于恒響 周黎明

（1. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041）

結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)是最為常見(jiàn)的腫瘤之一，根據(jù)2018年全球癌癥報(bào)告，結(jié)直腸癌新發(fā)病例占全部病例的6.1%，位居第四位[1]。在我國(guó)，報(bào)告顯示2015年中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均位居第五位[2]。研究顯示，結(jié)直腸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的五年生存率分別為81.2%、71.7%、58.4%和14.4%[3]，然而由于發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，盡管早期結(jié)直腸癌患者擁有較高的五年存活率，但只有30%-40%患者在結(jié)直腸癌早期被確診，60%-70%患者直到晚期時(shí)才能被確診[4]。因此，結(jié)直腸癌的早期篩查及診斷具有重要意義。然而報(bào)道顯示，在美國(guó)，2018年50歲至54歲人群篩查率僅為48%，55歲至64歲人群中的篩查率也只有68%[5]。目前，美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)（American Cancer Society，ACS）建議50歲以上人群定期進(jìn)行結(jié)直腸癌篩查，包括：每年進(jìn)行一次糞便免疫化學(xué)試驗(yàn)（Fecal immunochemical test，F(xiàn)IT），高靈敏度糞便隱血試驗(yàn)（High sensitivity guaiac fecal occult blood test，HSgFOBT）每年一次，多靶點(diǎn)糞便DNA檢測(cè)（Multitarget stool DNA test，mtsDNA）每3年一次，結(jié)腸鏡檢查每10年一次，CT結(jié)腸造影（CT colonography，CTC）每5年一次，柔性乙狀結(jié)腸鏡檢查（Flexible sigmoidoscopy，F(xiàn)S）每5年一次[6]。然而這些檢查大多是侵入性的，具有有創(chuàng)性，無(wú)法進(jìn)行長(zhǎng)期檢測(cè)，患者依從性不佳，且由于腫瘤的異質(zhì)性，單一組織樣本難以反映腫瘤的整體情況等缺點(diǎn)。除此之外，有研究表明與糞便標(biāo)本相比78%患者更愿意提供血液樣本[7]。因此，目前越來(lái)越多的研究投入到尋找基于血液樣本的結(jié)直腸癌診斷方法，人們通常稱之為液體活檢（Liquid biopsy）。本文就ctDNA在結(jié)直腸癌診斷應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ctDNA的生物學(xué)特性

血液中含有許多有潛力用作生物標(biāo)記物的物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、外泌體、核小體、循環(huán)癌細(xì)胞和循環(huán)腫瘤DNA等[8]。其中，循環(huán)腫瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）正逐漸受到人們關(guān)注。1948年，Mandel和Métais首次在人類血液中發(fā)現(xiàn)了非細(xì)胞游離核酸（Cell free DNA，cfDNA）[9]。cfDNA是在血液、糞便、尿液或唾液中均可發(fā)現(xiàn)的游離于細(xì)胞外的基因片段，它由核酸鏈組成，核酸鏈來(lái)源于多種細(xì)胞，包括但不限于腫瘤細(xì)胞。1989年，Stroun等通過(guò)比較DNA鏈的熱力學(xué)穩(wěn)定性，首次證實(shí)腫瘤患者外周血中的一部分cfDNA來(lái)源于腫瘤細(xì)胞，稱之為ctDNA[10]。ctDNA是cfDNA中來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的部分，由腫瘤凋亡、壞死，或循環(huán)腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)生，但其具體機(jī)制尚不清楚[4]。Gasparello等用LoVo和LS174T兩種細(xì)胞系進(jìn)行了體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在體外LoVo細(xì)胞系比LS174T細(xì)胞更有效地釋放ctDNA，而相反當(dāng)這些腫瘤細(xì)胞作為異種移植物在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)，LS174T 細(xì)胞系在血液中ctDNA含量更加豐富，且這種差別與“管家”因素?zé)o關(guān)，如細(xì)胞增殖，腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)，壞死或微血管密度。顯示在細(xì)胞和全身兩個(gè)方面存在有兩種不同的途徑影響ctDNA的釋放[11]。

ctDNA長(zhǎng)度在166 bp左右[12]，半衰期從15分鐘到幾個(gè)小時(shí)不等，通常被腎臟、肝臟和脾臟迅速清除。淋巴系統(tǒng)和血液的各種生理過(guò)濾（清除、降解等）也決定了血液循環(huán)中ctDNA的數(shù)量[13]。不同類型腫瘤ctDNA檢出率不同，Bettegowda等報(bào)道結(jié)直腸癌、胃食管癌、胰腺癌和乳腺癌患者中ctDNA的檢出率分別為73%、57%、48%和50%；不同分期患者ctDNA檢出率也不同，有47%的Ⅰ期癌癥患者可檢出ctDNA，而 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期癌的ctDNA檢出率分別為 55%、69% 和82%[14]。ctDNA的特征在于存在癌癥相關(guān)的遺傳和表觀遺傳突變，例如點(diǎn)突變，基因組序列重排，拷貝數(shù)變異（Copy number variations，CNV），微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（Microsatellite instability，MSI），雜合性缺失（Loss of heterozygosity，LOH）和DNA甲基化[15]。這些特征有助于將它們與剩余cfDNA片段區(qū)分開(kāi)來(lái)，從而使ctDNA成為能夠用于早期診斷與篩查，監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)、進(jìn)展和復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)志物。

2 ctDNA在結(jié)直腸癌診斷應(yīng)用

目前，已有多項(xiàng)研究闡釋了ctDNA作為生物標(biāo)記物用于結(jié)直腸癌診斷的價(jià)值。Yu等研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者血液中ctDNA含量高于健康人，患者ctDNA樣本與腫瘤組織樣本的KRAS和BRAF基因突變一致性為92%[16]。Yang等研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者血液ctDNA濃度隨腫瘤大小增加而增加，I期與IV期患者之間ctDNA濃度具有顯著差異。ctDNA 的檢出率高于目前5種常用腫瘤生物標(biāo)志物，包括癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）、甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP）、糖類抗原19-9（Carbohy drate antigen 19-9，CA19-9）、癌抗原125（Cancer antigen125，CA125）、癌抗原72-4（Cancerantigen72-4，CA72-4）[17]。Hsu等檢測(cè)了32例結(jié)直腸癌患者的ctDNA樣本和腫瘤組織樣本中的基因變異，發(fā)現(xiàn)他們之間的一致性很高（85%），且ctDNA水平的變化與腫瘤縮小顯著相關(guān)；與ctDNA下降<80%的患者相比，治療后ctDNA下降>80%的患者無(wú)進(jìn)展生存期更長(zhǎng)（HR，0.22）[18]。He等研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的分期、大小、浸潤(rùn)深度與檢測(cè)靈敏度呈正相關(guān)，而不同部位的腫瘤間檢測(cè)靈敏度無(wú)差異。浸潤(rùn)性結(jié)直腸癌比潰瘍性和突出性結(jié)直腸癌表現(xiàn)出更高的敏感性，而不同組織學(xué)類型之間的敏感性沒(méi)有差異。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌（M1）比無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌有更高的敏感性，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌（N1和N2）與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[19]?？梢?jiàn)，ctDNA檢測(cè)相比其它常用腫瘤生物標(biāo)志物具有優(yōu)勢(shì)，且能一定程度反應(yīng)腫瘤負(fù)荷和腫瘤狀態(tài)，在結(jié)直腸癌早期診斷應(yīng)用前景廣泛。

對(duì)ctDNA進(jìn)行基因檢測(cè)亦能用于結(jié)直腸癌早期診斷。Luo等對(duì)1493名結(jié)直腸癌高危人群進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究，發(fā)現(xiàn)ctDNA甲基化標(biāo)記cg10673833檢測(cè)確定21例結(jié)直腸癌患者中的19例，8例原位結(jié)直腸癌患者中的7例，敏感性為89.7%（95%CI，0.727～0.978），特異性為86.8%（95%CI，0.849～0.884），AUC為0.90（95%CI，0.885～0.942）；對(duì)晚期癌前病變的敏感性為33.3%（95%CI，0.231～0.449），遠(yuǎn)高于無(wú)癌或晚期癌前病變的陽(yáng)性率（12.1%；95%CI，0.101～0.139），有望成為一種有效的非侵入性的結(jié)直腸癌篩查工具[20]。Church等研究發(fā)現(xiàn)了ctDNA中 SEPT9基因甲基化檢測(cè)敏感度為48.2%（95%CI 32.4%～63.6%）；結(jié)直腸癌Ⅰ～Ⅳ期分別為35.0%、63.0%、46.0%和77.4%；特異性91.5%（95%CI 89.7%～93.1%），顯示其在結(jié)直腸癌篩查或診斷中的價(jià)值[21]。Cohen等人描述了一種多分析物試驗(yàn)（Cancer Seek），通過(guò)評(píng)估循環(huán)中蛋白和ctDNA突變水平，檢測(cè)八種常見(jiàn)癌癥，包括結(jié)直腸癌；使用對(duì)總共16種不同癌癥基因中的多個(gè)突變的分析結(jié)合選定的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，作者在43%的I期結(jié)直腸癌患者中檢測(cè)到ctDNA，而在II-III期檢測(cè)率為70%，特異性為99%[22]。Osumi等通過(guò)下一代測(cè)序（NGS）對(duì)血漿中結(jié)直腸癌常見(jiàn)的14種突變基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)血漿中突變基因頻率與腫瘤轉(zhuǎn)移（肝臟，淋巴結(jié)，轉(zhuǎn)移器官數(shù)），腫瘤標(biāo)志物（CEA，CA19-9，LDH）和腫瘤直徑（最大值）顯著相關(guān)[23]。Ou等利用集成化綜合液滴數(shù)字檢測(cè)（Integrated comprehensive droplet digital detection，IC3D）數(shù)字PCR系統(tǒng)提出了一種新的液體活檢方法，該系統(tǒng)可大大提升ctDNA檢測(cè)靈敏度，比現(xiàn)有的商業(yè)液體活檢ddPCR和qPCR平臺(tái)高50-1000倍。目前，該團(tuán)隊(duì)正在進(jìn)行一項(xiàng)臨床研究評(píng)估IC3D ctDNA檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)早期結(jié)直腸癌的微小殘留病變和復(fù)發(fā)的預(yù)后的意義[24]。

ctDNA也可用于結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)，Scholer等對(duì)27名結(jié)直腸癌患者進(jìn)行了縱向追蹤，顯示所有復(fù)發(fā)患者術(shù)后均檢測(cè)到ctDNA（n=14），而非復(fù)發(fā)患者未檢測(cè)到ctDNA。另外利用ctDNA檢測(cè)復(fù)發(fā)，與CT相比，平均提前9.4個(gè)月[25]。Symonds等檢測(cè)了144名患者的ctDNA BCAT1/IKZF1基因甲基化突變和CEA水平，顯示甲基化ctDNA檢測(cè)對(duì)復(fù)發(fā)的敏感性為66.0%（95%CI，57.1%-69.3%），顯著高于CEA（31.9%；95%CI，22.8%-36.6%）；特異性無(wú)差異（ctDNA，97.9%；95%CI，93.2%-99.6%；CEA，96.4%；95%CI，91.4%-99.0%）[26]。Benesova等研究顯示在22名復(fù)發(fā)患者中，22例ctDNA檢測(cè)陽(yáng)性（100%），而影像學(xué)檢測(cè)到16例陽(yáng)性（73%），腫瘤標(biāo)志物升高15例（68%）[27]。Tie等檢測(cè)了96例III期結(jié)腸癌患者的術(shù)后樣本，發(fā)現(xiàn)20例中可檢測(cè)到循環(huán)腫瘤DNA，并且與較低的無(wú)復(fù)發(fā)生存率相關(guān)（風(fēng)險(xiǎn)比，3.8；95%CI，2.4-21.0）[28]。Tarazona等同樣報(bào)道了在接受輔助化療的結(jié)直腸癌患者中，治療后檢測(cè)到ctDNA與復(fù)發(fā)相關(guān)（HR 10.02）[29]。

3 總結(jié)與展望

ctDNA檢測(cè)具有非侵入、特異性高、敏感性高、以及能夠全面反映腫瘤異質(zhì)性等優(yōu)點(diǎn)，在結(jié)直腸癌早期診斷中應(yīng)用前景廣泛。在預(yù)測(cè)化療療效和臨床預(yù)后[30]，全面準(zhǔn)確提供患者體內(nèi)不同腫瘤的信息[31]，檢測(cè)腫瘤耐藥性[32]等方面亦具有使用價(jià)值。但ctDNA檢測(cè)仍存在成本高、技術(shù)復(fù)雜、不同方法的結(jié)果尚無(wú)固定標(biāo)準(zhǔn)、可靠性與穩(wěn)定性無(wú)法確定，且ctDNA產(chǎn)生機(jī)制尚不清楚等問(wèn)題[33,34]。 因此2018年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（American Society of Clinical Oncology，ASCO）和美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)（College of American Pathologists，CAP）的一篇聯(lián)合評(píng)論認(rèn)為沒(méi)有臨床實(shí)用性的證據(jù)表明ctDNA檢測(cè)在早期癌癥，治療監(jiān)測(cè)或殘留疾病檢測(cè)中的臨床有效性。除臨床試驗(yàn)之外，沒(méi)有臨床有效性或臨床效用的證據(jù)表明ctDNA測(cè)定可用于癌癥篩查[35]。ctDNA在結(jié)直腸癌診斷的應(yīng)用仍需要進(jìn)一步研究。