王文青，楊淼，馮延賓，姬芳玲，薛松

(1. 大連理工大學 生物工程學院，遼寧，大連 116024； 2. 中國科學院 大連化學物理研究所，遼寧，大連116023)

?；d體蛋白(acyl carrier protein，ACP)廣泛存在于動植物及微生物細胞中，參與脫氫、水解、環(huán)化及?；D移等30余種酶催化反應[1-3]，為脂肪酸、類脂A、聚酮類抗生素、非核糖體多肽等天然產物合成[4-5]提供目的?；羌毎x途徑中不可缺少的輔助蛋白. ACP由70～100個氨基酸殘基組成[6]，其3級結構由4個α螺旋及3個loop區(qū)組成，彼此共同構成一個具有疏水性可容納?；目涨籟7]. 細胞首先合成無活性的apo-ACP，通過α2螺旋上Ser36的羥基與4’-磷酸泛酰巰基乙胺(4’-PPT)基團以磷脂鍵連接形成holo-ACP，脂?；cholo-ACP的4’-PPT末端巰基以硫酯鍵結合形成acyl-ACP[1,8].

ACP的空間結構靈活多變、可塑性強，不同形式或?；揎椀腁CP在3維結構上呈現(xiàn)多樣性. 研究表明apo-ACP經4’-PPT修飾后形成holo-ACP的構象變化，主要表現(xiàn)為不同α螺旋和相關殘基的位置發(fā)生偏移，以及所形成疏水性空腔的體積變化等[7]；通過對ACP和類脂A合成相關酰基轉移酶LpxD天然復合物的3種X射線共結晶結構解析，發(fā)現(xiàn)?；D移期間ACP上的α3和α4螺旋以及l(fā)oop2和loop3的空間構象發(fā)生了明顯變化，這些變化與相關酶的底物選擇性及催化活性密切相關[9]. 目前，特定鏈長的acyl-ACP尚未商品化，常以?；?輔酶A(acyl-CoA)來代替acyl-ACP進行相關酶的體外活性研究[10-11]. 以acyl-CoA為?；w，缺乏重要的載體蛋白ACP與酶的相互作用[9,12]，進而無法全面認識酶的催化特性. 因此，獲得系列acyl-ACP及其突變體，對其性質特點進行差異比較和分析，將為acyl-ACP與相關酶的互作機制研究奠定重要基礎.

本文以ACP 3維結構為基礎，設計12株ACP單點突變體，表達純化相應holo-ACP突變體，在哈氏弧菌acyl-ACP合成酶(AasS)的催化下進一步合成系列C16:0-ACP和C18:1-ACP，并對不同acyl-ACP突變體的疏水性、紫外吸收響應和穩(wěn)定性進行比較分析，探究氨基酸位點突變對acyl-ACP整體性質的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌株與質粒

本文使用的菌株包括大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、BL21和BAP1菌株，質粒載體有pET-28a(+)-ACP和pET-28a(+)-AasS，均由中科院大連化學物理研究所海洋生物工程組實驗室保存.

1.1.2培養(yǎng)基

大腸桿菌表達菌株培養(yǎng)采用Luria Broth(LB)培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基包括10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl和5 g/L 酵母浸粉，pH 7.2. 其中胰蛋白胨和酵母浸粉購自北京奧博星生物技術有限責任公司，NaCl購自天津市科密歐化學試劑有限公司.

1.1.3酶與試劑

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、PrimeSTAR MAX DNA聚合酶Premix、Dpn I內切酶和DNA分子質量標準品均購自大連TaKaRa公司，質粒提取試劑盒、硫酸卡那霉素和咪唑購自上海生工生物工程股份有限公司，二硫蘇糖醇(DTT)購自美國Inalco公司，蛋白質濃度測定試劑盒購自美國Bio-Rad公司，乙腈購自德國Merck公司，三氟乙酸(TFA)、軟脂酸和油酸購自美國Sigma公司.

1.2 實驗方法

1.2.1ACP突變體的設計及質粒構建

通過對不同物種來源的ACP氨基酸序列進行同源性比較(圖1)，結合大腸桿菌來源癸酰基-ACP的氨基酸序列和三維結構信息[13]，在ACP的酰基入口區(qū)域、表面互作區(qū)域和酰基結合口袋區(qū)域設計11個突變位點，共12株ACP突變體，分別為：Q15D，V30L，T40I，T40L，V41M，L47F，T53F，I55F，A60P，E61Q，I63R和T64N(圖1).

ACP突變體的定點突變采用的模板是大腸桿菌pET-28a(+)-ACP質粒，根據突變位點設計引物(表1)，采用50 μL體系，包括上游及下游引物各2 μL、模板質粒0.3 μL、PrimeSTAR MAX DNA聚合酶Premix 25 μL以及無菌水20.7 μL. PCR條件設置為98 ℃ 2 min、98 ℃ 10 s、50 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；循環(huán)結束后72 ℃延伸5 min. PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，37 ℃條件下Dpn I內切酶消化載體30 min，使用熱激法轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆菌落，并進行測序驗證.

1.2.2holo-ACP突變體的表達純化

將測序成功的突變體質粒轉入大腸桿菌BAP1感受態(tài)細胞中使合成的無活性apo-ACP進行修飾反應，獲得holo-ACP[14]. 挑取單菌落接種于5 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)8～10 h(37 ℃，220 r/min). 移取1 mL菌液接種于100 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)16 h(37 ℃，220 r/min)，再移取20 mL菌液接種于1 L含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)(37 ℃，220 r/min )至OD600達0.8～1.0，加0.5 mmol/L IPTG誘導5 h(37 ℃，220 r/min)，使蛋白大量表達，離心(4 ℃，6500 r/min，15 min)收集菌體.

采用鎳離子親和層析和凝膠過濾色譜純化大腸桿菌表達的holo-ACP. 將收集的菌體經裂解液(25 mmol/L PBS pH 7.5，150 mmol/L NaCl，5%甘油，1‰β-巰基乙醇)重懸均勻后超聲破碎，離心(4 ℃，15 000 r/min，40 min)收集上清液. 將收集的上清液在預平衡的鎳柱上緩慢流穿，利用漂洗緩沖液(25 mmol/L PBS pH 7.5，150 mmol/L NaCl，5%甘油，20 mmol/L咪唑)洗脫吸附在鎳柱上的雜蛋白，再用洗脫緩沖液(25 mmol/L PBS pH 7.5，150 mmol/L NaCl，5%甘油，350 mmol/L咪唑)洗脫并收集目的蛋白，采用Bradford檢測目的蛋白洗脫情況. 將收集的holo-ACP洗脫液濃縮至5 mL后，上樣于AKTA prime系統(tǒng)的HiLoadTM16/600 SuperdexTM200凝膠過濾層析柱中進行分離，于洗脫體積90 mL左右處收集目的蛋白holo-ACP，保存蛋白用緩沖液組成為25 mmol/L PBS pH 7.5、150 mmol/L NaCl、5%甘油和1 mmol/L DTT，采用15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測各holo-ACP突變體的電泳遷移差異.

1.2.3哈氏弧菌acyl-ACP合成酶(AasS)的表達純化

AasS的表達純化采用丁威等[15]改進方法進行. 將質粒pET-28a(+)-AasS轉入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，菌體擴大培養(yǎng)過程同holo-ACP，待1 L大腸桿菌培養(yǎng)液OD600達0.6～0.8時，加0.5 mmol/L IPTG，30 ℃誘導6 h，使蛋白大量表達，離心(4 ℃，6 500 r/min，15 min)收集菌體. AasS的純化方法同holo-ACP.

1.2.4acyl-ACP的合成

acyl-ACP的合成采用丁威等[15]改進方法進行. 在AasS催化下，以1.2.2中純化的holo-ACP為?；荏w，以軟脂酸鈉和油酸鈉為酰基供體，分別合成C16:0-ACP和C18:1-ACP，按表2的反應體系依次加入各組分，反應溫度為30 ℃，于300 r/min下攪拌2 h進行合成反應，其中軟脂酸鈉和油酸鈉通過軟脂酸和油酸與0.5 mmol/L NaOH經煮沸反應獲得. 合成后的acyl-ACP產物經凝膠過濾色譜純化，除去咪唑、ATP、Mg2+、AasS、脂肪酸鈉鹽和其它雜蛋白. 將收集的acyl-ACP洗脫液利用超濾離心管(3 KD，Millipore)濃縮至2 mmol/L，液氮冷凍后保存于-80 ℃.

表2 C16:0-ACP和C18:1-ACP的合成反應體系

1.2.5不同形式ACP突變體的純度檢測分析

采用配備有ODS-C8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)的HPLC(Agilent 1260)對不同形式的ACP進行檢測分析，包括apo-ACP、holo-ACP和acyl-ACP[15]. 二元泵系統(tǒng)包括流動相A和B，A為含0.1% TFA的水，B為乙腈，流速設置為1 mL/min，紫外檢測波長為210 nm，柱溫為25 ℃，反應體系為50 μL，進樣量為10 μL，洗脫程序見表3. 利用HPLC檢測分析1.2.2中表達純化的holo-ACP純度以及1.2.3中合成并純化的acyl-ACP純度.

表3 HPLC流動相的梯度洗脫程序Tab.3 Gradient elution program of mobile phase for HPLC

2 結果討論

2.1 holo-ACP突變體表達純化性質差異

通過SDS-PAGE分析12株holo-ACP突變體(圖2)，除I63R出現(xiàn)3個條帶外，其余11株holo-ACP突變體均為單一條帶，該條帶出現(xiàn)在20 kDa處，但holo-ACP的相對分子質量為11 kDa，這是由于大腸桿菌ACP富含酸性陰離子氨基酸殘基-天冬氨酸和谷氨酸，二者所占比例近50%，使得holo-ACP在SDS-PAGE中的遷移特征與常規(guī)蛋白質有所不同，這與文獻[16]一致. 可見，除I63R外的11株holo-ACP突變體均純化成功(I63R的holo-ACP不再繼續(xù)合成acyl-ACP)，T64N的條帶位置在其余10株突變體條帶下方，與野生株(WT)有所不同，上述10株突變體的電泳遷移性質與WT類似.

由表4可知，holo-ACP突變體表達過程中，先表達的apo-ACP進一步發(fā)生后修飾反應，生成holo-ACP，apo-ACP沒有完全反應生成holo-ACP. 除I63R的holo-ACP純度只有49%外，WT和其余11株突變體的holo-ACP純度在84%～99%之間. 12株holo-ACP突變體中，I63R的蛋白獲得量最低，為5.1 mg/L，T40I，L47F，I55F和A60P與WT的蛋白獲得量在同一水平，均在10 mg/L以上，其余7株holo-ACP突變體的蛋白獲得量在7～9 mg/L之間.

表4 holo-ACP突變體的分離純化結果

12株holo-ACP突變體在凝膠過濾色譜中的分離性質差異較大，其保留時間均比WT提前，最明顯的是I63R，保留時間比WT提前13 min，這與其蛋白表達量和純度的特殊性相對應(表4). 此外T40I和T40L的保留時間與WT最接近，其余9株突變體的保留時間比WT提前4～6 min. Parris等[17]研究結果表明，holo-ACP合成酶ACPS的單位點突變體在凝膠過濾色譜中的保留時間差異與其蛋白分子摩爾質量差異相一致，如Q113E的保留時間比WT提前0.4 min，而Q113R和I5R比WT延遲1.7 min. 本文中，12株ACP突變體的載體序列相同，蛋白分子摩爾質量相近，其在凝膠過濾色譜中保留時間的差異可能與apo-ACP和holo-ACP空間構象不同有關，apo-ACP通過與4’-PPT相結合形成holo-ACP，使得ACP構象由封閉向開放狀態(tài)轉變[7]，導致二者在凝膠中的滲濾速度不同，特別是I63R，其holo-ACP純度只有49%，高比例apo-ACP的存在使得其在凝膠色譜中的分離性質變得非常不同，因此ACP突變體在凝膠過濾色譜中的保留時間差異表明不同ACP突變體的空間構象發(fā)生了改變.

2.2 HPLC檢測分析acyl-ACP的性質差異

通過HPLC對acyl-ACP合成產物(包括holo-、apo-和acyl-ACP)進行分析，對不同ACP突變體的疏水性、紫外吸收響應和穩(wěn)定性進行了比較.

首先，由表5可知，各ACP突變體的C16:0-ACP和C18:1-ACP合成產物的色譜分離結果有所不同. 色譜柱ODS-C8具有疏水性特性. ACP的疏水性越強，與色譜柱的吸附作用越強，保留時間就越長. 影響ACP疏水性的因素包括結構和所攜帶的?；? 脂?；鵆18:1的疏水性強于C16:0-ACP，使得C18:1-ACP保留時間較C16:0-ACP延遲. 突變體V30L，T40I，T40L和T53F的holo-，apo-和acyl-ACP保留時間均較WT延遲，A60P和E61Q的保留時間均較WT提前. 其中，V30L中亮氨酸L較纈氨酸V多一個甲基，二者均為脂肪族氨基酸，V相對于L的疏水性強，因此保留時間延遲；T40I，T40L和T53F中蘇氨酸T為含羥基氨基酸，異亮氨酸I和亮氨酸L均為脂肪族氨基酸，苯丙氨酸F含有苯環(huán)，I，L和F相對于T的疏水性均增強，因此保留時間延遲，特別是T40I和T40L的保留時間延遲近2 min，其疏水性明顯增強；A60P中丙氨酸A為脂肪族氨基酸，脯氨酸P為非極性氨基酸；E61Q中谷氨酸E為酸性氨基酸，谷氨酰胺Q為極性氨基酸；P相對于A，以及Q相對于E的親水性均有所增強，因此保留時間提前. 由此可見，11株ACP突變體中，T40I和T40L的疏水性變化最顯著，這也表明T40氨基酸殘基在ACP性質穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用.

表5 acyl-ACP合成產物在HPLC上的保留時間

其次，本文比較了各C16:0-ACP和C18:1-ACP突變體在HPLC中檢測信號的單位峰面積所代表的物質的量(fmol/mAU)的差異(圖3)，以此來表征其在紫外吸收響應方面的性質差異，fmol/mAU越小，表明該蛋白的紫外吸收響應越強. 由圖3可知，單位點突變使大部分C16:0-ACP和C18:1-ACP突變體的紫外吸收響應增強，其中與WT相比，C16:0-ACP突變體在210 nm處的紫外吸收響應差異較大的為T40L和A60P，C16:0-ACP的fmol/mAU分別只有WT的0.4和0.3倍，其余10株突變體與WT相近；對于C18:1-ACP，除Q15D和V30L外，其余10株突變體的紫外吸收響應均顯著高于WT，特別是T40I，T40L和I55F，其C18:1-ACP的fmol/mAU分別只有WT的0.2，0.5和0.5倍. 因此， T40氨基酸殘基也使ACP的紫外吸收發(fā)生了明顯的變化.

最后，對acyl-ACP合成產物中C16:0-ACP和C18:1-ACP的純度及其穩(wěn)定性進行了評價. 由圖4可知，WT和大多突變體的C16:0-ACP純度低于相應的C18:1-ACP純度，表明ACP的單點突變對C16:0-ACP穩(wěn)定性的影響更大. 在11株ACP突變體中，C16:0-ACP和C18:1-ACP與WT之間純度差異較大的為T40I，L47F，T53F和I55F，這4株突變體的C16:0-ACP純度均在60%以下，C18:1-ACP純度均在75%以下；其余7株突變體的純度均等同于或高于WT. 由表6可知，上述4株C16:0-ACP突變體經-80 ℃凍融后，其holo-ACP比例均提高至20%以上，相應的C18:1-ACP突變體經凍融后的holo-ACP比例提高至5%～10%之間，WT和其余7株突變體的holo-ACP比例變化不大. 這些結果表明上述4株突變體的acyl-ACP易水解，性質相對不穩(wěn)定. 此外，上述4株holo-ACP突變體合成acyl-ACP后，所含apo-ACP比例會明顯增大(表4和圖4)，這可能是在30 ℃合成反應期間ACP上Ser36的羥基與4’-PPT磷酸基之間的磷酯鍵水解造成的. 可見，ACP的單點突變T40I，L47F，T53F和I55F會使acyl-ACP合成反應體系的不穩(wěn)定性提高，還會影響其已合成C16:0-ACP和C18:1-ACP的水解，表明這些氨基酸殘基在維持ACP的結構和性質穩(wěn)定方面具有重要作用. 根據ACP氨基酸位點的分布信息，T40和L47位于α2螺旋，T53和I55位于L2. Masoudi等研究[9]表明，ACP可通過調節(jié)α2螺旋、L2和α3螺旋的位置來控制其疏水空腔大小，以容納不同鏈長的酰基，導致acyl-ACP整體構象發(fā)生改變. 因此，本研究進一步表明了氨基酸殘基T40、L47、T53和I55在維持ACP構象穩(wěn)定中發(fā)揮的重要作用.

表6 C16:0-ACP和C18:1-ACP突變體的穩(wěn)定性Tab.6 Stability of C16:0-ACP mutant and C18:1-ACP mutant

3 結 論

本文通過構建系列大腸桿菌來源ACP單點突變體，表達純化出相應holo-ACP，并進一步合成C16:0-ACP和C18:1-ACP，采用HPLC法比較分析了不同acyl-ACP突變體的疏水性、紫外吸收響應和穩(wěn)定性. 結果表明，T40I和T40L在疏水性色譜柱中的保留時間較野生株延遲近2 min，二者在疏水性質方面變化最顯著；在單位峰面積所代表的物質的量方面，T40L的C16:0-ACP和C18:1-ACP分別只有野生株的0.4和0.5倍，該acyl-ACP突變體的紫外吸收響應顯著增強；此外，T40I，L47F，T53F和I55F使acyl-ACP合成反應體系的不穩(wěn)定性提高，還影響C16:0-ACP和C18:1-ACP的水解，這些氨基酸殘基在維持ACP的結構和性質穩(wěn)定方面具有重要作用. 因此，ACPα2螺旋上T40殘基的改變會影響acyl-ACP整體的性質，關于T40殘基對ACP三維結構及相關酶催化特性的影響還有待進一步研究. 這些結果為acyl-ACP與相關酶的相互作用機制研究奠定了基礎.