歐陽吉庭，張晨陽，張宇，劉思含，繆勁松

(1.北京理工大學(xué) 物理學(xué)院；北京 100081; 2.北京東方計(jì)量測(cè)試研究所；北京 100094)

有害細(xì)菌和病菌的殺滅控制是室內(nèi)空氣凈化治理工程的重要組成部分，新型的材料和精密儀器等對(duì)綠色環(huán)保的滅菌技術(shù)提出了更高的要求. 自1996年Laroussi[1]發(fā)表第1篇關(guān)于大氣壓非平衡等離子體應(yīng)用于滅菌方面的文章后，低溫等離子體滅菌技術(shù)受到了廣泛關(guān)注. 相比較于傳統(tǒng)的滅菌技術(shù)，大氣壓低溫等離子體具有溫度低、滲透性好、快速高效、無污染等優(yōu)勢(shì)[2-4]. 低溫等離子體的滅菌作用主要源于其產(chǎn)生的各種活性物質(zhì)如紫外線、臭氧、電磁場(chǎng)、帶電粒子、活性基團(tuán)等，研究人員分別對(duì)其作用進(jìn)行了研究. 如Deng等[5-7]闡述了等離子體中紫外效應(yīng)的作用. 等離子體產(chǎn)生的帶電粒子和活性粒子對(duì)生命體有著復(fù)雜的生物化學(xué)效應(yīng)，帶電粒子和活性自由基的刻蝕作用、活性氧和活性氮的作用都與滅菌效率息息相關(guān)[8-13]. 同時(shí)，外界條件也影響滅菌效率，Dobrynin 等[14]闡述了濕度對(duì)殺菌機(jī)制的影響，Ching等[15]說明了初始菌液濃度對(duì)滅菌效率也有一定的影響. 由于產(chǎn)生等離子體的放電方式不同、放電條件各異，具體放電結(jié)構(gòu)中的殺菌主體是什么還存在很大爭(zhēng)議.

基于上述問題和分析，本文使用針-環(huán)結(jié)構(gòu)的負(fù)電暈放電裝置，以金黃色葡萄球菌為代表菌株，分別研究電暈放電中不同活性物質(zhì)(紫外線、臭氧、帶電粒子、中性物質(zhì))對(duì)細(xì)菌的滅活效率，分析滅活機(jī)理. 由于等離子體與液體接觸反應(yīng)后產(chǎn)生的活性粒子和空氣中有較大差別[23]，故本文采取先涂平板，待其干燥后做再殺菌處理的方法，使處理環(huán)境更接近于室內(nèi)實(shí)際情況.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)中采用的電暈放電裝置及其測(cè)試系統(tǒng)的示意圖如圖1所示.

實(shí)驗(yàn)采取針-環(huán)放電結(jié)構(gòu). 針尖曲率半徑為80 μm，針尖到地電極的垂直距離為5 mm，地電極環(huán)的內(nèi)徑為4 cm，驅(qū)動(dòng)電壓Vs由直流電源(DW-P203/N203)提供. 實(shí)驗(yàn)中使用示波器(Tektronik，DPO4104B)以及高壓探頭(Tektronik，P6105A)來測(cè)試電源的輸出電壓；通過微安表(HM數(shù)顯直流微安表)檢測(cè)平均放電電流；實(shí)驗(yàn)中同時(shí)采用低壓探頭(Tektronix,TPP1000)通過采樣電阻R來檢測(cè)電流的實(shí)時(shí)波形(I=VR/R)，值得注意的是，由于帶電粒子可能分散在大氣中，檢測(cè)到的電流并不是電暈電流的全部. 實(shí)驗(yàn)中在平臺(tái)下方置一z軸微調(diào)位移平臺(tái)，保證培養(yǎng)基到地電極的距離d可以精確調(diào)整.

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1電暈放電的活性成分

實(shí)驗(yàn)首先對(duì)電暈放電可能產(chǎn)生的各種活性成分進(jìn)行分析. 采用臭氧檢測(cè)儀(XLA-BX-03)檢測(cè)放電產(chǎn)生的臭氧濃度(地電極外4 mm處約為10×10-6). 采取負(fù)離子濃度計(jì)(KT-401)檢測(cè)放電產(chǎn)生的帶電粒子濃度(實(shí)驗(yàn)中負(fù)離子濃度>107cm-3). 實(shí)驗(yàn)還采取光譜儀(Zolix Omni λ-5008)進(jìn)行發(fā)射光譜診斷，其中光纖探頭距離針尖的距離為1 cm，通過對(duì)發(fā)射光譜的分析，確定電暈放電產(chǎn)生的紫外線和各種可能的活性粒子.

1.2.2紫外線的殺菌作用

為確定紫外線的殺菌效應(yīng)，采取醫(yī)用紫外燈直接對(duì)接種在LB固體培養(yǎng)基上的金黃色葡萄球菌進(jìn)行不同時(shí)間的處理. 紫外燈功率為30 W，中心波長(zhǎng)為253.7 nm. 燈管與金黃色葡萄球菌的距離分別為25，50 cm.

1.2.3臭氧的殺菌作用

利用商用臭氧發(fā)生器產(chǎn)生的臭氧，對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的直接處理. 臭氧產(chǎn)率為10 g/h，發(fā)生器與培養(yǎng)基的距離為5 cm，該處的臭氧濃度約為20×10-6. 在單獨(dú)研究臭氧的滅菌效率時(shí)，使用的臭氧濃度與后文電暈產(chǎn)生的臭氧濃度略有不同，雖然不同濃度臭氧的滅菌效率不同，但其滅菌曲線的趨勢(shì)和殺菌機(jī)理是一致的.

1.2.4紫外線和臭氧的聯(lián)合殺菌作用

為研究紫外線和臭氧的聯(lián)合殺菌作用，在空氣環(huán)境下同時(shí)開啟紫外燈和臭氧發(fā)生器對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行殺滅處理. 保持紫外燈與培養(yǎng)基的垂直距離為50 cm，臭氧發(fā)生器與培養(yǎng)基的距離為5 cm.

1.2.5中性活性粒子的殺菌作用

為研究電暈放電產(chǎn)生的中性活性物質(zhì)的作用，采取兩種方式去除放電產(chǎn)生的帶電粒子. 第一種方式為在培養(yǎng)基下方另加一銅電極并分別置不同偏置電壓Vb=0，1500和-1500 V，在其附加電場(chǎng)的作用下帶電粒子加速(正偏壓)或者不能(負(fù)偏壓)運(yùn)動(dòng)到細(xì)菌表面；第二種方式為在培養(yǎng)基上方加一接地電極金屬網(wǎng)，在其作用下帶電粒子被大量吸附,從而不能到達(dá)細(xì)菌表面. 保持培養(yǎng)基與地電極距離d=4 mm不變.

1.2.6帶電粒子的殺菌作用

為研究電暈放電地電極外帶電粒子的殺菌作用，在放電區(qū)內(nèi)距針尖1 cm處施加一風(fēng)速于約為10 m/s的橫向抽氣氣流，該氣流由一小型真空泵(GM-0.33A)提供. 該風(fēng)速大于本實(shí)驗(yàn)條件下的離子風(fēng)風(fēng)速(1 m/s)，遠(yuǎn)小于帶電粒子在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下運(yùn)動(dòng)的速度. 風(fēng)速皆由熱線風(fēng)速儀(DT-8880)測(cè)量. 可以認(rèn)為，帶電粒子不受此橫向風(fēng)的影響，而中性的活性物質(zhì)在氣流的作用下被抽離放電區(qū). 因此在離子風(fēng)區(qū)的中性活性物質(zhì)也大大減少，而帶電粒子則可在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下向下運(yùn)動(dòng)，從而得到離子風(fēng)中單獨(dú)帶電粒子的殺菌作用. 采用負(fù)離子濃度檢測(cè)計(jì)檢測(cè)抽氣時(shí)地電極外d=4 mm處的負(fù)離子濃度，應(yīng)高于106cm-3，保證有足夠的負(fù)離子作用在細(xì)菌樣品表面.

1.3 菌落計(jì)數(shù)方法

本文采用的菌株為ATCC 22004金黃色葡萄球菌株(北京索萊寶科技有限公司). 首先將保存菌種配制成濃度約為108cfu/mL的菌懸液，稀釋105倍后涂平板，然后在常溫常壓下經(jīng)過殺菌處理，處理之后再在37℃恒溫培養(yǎng)過夜后計(jì)數(shù). 殺菌效率計(jì)算方法如下

Q=(1-NA/NB)×100%，

式中：NA為經(jīng)過處理的樣品在計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)生長(zhǎng)出的菌落數(shù)；NB為對(duì)照組的菌落數(shù)；Q為殺菌效率. 進(jìn)行單獨(dú)紫外、臭氧滅菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，計(jì)數(shù)區(qū)域?yàn)檎麄€(gè)培養(yǎng)基表面；進(jìn)行電暈放電殺菌效率實(shí)驗(yàn)時(shí)，以地電極環(huán)在培養(yǎng)基表面的投影為計(jì)數(shù)區(qū)域(即電暈放電的直接殺菌區(qū)域).

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

基于上述實(shí)驗(yàn)方法，首先研究了本實(shí)驗(yàn)中電暈放電的伏安特性曲線、電流脈沖波形和發(fā)射光譜. 明確負(fù)電暈放電的放電特性后，進(jìn)行系統(tǒng)的滅菌效果研究.

2.1 電暈放電特性和活性成分診斷

2.1.1伏安特性曲線與電流波形圖

本實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)下針-環(huán)負(fù)電暈放電的伏安特性曲線如圖2所示. 其擊穿電壓約為-5 kV；平均電流隨電壓呈二次關(guān)系，滿足靜電Townsend關(guān)系.

放電電壓為Vs=-13 kV時(shí)的電流波形如圖3所示. 這是典型的Trichel脈沖，脈沖頻率約為167 kHz，幅值Imax約為170 μA. 說明電暈放電未進(jìn)入穩(wěn)定正常輝光階段.

2.1.2活性成分

本實(shí)驗(yàn)采用發(fā)射光譜法對(duì)電暈放電產(chǎn)生的活性物質(zhì)進(jìn)行診斷. 圖4為電壓Vs=-13 kV、平均電流Id=100 μA時(shí)的發(fā)射光譜.

可以看到，空氣環(huán)境下直流負(fù)電暈放電的發(fā)射光譜主要分布在300～500 nm范圍內(nèi)，其中以氮的譜線為主. 強(qiáng)度最大的譜線出現(xiàn)在337.1 nm，對(duì)應(yīng)氮分子第二正帶系中的Δv=v″-v′=0譜線；紫外線主要在UVA波段. 由于是在大氣壓空氣放電，還產(chǎn)生了O，O3，NO等活性氧和活性氮，以及氧負(fù)離子(O-，O2-等).

值得注意的是，由于空氣中水蒸氣的存在，在光譜中還出現(xiàn)了較強(qiáng)的OH自由基譜線，分別為315.1 nm和308.8 nm，其高強(qiáng)活性可導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)功能(控制離子和極性物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞)受到損傷,而在細(xì)菌滅活中可能起重要作用[24].

2.2 幾種活性成分的殺菌效率

根據(jù)上面的實(shí)驗(yàn)，對(duì)電暈放電中各種活性粒子的殺菌作用進(jìn)行逐一試驗(yàn)，分別采用紫外線、臭氧、中性活性物質(zhì)、帶電粒子等對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行殺滅，得到其滅菌效率，進(jìn)一步分析其滅活原理.

2.2.1紫外線的殺菌效率

圖5為單獨(dú)的紫外線的殺菌效率.

可以看到，單獨(dú)的紫外線有很好的殺菌效率,30 s內(nèi)滅菌效率可達(dá)100%. 但較近距離(25 cm)的殺菌效率在30 s之前高于較遠(yuǎn)距離(50 cm). 紫外線的殺菌效果主要源自對(duì)微生物細(xì)胞核中的DNA的破壞作用，殺菌效率與波長(zhǎng)相關(guān)，其中200～300 nm波長(zhǎng)的紫外線具有最高的殺菌效率. 本文使用的是253.7 nm醫(yī)用紫外燈，對(duì)于金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的殺菌效果. 但電暈的的紫外波段一般在300 nm以上，殺菌效果將比較弱. 實(shí)際上本文也利用在培養(yǎng)基上方加入紫外可透過的石英玻璃板來隔離除紫外線外的其他活性物質(zhì)，進(jìn)行電暈放電產(chǎn)生的紫外效應(yīng)的殺菌效率研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純的放電紫外效應(yīng)并不足以在短時(shí)間內(nèi)起到殺菌作用.

2.2.2臭氧的殺菌效率

圖6為單獨(dú)臭氧的殺菌效率.

由圖6可知，單獨(dú)的臭氧也有較好的殺菌效果，在100 s時(shí)滅菌效率可達(dá)100%. 臭氧的殺菌作用來自其自身及其產(chǎn)生的氧原子的強(qiáng)氧化作用. 臭氧能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，改變細(xì)胞通透性，進(jìn)一步作用于蛋白和脂多糖，分解細(xì)菌內(nèi)部的酶，導(dǎo)致細(xì)菌死亡.

2.2.3紫外線與臭氧的共同作用

臭氧與紫外線共同作用的殺菌效果如圖7所示，也給出單獨(dú)紫外線、臭氧的結(jié)果(為體現(xiàn)二者聯(lián)合滅菌與單獨(dú)滅菌的效率差異，此處的處理時(shí)間與圖5及圖6中略有不同).

可以看出，紫外線和臭氧共同作用的殺菌效率明顯低于純紫外線的殺菌效率. 純紫外燈在20 s時(shí)的殺菌效率基本達(dá)到99%，而紫外和臭氧的共同殺菌效率僅有57%；在30 s時(shí)，殺菌效率也僅有78%. 在誤差范圍內(nèi)，共同作用的殺菌效率基本與臭氧的相當(dāng). 說明紫外線和臭氧同時(shí)加載時(shí)，并不改善滅菌效果.

2.2.4中性活性粒子的殺菌效率

分別在培養(yǎng)皿下方加偏壓和在培養(yǎng)基上方加地電極網(wǎng)后，帶電粒子被阻擋，進(jìn)入培養(yǎng)皿的只有中性粒子，它們的滅菌效果如圖8和圖9所示.

圖8表明，在培養(yǎng)皿底部加不同偏壓對(duì)殺菌效率有影響. 在誤差范圍內(nèi)，當(dāng)加正偏壓與不加偏壓時(shí)的殺菌效率基本一致；但當(dāng)加負(fù)偏壓時(shí)，負(fù)電暈放電的殺菌效率明顯低于不加偏壓時(shí)的值(如8 min時(shí)約減少15%). 圖9中表明，當(dāng)在培養(yǎng)基上方加入接地電極網(wǎng)時(shí)，殺菌效率略有減少(如8 min時(shí)約減少10%). 接入地電極網(wǎng)時(shí)的殺菌效率與在培養(yǎng)皿底部置負(fù)偏壓的殺菌效率趨勢(shì)類似.

放電產(chǎn)生的中性活性物有很好的殺菌效果，利用不同方式去除帶電粒子后，8 min的殺菌效率仍可達(dá)到80%. 其中起主要作用的應(yīng)為O，O3，OH，NO等中性活性粒子. 這些基團(tuán)具有很高的活性，與細(xì)菌表面和內(nèi)部的各種成分發(fā)生了復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，改變了細(xì)胞膜的成分，影響細(xì)菌的正常生命活動(dòng)，使細(xì)菌失活. 另外，高濃度的活性物質(zhì)會(huì)影響細(xì)胞正常的分裂過程，細(xì)胞周期停滯或凋亡. 去除帶電粒子后，殺菌效率有所降低，說明帶電粒子在放電過程中可能起到了輔助殺菌的作用.

2.2.5帶電粒子的殺菌效率

在針尖附近加載抽氣裝置后，中性活性粒子在橫向風(fēng)力的作用下運(yùn)動(dòng)，地電極外中性粒子大大減少，離子風(fēng)中主要是帶電粒子，其殺菌效率曲線如圖10所示.

可以看到，在誤差范圍內(nèi)，去除中性活性粒子后的電暈風(fēng)中單獨(dú)的帶電粒子殺菌效率幾乎為0，亦即單純的電暈風(fēng)離子的殺菌效應(yīng)很小. 這可能是電暈風(fēng)中帶電粒子的能量較低，不足以產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌的刻蝕作用而使其死亡；同時(shí)，帶電粒子密度也不夠高，即使產(chǎn)生一定的生物電效應(yīng)，但由于沒有其他活性粒子的參與，也難以有效凋亡細(xì)菌.

3 討 論

可以看到，電暈放電產(chǎn)生的不同活性成分對(duì)細(xì)菌的殺滅效應(yīng)不同. 其中最受關(guān)注的幾種殺菌因素(即臭氧、紫外線、帶電粒子、其他活性氧化劑)的耦合作用并非都是正效應(yīng).

3.1 紫外線與臭氧的聯(lián)合作用

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，較高濃度的臭氧與較高強(qiáng)度的紫外線共同處理細(xì)菌時(shí)，殺滅效率相對(duì)單獨(dú)作用反而下降，表明臭氧和紫外線的聯(lián)合作用非常復(fù)雜. 事實(shí)上，臭氧對(duì)253.7 nm附近波長(zhǎng)的紫外線吸收強(qiáng)烈，這導(dǎo)致臭氧和紫外線的雙重?fù)p失，使臭氧和紫外線的聯(lián)合殺滅效率降低. 但另一方面，更短波長(zhǎng)的紫外線(200 nm以下)有利于空氣中臭氧的形成. 部分紫外殺菌機(jī)也正是利用了該原理，實(shí)際上是紫外線產(chǎn)生的臭氧的殺菌作用[25].

在較弱的電暈放電中，紫外線主要集中在300～400 nm波段，300 nm以下波段輻射并不強(qiáng). 這一波段的紫外線進(jìn)行殺菌時(shí)一般需要足夠的功率密度才能實(shí)現(xiàn). 大氣壓低溫等離子體的紫外線功率密度本身較低(一般低于50 μW/cm-2)，故較遠(yuǎn)距離處的電暈紫外殺菌效應(yīng)很小[26].

3.2 中性粒子的作用

無論是臭氧還是其他中性活性氧化劑，對(duì)細(xì)菌的殺滅作用是顯而易見的，這也是以往眾多研究所確定的事實(shí)[27-29]. 本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，在電暈放電消除了帶電粒子后的放電產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌的殺滅作用非常強(qiáng). 雖然帶電粒子本身的殺菌效應(yīng)較弱，但其產(chǎn)生的電效應(yīng)可以加強(qiáng)中性活性粒子的殺滅效果. 這也是本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的特別效應(yīng).

3.3 電暈風(fēng)帶電粒子的作用

獨(dú)立的電暈風(fēng)中帶電粒子并不是殺菌的主要因素. 帶電粒子可以產(chǎn)生2個(gè)效應(yīng)，一是動(dòng)能效應(yīng)，這與電暈風(fēng)速度有關(guān). 只有足夠速度的帶電粒子才能直接刺穿細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)菌凋亡. 電暈風(fēng)的速度小(～1 m/s量級(jí))，離子動(dòng)能小，對(duì)細(xì)菌的殺滅作用很小. 帶電粒子在細(xì)胞表面沉積的生物電效應(yīng)，這與離子密度有關(guān). 但這一效應(yīng)是輔助的，它可以加強(qiáng)其他效應(yīng)，如促進(jìn)中性活性粒子的滲透作用，提高殺滅效果[30].

當(dāng)然，在電暈區(qū)(特別是電暈電極附近)的電場(chǎng)非常強(qiáng)，可能引起與電暈離子風(fēng)區(qū)不同的效果，但在通常的電暈殺菌裝置中，細(xì)菌基本不會(huì)接觸放電電極，因此電暈放電的帶電粒子的殺菌作用是輔助的.

3.4 電暈放電的殺菌機(jī)制和優(yōu)化建議

綜合上面信息，可以推測(cè)負(fù)電暈放電的殺菌機(jī)制如下：電暈放電產(chǎn)生的中性活性物質(zhì)(如O，O3，OH，NO等)在滅菌過程中起到了關(guān)鍵作用，其高活性使得細(xì)菌失活死亡；單獨(dú)的電暈風(fēng)帶電粒子殺菌作用很弱，但帶電粒子的電效應(yīng)可以加強(qiáng)中性活性粒子的滅菌效果，具有輔助殺菌的作用；電暈放電產(chǎn)生的紫外效應(yīng)本身的殺菌作用可以忽略，但紫外線與其他活性物質(zhì)(如O3)的相互作用可能會(huì)影響放電整體的殺菌效率，需要具體考慮.

據(jù)此可以建議：對(duì)于電暈放電殺菌裝置來說，在保證安全性的前提下，應(yīng)當(dāng)通過提高放電強(qiáng)度、增加放電尺度等方式來盡可能提高活性粒子的產(chǎn)率和產(chǎn)量，減小紫外激發(fā)；同時(shí)OH等含氫的自由基對(duì)滅菌有較大貢獻(xiàn)，適當(dāng)增加空氣濕度可以有效提高滅菌效率；負(fù)離子的產(chǎn)生對(duì)滅菌具有輔助作用，對(duì)空氣起到凈化作用，故采用負(fù)電暈的形式更有利于室內(nèi)空氣殺菌和凈化.

4 結(jié) 論

本文選取了金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)菌種，使用負(fù)電暈放電對(duì)其進(jìn)行殺菌處理，統(tǒng)計(jì)殺菌效率，分析滅活機(jī)理，主要結(jié)論如下：

① 單獨(dú)的紫外線、臭氧和負(fù)電暈放電均有較好的殺菌效果，在較短的時(shí)間內(nèi)殺菌效率均可達(dá)到100%. 但紫外線和臭氧的聯(lián)合并不是簡(jiǎn)單的協(xié)同作用. 在電暈放電條件下，紫外殺菌效應(yīng)不是主要機(jī)制.

② 電暈放電中起主要?dú)⒕饔玫氖前∣，O3，OH，NO在內(nèi)的中性活性粒子，其強(qiáng)氧化性導(dǎo)致細(xì)菌凋亡.

③ 電暈風(fēng)中單獨(dú)帶電粒子本身的殺菌作用不明顯，但帶電粒子具有輔助殺菌作用，它促進(jìn)中性活性物質(zhì)的滲透，加強(qiáng)殺菌效果.