崔新剛 王穎瑩 王新勝

1. 洛陽市婦幼保健院，河南 洛陽 471000；2. 洛陽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 洛陽 471000；3. 河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南 洛陽 471000

三黃片系由大黃、黃芩浸膏、鹽酸小檗堿組成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、瀉火通便的功效，為《中國藥典》收載的成方制劑[1]。主治三焦熱盛、目赤腫痛、口鼻生瘡、咽喉腫痛、心煩口渴、尿黃便秘[2]。目前，我國已有數(shù)家藥廠的三黃片投放市場，但臨床反映不同廠家三黃片的質(zhì)量存在差異[3]。目前，報(bào)道市售三黃片質(zhì)量控制方法多為單味藥大黃或其中兩味有效成分的檢測含量測定[4-6]，并不能全面反映市售三黃片的質(zhì)量差異?！吨袊幍洹?015年版中規(guī)定對三黃片中的大黃素和大黃酚總量、鹽酸小檗堿以及黃芩苷含量進(jìn)行測定，以此作為三黃片的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)。本研究基于HPLC法對不同廠家的10批三黃片指標(biāo)成分進(jìn)行分析，并結(jié)合聚類分析和主成分分析對其含量測定結(jié)果初步進(jìn)行綜合分析，探討不同廠家三黃片質(zhì)量差異，旨在為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀，包括G1315B型二極管陣列檢測器、自動進(jìn)樣器(美國安捷倫科技有限公司)；KQ-100ES超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；賽多利斯BSA8201電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；易普易達(dá)Smart-S2型超純水機(jī)(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)。

1.2 藥品與試劑 大黃素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110756-201810)；大黃酚對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110796-201814)；鹽酸小檗堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-201711)；10批樣品分別為河南A廠(批號：190501-190702)、河北的B廠(批號：180901-181003)、山東的C廠(批號：190710-190912)、貴州的D廠(批號：20190201-20190402)、廣西的E廠(批號：181107-181212)；甲醇、乙腈為色譜純(天津天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃素和大黃酚的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：254 nm。

2.1.2 對照品制備 精密稱取大黃素和大黃酚對照品適量，加無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液制成每1 mL含大黃素10 μg,大黃酚25 μg的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品制備 取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)(過三號篩)，取約0.26 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL,稱定重量，加熱回流1 h，放冷，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻、濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置燒瓶中，蒸干，加30%乙醇—鹽酸(10∶1)的混合溶液15 mL，置水浴中加熱回流1 h，立即冷卻，用三氯甲烷強(qiáng)力振搖提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)脽o水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)的混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 樣品測定 按2.1.3制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液和對照品溶液各10 μL，按2.1.1色譜條件，分別測定10個(gè)樣品中的大黃素、大黃酚，以外標(biāo)法計(jì)算含量。色譜圖如圖1所示，測定結(jié)果見表1。

圖1 對照品(A)和樣品(B)色譜圖

表1 不同廠家指標(biāo)成分含量測定結(jié)果 /mg/片

2.2 鹽酸小檗堿的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：乙腈-水(1∶1)(每1000 mL中加入磷酸二氫鉀3.4 g和十二烷基硫酸鈉1.7 g)；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：265 nm。

2.2.2 對照品制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(500∶1)的混合溶液20 mL密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 樣品測定 按2.1.4樣品測定方法。色譜圖如圖2所示，測定結(jié)果見表1。

A.標(biāo)準(zhǔn)品 B.樣品圖2 鹽酸小檗堿高效液相色譜圖

2.3 黃芩苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18 色譜柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(55∶45)；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：280 nm。

2.3.2 對照品制備 取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

2.3.3 供試品制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理10 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 樣品測定 按2.1.4樣品測定方法。色譜圖如圖3所示，測定結(jié)果見表1。

A. 對照品 B.供試品 圖3 黃芩苷高效液相色譜圖

2.4 主成分分析 主成分分析(Principal Components Analysis, PCA)是使用較廣的多指標(biāo)線性降維變換的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量評價(jià)[7-8]。本研究以5個(gè)含量測定結(jié)果為變量，運(yùn)用SPSS 24.0軟件，對10批三黃片進(jìn)行主成分分析，計(jì)算成分特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率，前3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為 91.821%，可以反映三黃片質(zhì)量，結(jié)果見圖4和表2。由圖4可知將不同生產(chǎn)廠家的三黃片大致分為4類，編號5、6、7和8為一類，編號3和4為一類，1和2為一類，9和10為一類。

表2 主成分特征值和貢獻(xiàn)率

圖4 主成分得分圖

2.5 聚類分析 聚類分析是將相似樣品歸類的最常用方法，不僅能將樣品聚類，還能反應(yīng)樣品間的相近程度[9-10]。本研究以5個(gè)含量結(jié)果為變量，運(yùn)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件，以平均Euclidean距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用組間聯(lián)接的方法對10批三黃片進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖5所示。由圖可知在組間距為25時(shí)，將10個(gè)廠家生產(chǎn)的三黃片分為4類，編號5-8分為一類，編號1和2為一類，編號3和4為一類，及編號9和10為一類。該結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致。

圖5 聚類分析圖

3 討論

三黃片為我國傳統(tǒng)的中藥復(fù)方制劑，是常用臨床藥。由表1可知，不同廠家三黃片都合格，符合《中國藥典》要求，但其中指標(biāo)成分差異顯著。這可能與各廠家選取藥材的產(chǎn)地、季節(jié)及加工炮制工藝有關(guān)，建議廠家嚴(yán)格控制藥材的基源，做到藥材可以溯源，從源頭保證藥材的穩(wěn)定。且不同廠家在生產(chǎn)過程中工藝路線不同，包括黃芩煎煮時(shí)間、投入溶劑量、溫度和濃縮環(huán)節(jié)的溫度、浸膏含水量等都影響三黃片質(zhì)量。因此，廠家從源頭到生產(chǎn)不同環(huán)節(jié)嚴(yán)格把關(guān)，原藥材符合要求，生產(chǎn)工藝規(guī)范，確保生產(chǎn)藥品質(zhì)量穩(wěn)定，以保證臨床療效和安全。

本實(shí)驗(yàn)通過主成分分析和聚類分析將同一廠家不同批次的樣品聚在一組，說明同一廠家的生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。山東C廠和貴州D廠的三黃片聚為一類，表明兩個(gè)生產(chǎn)廠家在原料來源和生產(chǎn)工藝具有類似之處。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測了三黃片中三味藥的指標(biāo)成分，獲得的聚類分析和主成分分析結(jié)果可為三黃片的質(zhì)量控制提供依據(jù)。