孫鵬　葉祥明　田亮　李厥寶　程瑞動(dòng)

[摘要] 目的 探討脊髓損傷后下丘腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，確認(rèn)脊髓損傷導(dǎo)致大腦損害的特點(diǎn)及其在相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。 方法 18只SD大鼠隨機(jī)分為兩組：假模組（Sham組）和脊髓損傷組（SCI組），以改良的Allens撞擊法制作脊髓損傷動(dòng)物模型，常規(guī)飼養(yǎng)，分別于8周取大鼠下丘腦組織，應(yīng)用免疫熒光染色法觀察脊髓損傷大鼠下丘腦組織c-Fos表達(dá)，TUNEL法觀察兩組下丘腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)兩組大鼠下丘腦炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表達(dá)。 結(jié)果 脊髓損傷后8周，SCI組較Sham組下丘腦c-Fos表達(dá)明顯增加（P<0.05），同時(shí)下丘腦可見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞，主要表現(xiàn)為胞漿減少，細(xì)胞核深染、固縮在一邊;SCI組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比Sham組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;SCI組大鼠下丘腦包括TNF-α、IL-1β、IL-6等多種炎癥因子水平較Sham組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 脊髓損傷可對(duì)下丘腦造成損害，表現(xiàn)為下丘腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)明顯增加，其可能與c-Fos表達(dá)有關(guān)，脊髓損傷后對(duì)下丘腦的損害可能是某些并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的發(fā)病機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] 脊髓損傷;下丘腦;c-Fos;神經(jīng)細(xì)胞凋亡;炎癥反應(yīng)

[中圖分類號(hào)] R651.2 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）21-0045-04

Effect of spinal cord injury on the expression of c-Fos in hypothalamus and neuronal apoptosis

SUN Peng YE Xiangming TIAN Liang LI Juebao CHENG Ruidong

Department of Rehabilitation Medicine， Zhejiang Provincial People's Hospital， People's Hospital of Hangzhou Medical College， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To investigate the neuronal apoptosis of hypothalamus after spinal cord injury， and to confirm the characteristics of spinal cord injury leading to brain damage and its possible mechanism in the occurrence and development of related complications. Methods 18 SD rats were randomly divided into two groups including sham module （Sham group） and spinal cord injury group（SCI group）. The animal model of spinal cord injury was made by modified Allen's impact method. And the rats were conventionally fed. Rat hypothalamus tissues were taken at the 8th week. The expression of c-Fos in the hypothalamus of spinal cord injury rats was observed by immunofluorescence staining. The neuronal apoptosis of hypothalamus in the two groups was observed by TUNEL method. The expressions of hypothalamic inflammatory factors（TNF-α， IL-1β， IL-6） of two groups were detected by ELISA method. Results Eight weeks after spinal cord injury， the expression of c-Fos in the hypothalamus of the SCI group was significantly higher than that of the Sham group（P<0.05）. At the same time， there were obvious apoptotic cells in the hypothalamus. The main manifestations werecytoplasm reduction， nucleus deep staining and shrinkage of the nucleus on one side. The number of TUNEL positive cells in the SCI group was significantly higher than that in the Sham group（P<0.01）. The levels of various inflammatory factors in the hypothalamus of the SCI group， including TNF-α， IL-1β， IL-6， were higher than those in Sham group， and the difference between the two groups was statistically significant（P<0.01）. Conclusion Spinal cord injury can cause damage to the hypothalamus， which is manifested by a marked increase in neuronal apoptosis and inflammatory response. This may be related to the expression of c-Fos. The damage of spinal cord injury to the hypothalamus may be the pathogenesis of the development of certain complications.

[Key words] Spinal cord injury; Hypothalamus; c-Fos; Neuronal apoptosis; Inflammatory response

脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）造成脊髓連續(xù)性結(jié)構(gòu)和功能的破壞，切斷了大腦與脊髓之間的聯(lián)系，導(dǎo)致?lián)p傷平面以下運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能的障礙及多種代謝紊亂，SCI中斷了大腦與脊髓之間的反饋，致使損傷后的脊髓長(zhǎng)期處于異常的應(yīng)激狀態(tài)[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后腦部能夠發(fā)生廣泛而持續(xù)的炎癥，造成神經(jīng)細(xì)胞逐漸凋亡，導(dǎo)致患者認(rèn)知障礙和精神障礙疾病的出現(xiàn)[3-4]，神經(jīng)系統(tǒng)中，c-Fos基礎(chǔ)表達(dá)水平很低，不易被檢測(cè)到，只有在神經(jīng)系統(tǒng)受到炎癥因子刺激時(shí)才被激活，繼而合成c-Fos蛋白。c-Fos的表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切[5]，下丘腦是調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)的樞紐，是應(yīng)激反應(yīng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)系統(tǒng)，調(diào)控著人體諸如體溫、攝食、激素水平、血糖和內(nèi)分泌腺活動(dòng)等重要的基本生理功能，下丘腦損傷被認(rèn)為是部分情緒障礙疾病及代謝性疾病發(fā)病的腦內(nèi)重要機(jī)制之一[6-8]，目前尚無(wú)研究報(bào)道脊髓損傷是否會(huì)對(duì)下丘腦造成損害，本研究旨在研究脊髓損傷后，下丘腦c-Fos的表達(dá)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎癥發(fā)生情況，明確脊髓損傷后對(duì)下丘腦的影響，為探討脊髓損傷內(nèi)分泌及代謝性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

納入18只健康SD大鼠（6～8周齡，雄性，體重150～180 g，普通級(jí)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，經(jīng)浙江省人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)）為研究對(duì)象，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為假模組（Sham組）和脊髓損傷組（SCI組），每組各9只。普通飼料組進(jìn)食國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料，每日自由飲水。采用改良Allens法制備脊髓不完全性損傷大鼠模型，具體方法見(jiàn)模型制備介紹，Sham組實(shí)施相同的手術(shù)過(guò)程但不進(jìn)行打擊造成脊髓損傷。

1.2 脊髓損傷模型制備

SCI動(dòng)物模型制備采用改良的Allens撞擊法[7]。腹腔注射5%水合氯醛[國(guó)藥集團(tuán)（10009218）（300 mg/kg）體重]麻醉大鼠，背部剃毛后消毒，棘突定位后，以T10為中心作長(zhǎng)約3 cm皮膚切口，鈍性剝離脊旁肌肉暴露脊椎，微型咬骨鉗咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，暴露脊髓，以上操作過(guò)程需特別注意硬脊膜完整。使用MASCIS Impactor（W.M. Keck Center of Rutgers University，USA）精確撞擊（10 g，25 mm），造成脊髓不完全損傷。模型成功標(biāo)志：出現(xiàn)大鼠尾巴痙攣性擺動(dòng)，雙下肢軀體回縮樣撲動(dòng)，脊髓打擊部位淤血，雙下肢馳緩性癱瘓。手術(shù)結(jié)束后，逐層縫合切口，消毒表皮。術(shù)后注意保溫，單籠飼養(yǎng)，一日2次手工擠壓膀胱幫助排尿，并保持小鼠身體干燥，每日測(cè)量體重，給予自由攝食與飲水，飼養(yǎng)8周后行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 組織切片制備

大鼠飼養(yǎng)8周后斷頭處死，冰上快速取腦組織并分離出下丘腦。將分離腦組織固定于4%多聚甲醛中[國(guó)藥集團(tuán)（10009218）]24 h。隨后將目的部位腦組織修平整后放于脫水盒內(nèi)。①脫水：將腦組織分別放進(jìn)不同酒精濃度的脫水盒里進(jìn)行脫水：50%酒精0.5 h→60%酒精0.5 h→75%酒精0.5 h→85%酒精0.5 h→90%酒精0.5 h→95%酒精0.5 h→無(wú)水乙醇I 0.5 h→無(wú)水乙醇Ⅱ 0.5 h→二甲苯Ⅰ 10 min→二甲苯Ⅱ 10 min→蠟Ⅰ 0.5 h 62℃→蠟Ⅱ 0.5 h 62℃→蠟Ⅲ 0.5 h 62℃。②包埋：包埋機(jī)內(nèi)包埋浸好蠟的腦組織，首先將融化的蠟放入包埋框，將組織從脫水盒內(nèi)取出，在蠟塊凝固之前按照包埋面的要求放入包埋框，并貼上對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽，然后將蠟塊置于-20℃冷凍臺(tái)冷卻，待蠟?zāi)毯笕〕霾⑿拚瀴K。③切片：將修整好的蠟塊置于切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司）上切片，厚度7 μm。切片漂浮于攤片機(jī)將組織展平，用載玻片將其撈起，并放進(jìn)62℃烘箱內(nèi)烤片。待水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫熒光染色

將組織沖洗，去除殘留的固定液和雜質(zhì)，脫水、浸蠟、包埋、切片，切片脫蠟后抗原修復(fù)，后PBS沖洗3次，每次5 min，加入兔抗大鼠c-Fos抗體（1：2000）（ThermoFisher，OSR00004W），4℃過(guò)夜避光孵育，次日復(fù)溫30 min，PBS洗3次，5 min/次，加入羊抗兔熒光二抗（Proteintech，USA），37℃培養(yǎng)30 min，PBS洗3次，5 min/次，DAPI[Affinity（DF7097）]染色5 min，PBS洗3次，5 min/次，在顯微鏡上觀察。

1.5 TUNEL染色

TUNEL試劑盒購(gòu)于瑞士Roche Applied Science（11684817910）。依次將切片放入二甲苯Ⅰ 30 min→二甲苯Ⅱ 30 min→無(wú)水乙醇Ⅰ10 min→無(wú)水乙醇Ⅱ5 min→95%酒精5 min→90%酒精5 min→80%酒精5 min→70%酒精5 min→蒸餾水洗。PBS洗3次，每次5 min。將ProteinK200×儲(chǔ)液用TBS稀釋成1×的工作液，每張玻片加100 μL用濕盒孵育放在37℃ 培養(yǎng)箱15 min。切片浸入PBS 5 min每次洗3遍，每張切片取1 μL TDT和1 μL DIG-dUTP到18 μL Labeling Buffer里面混勻，TDT酶反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用。每張切片滴加20 μL TDT酶反應(yīng)液，放入濕盒中，37℃孵育2 h。PBS洗3次，每次5 min，每張玻片滴加50 μL封閉液，室溫孵育30 min。切片不洗滌，直接棄去封閉液，一抗用稀釋液1：100的稀釋，每張切片滴加100 μL生物素標(biāo)記的一抗。37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗用稀釋液1：100的稀釋，每張玻片滴加50 μL。37℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，注意避光操作，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，拍照存留。

1.6 ELISA法檢測(cè)各組大鼠下丘腦炎癥因子表達(dá)

標(biāo)準(zhǔn)品[ELSA試劑盒（Neobioscience，China）]按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋，將標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本通用稀釋液加入空白孔，標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入其余相應(yīng)孔內(nèi)，將反應(yīng)孔用封板膠紙封住，放入36℃孵育箱內(nèi)孵育90 min;洗板后抗體稀釋液加入空白孔內(nèi)，抗體工作液（100 μL/孔）加入其余孔內(nèi)，避光孵育。酶結(jié)合物工作液避光室溫放置，將酶結(jié)合物稀釋液加入空白孔，酶結(jié)合物工作液（100 μL/孔）加入其余孔，避光孵育30 min;洗板5次，加入100 μL/孔顯色底物，36℃孵育箱避光孵育15 min，最后加入終止液100 μL/孔，混勻后即刻測(cè)量OD450值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖像分析采用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件，每只大鼠選取3張切片，每張切片在損傷區(qū)隨機(jī)采集5個(gè)高倍視野。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓損傷后一般情況觀察

模型制備大鼠打擊后可見(jiàn)尾巴痙攣性擺動(dòng)，雙下肢軀體回縮樣撲動(dòng)，脊髓打擊部位可見(jiàn)淤血。待大鼠蘇醒后，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物靜臥少動(dòng)，氣息微弱，食欲減退，數(shù)小時(shí)后可發(fā)現(xiàn)大鼠雙后肢感覺(jué)遲鈍、運(yùn)動(dòng)功能喪失，呈雙下肢拖地爬行。

2.2 脊髓損傷后下丘腦c-Fos表達(dá)

脊髓損傷后8周，由封三圖5A中可以看出，c-Fos主要表達(dá)于胞漿;相比Sham組（0.22±0.03），SCI組（0.29±0.04）大鼠下丘腦組織中c-Fos明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明脊髓損傷對(duì)大鼠下丘腦組織中c-Fos表達(dá)有著重要影響，見(jiàn)封三圖5B。

2.3 脊髓損傷后下丘腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡

脊髓損傷8周后，光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)Sham組表達(dá)少量陽(yáng)性細(xì)胞，SCI組可見(jiàn)大量表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，主要表現(xiàn)為胞漿減少，細(xì)胞核深染、固縮在一邊（陽(yáng)性結(jié)果為綠色的圓形顆粒狀細(xì)胞），見(jiàn)封三圖6A;SCI組（11.46±0.14）TUNEL細(xì)胞凋亡指數(shù)比Sham組（8.02±0.28）明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)封三圖6B。

2.4 兩組大鼠下丘腦炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）水平變化

為觀察SCI大鼠下丘腦炎癥反應(yīng)情況，采用ELISA法檢測(cè)兩組大鼠多種促炎細(xì)胞因子的水平，結(jié)果表明：脊髓損傷后，與Sham組比較，SCI組大鼠下丘腦中的多種促炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表1。

3 討論

SCI患者全世界數(shù)百萬(wàn)人，這些患者大部分終身殘疾[9]。脊髓中存在運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)的傳導(dǎo)束及下行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，脊髓損傷后會(huì)擾亂神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的聯(lián)系及通訊，導(dǎo)致基本神經(jīng)功能的喪失和肢體癱瘓，不僅會(huì)給患者本人帶來(lái)生理和心理上的極大傷害，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還會(huì)對(duì)家庭乃至整個(gè)社會(huì)造成巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每天大約有30人診斷為脊髓損傷[10]。這些年來(lái)，SCI基礎(chǔ)與臨床的研究不斷進(jìn)展，其臨床治療也取得了飛速發(fā)展，其中包括細(xì)胞治療[11-12]、基因治療等[13-14]。Wagner FB等[15]研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷患者在接受定向脊髓刺激后能夠再次行走，是一項(xiàng)巨大突破，但是患者想要達(dá)到功能的完全康復(fù)仍面臨著巨大挑戰(zhàn)，SCI后多發(fā)的并發(fā)癥嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量[1-2]，這其中包括肌肉萎縮、慢性疼痛、尿路感染和壓瘡等[16]。SCI的繼發(fā)性改變很難完全依靠局部的機(jī)制來(lái)解釋，因此神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境受刺激后的改變等所產(chǎn)生的炎癥等方面的作用已日漸受到重視。SCI后由于上行感覺(jué)纖維和下行運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)束的中斷，破壞脊髓與大腦的生理聯(lián)系，導(dǎo)致脊髓和腦部功能之間關(guān)聯(lián)的損害，之前大部分針對(duì)脊髓損傷的研究均集中于揭示脊髓損傷所引發(fā)的癥狀及并發(fā)癥，忽視了SCI對(duì)大腦所引發(fā)的效應(yīng)，已有研究顯示SCI可引起腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，導(dǎo)致腦內(nèi)發(fā)生慢性炎癥過(guò)程[17-18]。Felix MS等[19]也發(fā)現(xiàn)，SCI不僅引起脊髓細(xì)胞的凋亡和死亡，在大腦皮質(zhì)和海馬中也引起該部位神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。Wu J等[20]一項(xiàng)研究也證實(shí)SCI會(huì)引起關(guān)鍵大腦區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的逐漸受損，存在持續(xù)退化過(guò)程，這些損傷包括炎癥、神經(jīng)細(xì)胞缺失及其并發(fā)的認(rèn)知力下降及損傷后的精神癥狀。

下丘腦-垂體-腎上腺軸是體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)系統(tǒng)，下丘腦軸在由神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)所介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中扮演重要角包。下丘腦既可以接受末端信息，又能調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌功能，構(gòu)成了下丘腦-垂體-腎上腺軸核心，而且是神經(jīng)系統(tǒng)高級(jí)整合中樞，對(duì)實(shí)現(xiàn)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有著十分重要的作用，SCI后下丘腦也是其中易受影響的神經(jīng)核團(tuán)之一[21]，徐又佳等[22]研究發(fā)現(xiàn)SCI影響正常神經(jīng)信號(hào)在大腦中樞傳導(dǎo)，下丘腦室旁核、視上核可產(chǎn)生明顯反應(yīng)，因此明確SCI是否對(duì)下丘腦造成損害對(duì)研究SCI后內(nèi)分泌及代謝相關(guān)并發(fā)癥尤為重要。針對(duì)SCI后可能對(duì)下丘腦造成的損害，本研究通過(guò)觀察SCI大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后可見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞，與對(duì)照組比較神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，同時(shí)為觀察SCI大鼠下丘腦炎癥反應(yīng)情況，采用ELISA法檢測(cè)了兩組大鼠多種促炎細(xì)胞因子的水平，結(jié)果表明脊髓損傷后下丘腦中的多種促炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高，說(shuō)明脊髓損傷可導(dǎo)致下丘腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并增加其炎癥反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞受刺激時(shí)如缺血、缺氧、損傷等情況，其核內(nèi)的c-Fos原癌基因被激活并表達(dá)蛋白，目前認(rèn)為在細(xì)胞凋亡過(guò)程中適度的c-Fos蛋白表達(dá)參與了DNA的損傷修復(fù)，而進(jìn)一步的表達(dá)增加將干預(yù)修復(fù)功能并使細(xì)胞凋亡，在某些情況下c-Fos表達(dá)是引導(dǎo)細(xì)胞凋亡基因調(diào)控通路中的一個(gè)必需成分，c-Fos蛋白的表達(dá)與凋亡有必然的聯(lián)系，中斷了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)而誘導(dǎo)凋亡[23]，本研究中觀察到脊髓損傷后下丘腦c-Fos表達(dá)明顯增加，c-Fos的過(guò)度表達(dá)可能是導(dǎo)致脊髓損傷后下丘腦細(xì)胞凋亡的原因之一。本研究中選取的時(shí)間點(diǎn)為脊髓損傷8周后，說(shuō)明急性期的應(yīng)激反應(yīng)后SCI仍對(duì)下丘腦造成持續(xù)性的慢性損害，臨床觀察中脊髓損傷容易存在合并精神癥狀及代謝性疾病的可能，脊髓損傷對(duì)下丘腦的損害可能是其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的致病機(jī)制，這尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，脊髓損傷可對(duì)下丘腦造成損害，表現(xiàn)為下丘腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)明顯增加，其可能與c-Fos表達(dá)有關(guān)，脊髓損傷后對(duì)下丘腦的損害可能是某些并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的發(fā)病機(jī)制。

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（收稿日期：2020-01-10）