創(chuàng)口皮膚細(xì)膩柔滑。Ⅲ型膠原蛋白也是嬰兒皮膚無瘢痕愈合的原因之一。

以傳統(tǒng)酸、堿、酶水解法從動物組織中提取膠原蛋白，易導(dǎo)致蛋白生物功效降低、臨床不穩(wěn)定和病毒隱患等問題。相較于傳統(tǒng)的動物來源膠原蛋白，重組人Ⅲ型膠原蛋白具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性、親水性和可加工性，以及更低的免疫原性[12-15]。表達(dá)重組膠原蛋白的常用宿主有酵母、大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因煙草、昆蟲細(xì)胞等[16-18]。利用基因工程技術(shù)，通過酵母分泌表達(dá)Ⅲ型膠原蛋白，具備產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定可控、產(chǎn)品無免疫排斥和過敏反應(yīng)等優(yōu)勢[19-23]。本研究中，我們通過優(yōu)化甲醇濃度對重組畢赤酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵研究，達(dá)到提高重組人Ⅲ型膠原蛋白產(chǎn)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

重組畢赤酵母GS115基因工程菌由本研究團(tuán)隊構(gòu)建，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.12491。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基（每升）：10 g酵母提取物，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖。

PTM微量元素（每升）：CuSO4·5H2O 6 g，NaI 0.08 g，MnSO4·H2O 3.0 g，Na2MoO4·2H2O 0.2 g，H3BO30.02 g，CoCl20.5 g，ZnCl220 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 65 g，生物素 0.2 g，H2SO45 ml，用0.22 μm濾膜過濾除菌，室溫保存。

分批發(fā)酵培養(yǎng)基 (升)：MgSO4·7H2O 14.9 g，H3PO426.7 ml，CaSO40.93g，K2SO418.2g，，KOH 4.13 g，甘油 40 g；滅菌后再加入4 ml PTM微量元素。補(bǔ)料生長培養(yǎng)基：50%（W/V）甘油（含PTM 12 ml?L-1）。

發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基：甲醇（含PTM 12 ml?L-1）。

1.1.3 設(shè)備

柚子。柚子營養(yǎng)豐富，含有糖類、有機(jī)酸、維生素A、B1、B2、C、P 和鈣、磷、鎂、鈉等營養(yǎng)成分。柚子還含有生理活物質(zhì)皮甙以及類胰島素，柚肉中所含維生素C非常豐富，故柚肉能降血脂、降低血液黏滯度，減少血栓形成，有防治腦血管疾病等功效。

15 L發(fā)酵罐（上海百倫生物科技有限公司），臥式恒溫振蕩器（美國精騏有限公司），生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司），紫外分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）立式壓力蒸汽滅菌器（上海申宏醫(yī)療器械廠），高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），電泳儀（BIO-RAD公司），Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

一級種子：從-80℃冰箱，取出工作種子，按1:1000（V/V）接種至一級YPD培養(yǎng)基，28℃，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm，培養(yǎng)40 h左右，當(dāng)OD600達(dá)到10-15左右，轉(zhuǎn)接下一級種子培養(yǎng)基。

二級種子：按2%-5%（V/V）比例，將一級種子轉(zhuǎn)入二級YPD培養(yǎng)基，28℃，轉(zhuǎn)速200 rpm，培養(yǎng)24 h左右，OD600達(dá)到15-20左右，轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐。

三級發(fā)酵：二級種子按1:10比例接入10L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，設(shè)定pH為5.0，攪拌轉(zhuǎn)速為600 rpm，溫度為28℃。后期發(fā)酵采用以下兩種策略。

（1）參照Invitrogen 公司方法[24]進(jìn)行甲醇流加，保持溶氧在10%左右；

（2）采用兩階段發(fā)酵法，第一階段通過補(bǔ)加甘油增加重組酵母菌的生物量，第二階段，加入甲醇進(jìn)行重組人Ⅲ型膠原蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)至溶氧上升時，以流速為250 mL?h-1開始流加50%的甘油，持續(xù)流加4 h，菌體濕重達(dá)到120-130 g?L-1停止加入甘油。待溶氧上升100%后饑餓培養(yǎng)0.5 h，之后開始流加甲醇，誘導(dǎo)重組人Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)約72 h。加入甲醇時，維持發(fā)酵液中甲醇濃度分別在0.05%、0.1%、0.2%、0.4%，保持溶氧在10%左右。

1.2.2 分析方法

對發(fā)酵液離心上清液中重組人Ⅲ型膠原蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳定性檢測，用分子排阻高效液相色譜（Size exclusion high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）分析重組人Ⅲ型膠原蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)溶氧控制甲醇流加

參照Invitrogen公司提供旳巴氏畢赤酵母發(fā)酵方案[24]，微生物發(fā)酵過程中，pH、溶氧（DO）等參數(shù)反映碳源的消耗情況。當(dāng)碳源消耗完，DO會上升，如果再加入碳源，由于微生物利用碳源消耗氧，使DO下降。利用這個原理可根據(jù)DO的變化控制畢赤酵母發(fā)酵過程中甲醇的流加。重組人Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)如圖1，生長曲線如圖2（DO）。

圖1 誘導(dǎo)時間電泳圖

從圖1電泳、圖2 DO生長曲線可以看出，用原始方案發(fā)酵，雖然菌體量達(dá)到0.4 g?mL-1，但重組人Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量只達(dá)到3 g?L-1，還達(dá)不到產(chǎn)業(yè)化的要求。在誘導(dǎo)時，補(bǔ)加的甘油已經(jīng)消耗完，只加入甲醇補(bǔ)充碳源。

2.2 根據(jù)甲醇濃度控制甲醇流加

通過流加甲醇，保持甲醇濃度在0.05、0.1、0.2、0.4%（V/V）時，重組畢赤酵母菌的生長曲線見圖2，重組人Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)情況見圖3。

從圖2的生長曲線看出，隨著甲醇濃度的增加菌體量有所提高，說明根據(jù)控制溶氧流加甲醇還不能滿足菌體的生長，碳源不足導(dǎo)致重組人Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量低；在甲醇濃度低的情況下，甲醇補(bǔ)充的碳源有利于菌的生長，甲醇濃度增大后，甲醇不利于菌的生長，當(dāng)甲醇濃度達(dá)到0.4%時，菌體量開始下降，說明甲醇濃度大對菌的生長有抑制作用。

圖3顯示，隨著甲醇濃度增加，重組人Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量增加，但甲醇濃度增加到0.4%時，重組人Ⅲ型膠原蛋白出現(xiàn)大量降解，菌體量也出現(xiàn)下降。在甲醇濃度為0.2%時，重組人Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量達(dá)到最大值8 g?L-1，菌體量也達(dá)到0.45 g?mL-1。說明重組人Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)需要大量的甲醇補(bǔ)充碳源，但甲醇濃度不能大于0.4%。

圖2 不同甲醇濃度的生長曲線

圖3 不同濃度甲醇誘導(dǎo)重組人Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

參照Invitrogen公司提供的巴氏畢赤酵母發(fā)酵方案，在畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)重組人Ⅲ型膠原蛋白的發(fā)酵過程中，根據(jù)溶養(yǎng)控制流加甲醇，不能有效地監(jiān)控甲醇濃度，不能有效地提供菌體生長及表達(dá)重組人Ⅲ型膠原蛋白所需要的碳源。重組人Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量低，可能是誘導(dǎo)時碳源量不能滿足重組人Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)所需要的營養(yǎng)，需要增加優(yōu)化甲醇的補(bǔ)加量。

利用甲醇傳感器，在線檢測發(fā)酵液中甲醇濃度。由于該傳感器靈敏度高，響應(yīng)時間短，因此能有效地控制甲醇的流加，使甲醇的濃度維持恒定。本研究結(jié)果表明，采用兩階段發(fā)酵法對重組畢赤酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，可以獲得重組人Ⅲ型膠原蛋白的高效表達(dá)。第一階段增加重組酵母菌的生物量，在培養(yǎng)至溶氧上升時，以流速為250 mL?h-1持續(xù)流加50%甘油4 h，菌體濕重達(dá)到120-130 g?L-1時停止加入甘油。第二階段，加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在加入甲醇的時候控制甲醇濃度在0.2%，菌體量可達(dá)0.45 g?mL-1，重組人Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量達(dá)到8 g?L-1。

通過重組畢赤酵母菌兩階段發(fā)酵法，并在誘導(dǎo)時準(zhǔn)確控制甲醇濃度，能更準(zhǔn)確穩(wěn)定的控制發(fā)酵過程，提高重組人Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)量。本研究為重組人Ⅲ型膠原蛋白的產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。