王艷國(guó)，周紅兵，郝海梅，吳 桐，常 虹，石松利,2

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院蒙中藥活性物質(zhì)與功能研究所)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis)亦稱(chēng)間質(zhì)性肺病，是由多種彌慢性肺間質(zhì)疾病引起的病理改變，亦是對(duì)肺損傷過(guò)度修復(fù)的結(jié)果，晚期多引起心、肺功能衰竭以及呼吸衰竭而導(dǎo)致死亡，成為呼吸系統(tǒng)的難治疾病，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康[1]。近年來(lái)，隨著空氣污染以及不良生活習(xí)慣的影響，肺纖維化發(fā)病率逐年遞增，但尚無(wú)理想藥物和治療方法，為此尋找能夠治療肺纖維化的藥物具有十分重要的意義。

蒙古扁桃(Amygdalus mongolica)，蒙名烏蘭-布衣勒斯，為蒙古高原特有的阿拉善荒漠種，薔薇科扁桃屬旱生落葉灌木[2-3]。作為一種傳統(tǒng)中蒙藥可代“郁李仁”以種仁入藥，具有治療咽喉干燥、干咳及支氣管炎的作用[4-5]。課題組鄭倩男等[6-8]前期研究表明蒙古扁桃石油醚提取物能有效調(diào)節(jié)血脂水平，具有抗氧化和保肝的作用。吳桐等[9-10]研究表明蒙古扁桃石油醚提取物對(duì)治療四氯化碳所導(dǎo)致的大鼠肝纖維化效果較好。賈小葉等[11]研究表明蒙古扁桃藥材石油醚部位可以發(fā)揮抗大鼠腎纖維化的作用。同時(shí)有研究表明中醫(yī)藥對(duì)肺纖維化有較好的治療效果[12]。因此基于蒙古扁桃的傳統(tǒng)藥理作用，本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，利用博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型，探討蒙古扁桃石油醚提取物對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的治療作用。

1 對(duì)象與方法

1.1藥物與動(dòng)物 蒙古扁桃，采自阿拉善雅布來(lái)戈壁，經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院石松利教授鑒定為蒙古扁桃藥材干燥成熟種子；注射用鹽酸博來(lái)霉素(批號(hào)：540402)，購(gòu)自日本化藥株式會(huì)社；醋酸潑尼松片(批號(hào)：140905)，購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司；60只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部)，許可證號(hào)SCXK(京)2011-0012。于室溫(25±2)℃，相對(duì)濕度(50±5)%條件下飼養(yǎng)。

1.2試劑與儀器 MDA試劑盒(批號(hào)：20150421)、SOD試劑盒(批號(hào)：20150505)、HYP試劑盒(批號(hào)：20150527)、總蛋白定量測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20150519)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；DZW-8-8型水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng))；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))；MH-250型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；CX31顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.3方法

1.3.1蒙古扁桃石油醚提取物的制備 蒙古扁桃種子去殼洗凈后攪碎成顆粒，在料液比1∶10的條件下運(yùn)用索氏提取法，分別采用95 %、50 %乙醇水浴回流，得到粗提液后回收溶劑，使藥液呈浸膏狀。將浸膏以石油醚為溶劑萃取，并減壓濃縮萃取物，即得蒙古扁桃石油醚提取物，得率為13.7 %。按給藥組高、中、低劑量1.75 g/kg、1.25 g/kg、0.75 g/kg，用0.5 %羧甲基纖維素鈉將蒙古扁桃石油醚提取物配制成濃度為0.024 g/mL的溶液。大鼠高、中、低劑量組給藥劑量分別為10 mL/kg、7.14 mL/kg、4.28 mL/kg，所有灌胃藥液均置于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2動(dòng)物分組與用藥 60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)至體重為(300±20)g時(shí)，按體重隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥強(qiáng)的松組、蒙古扁桃石油醚提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。

1.3.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 用1 %水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，開(kāi)口器固定口腔，拉出舌，用壓舌板壓舌腹，在額鏡直視下，趁動(dòng)物吸氣瞬間迅速進(jìn)行氣管插管(52 mm,4～5 cm)，動(dòng)物模型組大鼠按5 mL/kg緩慢注入1 mg/mL的博來(lái)霉素，之后立即旋轉(zhuǎn)搖晃大鼠，使藥液在肺內(nèi)均勻分布[13-14]。各組于造模24 h后灌胃給藥，1次/d，連續(xù)灌胃4周。

1.3.4標(biāo)本采集 于造模后第28 d處死大鼠，用10 %水合氯醛根據(jù)大鼠體重進(jìn)行腹腔注射麻醉后，使其處于仰臥位，打開(kāi)腹腔，取腹主動(dòng)脈血以及肺、心組織并稱(chēng)重(測(cè)定肺、心臟器系數(shù))；將肺組織切塊分裝，用液氮速凍后于-80℃冰箱中保存(后期進(jìn)行HE、Masson染色及測(cè)定組織HYP)。采集腹主動(dòng)脈血于4 ℃、以6 000轉(zhuǎn)/min冷凍離心10 min，分離血清，用液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存(檢測(cè)血清SOD、MDA)。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般狀況 對(duì)照組大鼠活潑好動(dòng)，食量大，體型肥碩，皮毛光澤，體重逐漸增加，呼吸平穩(wěn)；模型組精神不振，行動(dòng)遲緩，拱背蜷縮，皮毛枯槁、無(wú)光澤，身體較其它組消瘦，呼吸急促、有咳喘現(xiàn)象。蒙古扁桃石油醚提取物不同劑量組和陽(yáng)性藥強(qiáng)的松組灌胃治療1周后大鼠狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，食量增大，體重逐漸增加且拱背蜷縮減輕。

2.2蒙古扁桃石油醚提取物對(duì)肺纖維化大鼠肺、心系數(shù)的影響 如圖1所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺、心系數(shù)升高(P<0.05)；與模型組相比，蒙古扁桃石油醚提取物低劑量組大鼠肺系數(shù)降低，高、低劑量組與陽(yáng)性藥組均能降低大鼠心系數(shù)(P<0.05)。

2.3蒙古扁桃石油醚提取物對(duì)肺纖維化大鼠肺病理組織學(xué)的影響

2.3.1大鼠肺組織HE染色 結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠肺組織肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔未見(jiàn)增厚；模型組大鼠肺組織肺泡間隔明顯增厚，肺泡結(jié)構(gòu)消失，廣泛的纖維灶形成；蒙古扁桃各給藥組與陽(yáng)性藥組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺纖維化程度較模型組減輕，見(jiàn)圖2。

2.3.2Masson染色 鏡下觀(guān)察所見(jiàn)假手術(shù)組為正常肺組織結(jié)構(gòu)，僅小部分肺泡周?chē)蛑夤鼙谳p微增厚；模型組肺組織可見(jiàn)全視野纖維化改變；蒙古扁桃各給藥組肺泡或支氣管壁中度增厚，部分肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞，有小范圍纖維灶形成，肺纖維化程度較模型組減輕，見(jiàn)圖3。

2.4蒙古扁桃石油醚提取物對(duì)肺纖維化大鼠肺組織中HYP的影響 如圖4所示，與假手術(shù)組相比，模型組肺組織HYP含量增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，蒙古扁桃石油醚提取物高、低劑量組能降低肺組織HYP含量(P<0.05)。

2.5蒙古扁桃石油醚提取物對(duì)肺纖維化大鼠血清SOD，MDA的影響 如圖5所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的血清SOD下降，MDA增高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，蒙古扁桃石油醚提取物高、中、低劑量組與陽(yáng)性藥組均能提高血清SOD，降低血清MDA含量(P<0.05)。

3 討論

一次性氣管內(nèi)灌注博來(lái)霉素誘導(dǎo)的動(dòng)物肺纖維化模型是目前國(guó)內(nèi)外常用、受認(rèn)可的肺纖維化造模方法[15]。本實(shí)驗(yàn)利用該模型探究蒙古扁桃石油醚提取物對(duì)肺纖維化這一具體病理改變的治療作用。課題組前期實(shí)驗(yàn)中對(duì)蒙古扁桃石油醚提取物降血脂作用進(jìn)行了量效關(guān)系確定，設(shè)置生藥量為0.1875 g/kg、0.375 g/kg、0.75 g/kg、1.5 g/kg、3.0 g/kg的不同實(shí)驗(yàn)劑量組，結(jié)果顯示其降血脂作用的有效劑量范圍是(0.5～1.5)g/kg。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，蒙古扁桃石油醚提取物在生藥量(0.75～1.5)g/kg對(duì)肝纖維化大鼠肝臟具有一定保護(hù)作用，依據(jù)器官纖維化異病同治的研究思路，本次實(shí)驗(yàn)選取0.75 g/kg、1.25 g/kg、1.75 g/kg的生藥劑量[9]。

肺系數(shù)是反應(yīng)肺纖維化程度的指標(biāo)之一，其高低與肺重量和體重密切相關(guān)，其中肺重量增加是肺系數(shù)增大的主要原因。長(zhǎng)期肺纖維化改變會(huì)引起呼吸衰竭，導(dǎo)致一定程度的血氧分壓下降和二氧化碳分壓上升，從而引起反射性心率加快、心肌收縮能力增強(qiáng)及心排出量增加，最終導(dǎo)致心臟增大，從而心系數(shù)增大。本研究結(jié)果顯示蒙古扁桃石油醚提取物低劑量組能降低大鼠肺、心系數(shù)；高劑量組能降低大鼠心系數(shù)，說(shuō)明蒙古扁桃石油醚提取物具有一定的對(duì)抗博萊霉素致大鼠肺損傷的作用。HYP是膠原蛋白的組成成分，約占其氨基酸總量的13.4 %，通過(guò)對(duì)肺組織中HYP含量的測(cè)定可以了解其膠原蛋白分解代謝情況，其含量可間接反映組織纖維化程度[16]。SOD可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過(guò)氧化，其活力的高低對(duì)機(jī)體清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力有著間接反應(yīng)[17]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低體現(xiàn)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度[18]。研究結(jié)果表明，蒙古扁桃石油醚提取物低劑量組可降低血清MDA以及肺組織HYP水平，提高血清SOD含量；蒙古扁桃石油醚提取物中劑量組可降低大鼠血清MDA含量，提高血清SOD含量；蒙古扁桃石油醚提取物高劑量組可降低大鼠血清MDA及肺組織HYP水平，提高血清SOD含量。提示蒙古扁桃石油醚提取物具有清除活性氧，提高機(jī)體抗氧化能力以及抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，從而達(dá)到抗肺纖維化的目的。

綜上所述，蒙古扁桃石油醚提取物具有較好的抗肺纖維化作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為蒙古扁桃藥用價(jià)值的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與研究依據(jù)。