羅樂，楊陳武，敬巧，杜成超，文愛平#

川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院1醫(yī)學影像四川省重點實驗室，2婦產(chǎn)科，四川 南充 637000

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，好發(fā)于55～65歲女性，具有發(fā)病隱匿、惡性程度高和侵襲力強等特點[1]。近年來，雖然卵巢癌的治療水平有所提高，但EOC患者的5年生存率仍約為30%，是婦科惡性腫瘤的首要病死原因[2]。探索EOC病理過程中的關鍵因子對尋找新的治療靶點和改善患者的預后具有重要意義。Tip60蛋白屬于MYST家族成員，能夠介導核心組蛋白的乙酰化、分子磷酸化和泛素化，通過對細胞DNA損傷的修復和細胞信號的傳導，從而負性調控腫瘤的發(fā)生。Tip60蛋白在調控基因表達、修復DNA損傷、重建染色質等領域成為當前分子生物學的研究熱點[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，Tip60蛋白的表達與神經(jīng)膠質瘤的惡性程度有關，其低表達是導致神經(jīng)膠質瘤患者預后差的獨立危險因素[5]。然而，Tip60蛋白的表達與EOC患者的臨床特征及預后的關系尚未見報道。本研究采用免疫組織化學染色法檢測EOC組織中Tip60蛋白的表達情況，分析Tip60蛋白的表達與EOC患者臨床特征和預后的關系，為EOC的臨床治療和預后預測提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2013年1月至2014年1月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院82例EOC患者的石蠟組織標本，患者均為初診、初治的卵巢癌患者，術前未接受過放療、化療等治療，術后經(jīng)病理學檢查確診。EOC患者的年齡為41～73歲，平均年齡為（59.26±6.31）歲；組織類型：低級別漿液性癌31例，高級別漿液性癌18例，黏液性腺癌21例，子宮內(nèi)膜腺癌12例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期62例；有淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移51例。選取37例卵巢良性病變患者的卵巢良性病變組織標本，患者的年齡為40～72歲，平均年齡為（58.72±6.29）歲；疾病類型：巧克力囊腫19例，單純卵巢囊腫10例，黃體囊腫8例。另收集31例非卵巢疾病患者的健康卵巢組織標本作為對照，患者的年齡為45～73歲，平均年齡為（59.53±6.17）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學染色方法

采用En-vision法檢測各卵巢組織標本中Tip60蛋白的表達情況，將標本切片后脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗5 min，洗滌3次，使用3%過氧化氫于室溫孵育15 min，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。使用蒸餾水沖洗，再用PBS洗滌5 min，洗滌3次；滴加兔抗人Tip60多抗（一抗，稀釋比例為 1∶150），室溫孵育 30 min，然后PBS漂洗5 min，3次；加ChemMate Envision+/HRP工作液，室溫孵育30 min，PBS漂洗5 min，3次；滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，室溫孵育10 min，顯色完全后終止顯色。采用蘇木精復染、梯度乙醇脫水，二甲苯漂洗3次，封片膠封片。采用試劑盒內(nèi)的陽性標準物作為陽性對照，以PBS溶液代替一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組織化學染色結果判定標準

每張切片隨機選取5個視野計數(shù)，根據(jù)染色程度評分：無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕黑色計3分；依據(jù)陽性細胞比例評分：0～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分。Tip60蛋白染色的最終評分為染色程度和陽性細胞比例的乘積，＜8分為低表達，≥8分為高表達。

1.4 治療方案及隨訪

根據(jù)具體病情選擇適當?shù)氖中g方案，包括全子宮及雙附件、轉移瘤、大網(wǎng)膜及闌尾切除術和盆腔淋巴結清掃術等。術后1周給予紫杉醇聯(lián)合卡鉑化療，每3周為1個療程，共化療6個療程。對所有患者手術后每3個月通過電話或門診隨訪1次，記錄患者的5年生存情況，隨訪截至術后5年或患者死亡。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank檢驗；構建Cox回歸模型對卵巢癌患者預后的影響因素進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Tip60蛋白在不同卵巢組織中的表達情況

EOC組織中Tip60蛋白的高表達率低于良性卵巢病變組織和健康卵巢組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；良性卵巢病變組織和健康卵巢組織中Tip60蛋白的的高表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。EOC組織、良性卵巢病變組織和健康卵巢組織中Tip60蛋白的的高表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=38.299，P＜0.01）。（表1）

2.2 Tip60蛋白表達與EOC患者臨床特征的關系

不同年齡、組織類型、FIGO分期、淋巴結轉移情況和合并腹腔積液情況的EOC患者EOC組織中Tip60蛋白的高表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；組織學分級為G1～2級的EOC患者EOC組織中Tip60蛋白的高表達率高于組織學分級為G3級的EOC患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

2.3 Tip60蛋白的表達對卵巢癌患者生存時間的影響

82例EOC患者均完成最終隨訪，平均生存時間為（36.32±1.88）個月。Log-rank檢驗結果顯示，Tip60低表達患者的中位生存時間為28.00個月，短于Tip60高表達患者的44.00個月，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.093，P＜0.05）。Tip60低表達患者的5年生存率為19.05%（12/63），明顯低于Tip60高表達患者的42.11%（8/19），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.208，P＜0.01）。

2.4 卵巢癌患者生存影響因素的單因素分析

截至隨訪結束，82例卵巢癌患者中，生存20例，病死62例，卵巢癌患者的術后5年生存率為24.39%（20/82）。不同年齡、組織類型、FIGO分期、組織學分級、淋巴結轉移、是否存在腹腔積液和Tip60蛋白表達情況的卵巢癌患者的5年生存情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 卵巢癌患者5年生存情況影響因素的單因素分析（n=82）

2.5 卵巢癌患者生存影響因素的多因素分析

將單因素分析結果有統(tǒng)計學意義的因素進一步納入Cox模型，多因素分析結果顯示：FIGO分期高、組織學分級高和存在淋巴結轉移是EOC患者5年生存率的危險因素（P＜0.05），Tip60高表達是EOC患者5年生存率的保護因素（P＜0.05）。（表4）

3 討論

卵巢惡性腫瘤為女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)生率僅次于子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌，病死率位居首位[6-7]。EOC是卵巢惡性腫瘤的常見類型，占所有卵巢惡性腫瘤的86%～90%[8]，具有惡性程度高、侵襲力強、術后易復發(fā)等特點，嚴重威脅女性健康。EOC的早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時病情已發(fā)展至晚期，錯失了最佳的治療時機[9-10]。目前，卵巢癌的治療方式包括手術和放化療，其中，單純手術治療很難根治，而多數(shù)患者容易對放化療產(chǎn)生耐受性，導致3年生存率僅為30%左右[11]。因此，尋找影響EOC發(fā)生和發(fā)展的關鍵因子有助于提高治療效果和改善預后。

乙酰化為真核細胞中蛋白質最常見的修飾方式，乙?；揎棇Φ鞍酌富钚?、穩(wěn)定性以及DNA結合力等具有顯著影響[12]。Tip60蛋白是最早采用酵母雙雜交方式確定的、能夠與人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）調節(jié)因子反式轉錄激活因子（trans-activator of transcription，TAT）結合的蛋白，相對分子量為60 kD[13]，能夠介導P53、核心組蛋白等的乙?；揎?，通過不同蛋白間的相互作用參與多條信號通路的活化，從而在細胞凋亡、基因調控以及染色體重建等過程中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Tip60蛋白的表達與結直腸癌的臨床分期和組織分化程度有關，且低表達的Tip60蛋白會提高結直腸癌患者對絲裂霉素、奧沙利鉑等化療藥物的敏感性[14]。有報道稱，Tip60主要通過核因子-Myc和核因子-κB兩條信號通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。一方面，Tip60通過GAS41與核因子-Myc結合形成穩(wěn)定復合物，調控下游基因的表達，抑制腫瘤細胞的增殖[17]；另一方面，Tip60能阻斷核因子-κB信號通路，下調細胞膜上基質金屬蛋白酶的表達，降低腫瘤細胞的黏附性，抑制腫瘤的侵襲[18]。本研究結果顯示，EOC組織中Tip60蛋白的表達明顯低于良性卵巢病變組織和健康卵巢組織，且Tip60蛋白的表達情況與EOC患者的組織學分級有關。進一步探討Tip60蛋白與EOC患者生存時間的關系發(fā)現(xiàn)，Tip60蛋白低表達患者的5年生存率低于Tip60高表達患者，且Tip60低表達患者的中位生存時間也相對較短，提示Tip60蛋白的表達水平與EOC患者的預后有關，Tip60可作為評估患者預后的參考指標。本研究采用Cox回歸模型分析EOC患者預后的影響因素，結果顯示，F(xiàn)IGO分期高、組織學分級高、存在淋巴結轉移是EOC患者5年生存狀況的重要危險因素，而Tip60蛋白高表達是EOC患者5年生存狀況的保護因素。

綜上所述，EOC組織中Tip60蛋白的表達水平降低，且Tip60蛋白的表達與EOC患者的組織學分級有關，檢測Tip60蛋白的表達情況有助于預測EOC患者的預后情況。然而，Tip60在EOC發(fā)生過程中的作用機制尚不明確，今后應深入研究，以期為EOC的臨床治療和改善患者預后提供依據(jù)。