黃振宇,楊劍波,凌雪君,賴(lài)萬(wàn)強(qiáng),李艷華

乳腺癌是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),2018年全世界有乳腺癌新發(fā)患者210萬(wàn)例,乳腺癌相關(guān)死亡患者63萬(wàn)例,對(duì)患者的生命健康構(gòu)成了巨大的威脅[1]。雖然近年來(lái)乳腺癌的治療取得了一定的進(jìn)步,但是患者的預(yù)后依然不容樂(lè)觀,還需探索新的乳腺癌治療手段[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)具有多種生物學(xué)功能,被認(rèn)為是癌癥發(fā)展中的重要調(diào)控因子,有作為癌癥候選生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的潛力[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(long non-coding RNA highly upregulated in liver cancer,lncRNA Hulc)最早是在肝癌中被發(fā)現(xiàn),并在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)[4]。許多研究發(fā)現(xiàn),lncRNA Hulc還可以作為癌基因促進(jìn)包括胰腺癌和胃癌等惡性腫瘤的進(jìn)展[5-6]。有研究報(bào)道lncRNA可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合微小RNA(miRNA)充當(dāng)其分子海綿來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能[7],Liu等[8]報(bào)道在胃癌中l(wèi)ncRNA Hulc通過(guò)充當(dāng)微小RNA-9-5p(miR-9-5p)的分子海綿來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。miR-9-5p是與腫瘤密切相關(guān)的miRNA之一,在非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌中發(fā)揮促癌作用[9-10],在胃癌和胰腺癌中發(fā)揮抑癌作用[11-12]。Majer等[13]測(cè)序結(jié)果顯示miR-9-5p在乳腺癌中可能與腫瘤抑制相關(guān)。目前較少關(guān)于lncRNA Hulc、miR-9-5p與乳腺癌關(guān)系的研究報(bào)道,二者在乳腺癌中具體的作用機(jī)制尚不明確,在乳腺癌中l(wèi)ncRNA Hulc是否與miR-9-5p相關(guān)未知。本研究分析了lncRNA Hulc和miR-9-5p在乳腺癌中的表達(dá)水平及臨床意義,報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取賀州市人民醫(yī)院2017年1月至2019年1月收治的乳腺癌患者80例,年齡36～70(46.2±9.1)歲;發(fā)生部位:左側(cè)39例,右側(cè)41例;T分期:T1期39例,T2期20例,T3期17例,T4期4例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有33例,無(wú)47例;臨床分期:Ⅰ期24例,Ⅱ期19例,Ⅲ期19例,Ⅳ期18例;雌激素受體(ER)陽(yáng)性48例,陰性32例;孕激素受體(PR)陽(yáng)性35例,陰性45例;人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)陽(yáng)性20例,陰性60例。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者初次行手術(shù)治療;②未接受過(guò)任何形式的抗腫瘤治療;③經(jīng)病理檢查確診為乳腺癌;④臨床病理信息完整;⑤未發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移;⑥患者及家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他類(lèi)型腫瘤者;②合并嚴(yán)重的心、肝、腎及肺功能障礙者;③患有傳染性疾病者。本研究遵循赫爾辛基宣言,并經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 組織RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,三氯甲烷、異丙醇和純酒精等相關(guān)試劑購(gòu)自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;Bestar 1stStrand cDNA合成試劑盒購(gòu)自上海DBI? Bioscience公司;SYBR Premix EX TaqTM轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司;lncRNA Hulc、miR-9-5p和內(nèi)參U6引物由上海捷瑞有限公司合成;Nanodrop 2000分光光度儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 組織中總RNA提取 組織標(biāo)本離體后立即置于液氮中凍存,經(jīng)液氮完全冷凍后放入研缽中研磨成粉末,并加入1 ml Trizol試劑完全裂解,移至EP管中加入200 μl三氯甲烷混勻后靜置5 min,4 ℃ 12 000 r/min離心30 min,可見(jiàn)溶液分為3層,最上層為澄清的水相層,將其吸取450 μl，與等體積的異丙醇混勻后,于4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,純酒精洗滌兩次后可見(jiàn)白色沉淀,用DEPC水將其溶解后即獲得組織總RNA,用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA的濃度和純度,放置-80 ℃保存。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)lncRNA Hulc和miR-9-5p的相對(duì)表達(dá)量 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系20 μl,包括Enzyme Mix 1 μl、5×RT Buffer 4 μl、Primer Mix 4 μl、無(wú)RNA酶水 11 μl。按照37 ℃ 15 min,85 ℃ 30 s擴(kuò)增條件將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,按照ULtraRT One Step RT-PCR Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系10 μl,包括cDNA模板2 μl、SYBR Premix EX TaqTMⅡ4 μl、上下游引物各0.4 μl(lncRNA Hulc引物F: 5′-ACCTCCAGAACTGTGATCCAAAATG-3′,R: 5′-TCTTGCTTGATGCTTTGGTCTG-3′;miR-9-5p引物F: 5′-ACACTCCAGCTGGGAGTATGTCGATCTATTG-3′,R: 5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;內(nèi)參U6引物F: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R: 5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′)、ROX Reference Dye 0.2 μl、ddH2O 3 μl。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。獲得各樣品的循環(huán)閾值(Cycle threshold,Ct)。以U6基因?yàn)閮?nèi)參,用2-ΔΔCt公式計(jì)算lncRNA Hulc和miR-9-5p的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA Hulc和miR-9-5p表達(dá)水平比較 乳腺癌組織中的lncRNA Hulc表達(dá)水平高于癌旁組織,miR-9-5p表達(dá)水平低于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA Hulc和miR-9-5p表達(dá)水平比較

2.2 乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA Hulc、miR-9-5p的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 T3+T4期乳腺癌患者的lncRNA Hulc表達(dá)水平高于T1+T2期乳腺癌患者，Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌患者的lncRNA Hulc表達(dá)水平高于Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的lncRNA Hulc表達(dá)水平高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、發(fā)生部位、ER、PR和HER2患者的lncRNA Hulc表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌患者的miR-9-5p表達(dá)水平低于Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的miR-9-5p表達(dá)水平低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、發(fā)生部位、T分期、ER、PR和HER2患者的miR-9-5p表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 lncRNA Hulc、miR-9-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.3 乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA Hulc與miR-9-5p的相關(guān)性分析 在乳腺癌組織中,lncRNA Hulc與miR-9-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.472,P=0.003),見(jiàn)圖1。

圖1 乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA Hulc和miR-9-5p表達(dá)的相關(guān)性

2.4 lncRNA Hulc和miR-9-5p對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值 lncRNA Hulc和miR-9-5p對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值,敏感度和特異度均高于0.7。lncRNA Hulc和miR-9-5p聯(lián)合應(yīng)用對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感度和特異度分別為0.818、0.809,其診斷效能明顯高于單一指標(biāo),見(jiàn)表3、圖2。

圖2 lncRNA Hulc和miR-9-5p預(yù)測(cè)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

表3 lncRNA Hulc和miR-9-5p對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

外科手術(shù)是早期乳腺癌的主要治療方法,可提高長(zhǎng)期生存率,晚期乳腺癌的主要治療方法包括連續(xù)內(nèi)分泌治療、化療和生物療法,但療效欠佳[14-15]。轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因,其可轉(zhuǎn)移至肝、骨和肺等重要器官,發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的5年生存率則會(huì)明顯降低[16]。靶向療法是新近研發(fā)的治療手段,在乳腺癌的治療中取得了較大的進(jìn)展,但是由于腫瘤細(xì)胞具有耐藥性,導(dǎo)致患者的預(yù)后達(dá)不到預(yù)期的效果[17]。目前腫瘤學(xué)研究越來(lái)越重視尋找影響腫瘤細(xì)胞存活、增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子,通過(guò)調(diào)節(jié)這些分子的表達(dá)來(lái)達(dá)到抗腫瘤的目的。此外乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,研究乳腺癌發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子是乳腺癌治療的重要方向。

在人類(lèi)基因組中,只有2%的蛋白質(zhì)編碼基因被穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄,而絕大多數(shù)是非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA),新興證據(jù)表明ncRNA特別是lncRNA和miRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)編碼基因的表達(dá)和表觀遺傳學(xué)特征在各種類(lèi)型的癌癥中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[18]。lncRNA包含200多個(gè)核苷酸,調(diào)控多種生物學(xué)功能,例如調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和RNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和指導(dǎo)蛋白質(zhì)與DNA的相互作用等[19]。越來(lái)越多的lncRNA在乳腺癌中被報(bào)道[7],其中l(wèi)ncRNA Hulc在乳腺癌組織和細(xì)胞系中呈高表達(dá),且lncRNA Hulc可通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)直接結(jié)合miR-6754-5p,從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲和遷移能力[20]。同時(shí)lncRNA Hulc在胰腺癌患者的組織和血清中也呈高表達(dá),且lncRNA Hulc表達(dá)與包括腫瘤大小、T分期、M分期和血管侵襲在內(nèi)的病理參數(shù)有關(guān),是胰腺癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的標(biāo)記物[5]。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA Hulc在80例乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào),并且lncRNA Hulc表達(dá)與乳腺癌患者T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān),與Wang等[20]的報(bào)道一致,提示lncRNA Hulc可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。miR-9-5p在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不一致,既可以發(fā)揮促癌作用,又可以發(fā)揮抑癌作用,Majer等[13]使用下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)鑒定了包括miR-9-5p在內(nèi)的7個(gè)miRNA與乳腺癌中的腫瘤抑制有關(guān),而miR-9-5p在乳腺癌中的表達(dá)情況尚不清楚。本研究結(jié)果顯示miR-9-5p在乳腺癌組織中呈低表達(dá),且其表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān),同樣表明miR-9-5p可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。在胃癌中l(wèi)ncRNA Hulc的作用機(jī)制是通過(guò)靶向抑制miR-9-5p表達(dá),進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和凋亡[6]。而在乳腺癌中l(wèi)ncRNA Hulc是否可以調(diào)控miR-9-5p參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA Hulc與miR-9-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān),表明lncRNA Hulc可能通過(guò)結(jié)合miR-9-5p抑制其表達(dá)而參與乳腺癌的惡性進(jìn)程,但是具體的作用需在后續(xù)細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌惡性進(jìn)展的重要因素,目前有較多醫(yī)院對(duì)于乳腺癌的患者會(huì)進(jìn)行常規(guī)腋窩淋巴結(jié)清掃,然而并非所有的患者都伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者在行腋窩淋巴結(jié)切除后局部淋巴系統(tǒng)被破壞,同時(shí)手術(shù)會(huì)留下手術(shù)瘢痕,會(huì)對(duì)患者造成不利的影響[21]。準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,可有效指導(dǎo)臨床制定合理的治療計(jì)劃。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA Hulc和miR-9-5p的表達(dá)均與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),故進(jìn)一步行ROC分析了二者對(duì)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值,結(jié)果顯示lncRNA Hulc和miR-9-5p對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值,且二者聯(lián)合應(yīng)用的預(yù)測(cè)價(jià)值更高,敏感度和特異度分別為0.818、0.809。但組織樣本的臨床應(yīng)用價(jià)值有限,由于lncRNA和miRNA均可在血液中表達(dá),在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步分析二者在血液中的表達(dá)及其對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述,lncRNA Hulc在乳腺癌中高表達(dá),miR-9-5p在乳腺癌中低表達(dá),兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),且均與患者不良病理參數(shù)相關(guān),并對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。lncRNA Hulc和miR-9-5p可能是治療乳腺癌的候選靶點(diǎn)。