阮宏亙 陳敏菲 周小明 侯若南 王志翊（通訊作者）

（1 長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院 湖南 長(zhǎng)沙 410000）

（2 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科 浙江 溫州 325000）

胺碘酮是Ⅲ類(lèi)抗心律失常藥，臨床上主要用于治療室性和室上性心律失常。然而，胺碘酮導(dǎo)致的肺毒性及肺纖維化是其最嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且病死率高[1]。肺纖維化的典型病理學(xué)過(guò)程為肺泡上皮損傷，炎性細(xì)胞聚集，成纖維細(xì)胞增殖、活化，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，最終導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)異常[2]。研究表明，成纖維細(xì)胞灶的增加是肺纖維化進(jìn)展和預(yù)后不良的重要因素[3]，而成纖維細(xì)胞的增殖被認(rèn)為可能與氧化--抗氧化平衡失調(diào)有關(guān)[4]。目前有關(guān)胺碘酮致成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)不同濃度胺碘酮作用于人胚肺成纖維細(xì)胞（human embryonic lung fibroblast，HELF），觀察其對(duì)HELF 增殖與氧化應(yīng)激水平的影響，為今后從氧化應(yīng)激角度尋找胺碘酮誘導(dǎo)的肺纖維化治療靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1.資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 主要試劑 鹽酸胺碘酮注射劑（杭州 Sanofi-Aventis），胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK8 試劑盒（日本同仁），活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物公司），HELF 細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要儀器 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo scientific 公司）、HEPA CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo scientific 公司）、1300 SERIES A2 生物安全柜（美國(guó)Thermo scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 HELF細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HELF細(xì)胞從液氮取出復(fù)蘇后，置于含10%FBS 和1%青鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的飽和濕度下體外培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組與胺碘酮組，對(duì)照組：?jiǎn)渭兗?xì)胞培養(yǎng)；胺碘酮組：在對(duì)照組基礎(chǔ)上分別加入終濃度為（1μg/ml、3μg/ml、6μg/ml）的胺碘酮溶液。以上各組細(xì)胞體外培養(yǎng)24h 后，分別觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA 和SOD 水平的改變。

1.2.2 各組HELF 細(xì)胞增殖檢測(cè) 各組HELFs 細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，加入含血清培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清，再加入無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，配成細(xì)胞懸液。將HELF 細(xì)胞以1×104/孔接種于96 孔板，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24h 后，吸去培養(yǎng)液，PBS 液洗滌1次，各孔加入無(wú)血清DMEM 100μl 和CCK8 試劑10μl，繼續(xù)培養(yǎng)3 ～4h，分別于450nm 處測(cè)定其OD 值。

1.2.3 各組HELF 細(xì)胞ROS 含量檢測(cè) 采用胰蛋白酶消化HELF 細(xì)胞，PBS 液清洗2 次，雙氯熒光素（DCFH-DA）作為ROS捕捉劑，以終濃度為10μmol/L 的DCFH-DA 孵育細(xì)胞20min，孵育結(jié)束后用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液反復(fù)洗滌細(xì)胞3 次，設(shè)置熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)488nm、發(fā)射波長(zhǎng)525nm 處檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度大小可反映細(xì)胞內(nèi)ROS 水平高低。

1.2.4 各組HELF 細(xì)胞SOD 和MDA 水平測(cè)定 通過(guò)胰酶消化收集各組HELF 細(xì)胞，用超聲波裂解HELF 細(xì)胞，經(jīng)4000rpm 離心15 min，取上清液，BCA 法測(cè)定其蛋白濃度。SOD 活性測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA 含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸縮合法，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 胺碘酮對(duì)各組HELF 細(xì)胞形態(tài)的影響

使用倒置顯微鏡于低倍鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞呈較寬大的紡錘形，與對(duì)照組比較，不同濃度胺碘酮組細(xì)胞均明顯變細(xì)變長(zhǎng)，細(xì)胞胞體變小，細(xì)胞數(shù)量增多。隨著胺碘酮濃度的增加，HELFs細(xì)胞形態(tài)改變及單個(gè)視野細(xì)胞數(shù)量增加越明顯，見(jiàn)圖。

圖 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（ⅹ200）A.對(duì)照組；B.胺碘酮組（1μg/ml）；C.胺碘酮組（3μg/ml）；D.胺碘酮組（6μg/ml）。

2.2 不同濃度胺碘酮對(duì)HELF 細(xì)胞的增殖作用

CCK8 法測(cè)得3 個(gè)不同濃度胺碘酮組（低濃度到高濃度）OD值分別為（1.11±0.10,1.28±0.03 和1.48±0.06），均較對(duì)照組（0.77±0.10）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著胺碘酮濃度增加，各組細(xì)胞增殖逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組HELF 細(xì)胞的增值活性比較（±s）

表1 各組HELF 細(xì)胞的增值活性比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與胺碘酮組（1μg/ml）比較，bP ＜0.05；與胺碘酮組（3μg/ml）比較，cP ＜0.05

組別 胺碘酮濃度 n OD value對(duì)照組 6胺碘酮組 0.77±0.10 1μg/ml 6 1.11±0.10a 3μg/ml 6 1.28±0.03ab 6μg/ml 6 1.48±0.06abc

2.3 不同濃度胺碘酮對(duì)HELF 細(xì)胞的ROS 水平影響

低濃度胺碘酮組（1μg/ml）ROS 熒光強(qiáng)度（4160±175）較對(duì)照組（3887±346）有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中、高濃度胺碘酮組（3、6μg/ml）HELF 細(xì)胞內(nèi)ROS 熒光強(qiáng)度分別為（5365±411、6675±246）均較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；胺碘酮組隨著胺碘酮濃度的增加，各組HELF 細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組HELF 細(xì)胞的ROS 水平比較（±s）

表2 各組HELF 細(xì)胞的ROS 水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與胺碘酮組（1μg/ml）比較，bP ＜0.05；與胺碘酮組（3μg/ml）比較，cP ＜0.05

組別 胺碘酮濃度 n ROS對(duì)照組 6胺碘酮組 3887±346 1μg/ml 6 4160±175a 3μg/ml 6 5365±411ab 6μg/ml 6 6675±246abc

2.4 不同濃度胺碘酮對(duì)細(xì)胞MDA 和SOD 活性影響

胺碘酮組（低濃度到高濃度）HELF 細(xì)胞MDA 含量分別為（2.05±0.19，2.51±0.17，3.47±0.14）nmol/mg，較對(duì)照組（1.33±0.19）nmol/mg 明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；胺碘酮組（低濃度到高濃度）HELF 細(xì)胞SOD 活力分別為（21.27±0.97，18.05±1.06，13.53±0.98）U/mg，較對(duì)照組（24.27±0.83）U/mg 降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著胺碘酮濃度的增加，各組HELF 細(xì)胞MDA 含量逐漸升高，SOD 活力逐漸下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組HELF 細(xì)胞的MDA 含量和SOD 活性比較（±s）

表3 各組HELF 細(xì)胞的MDA 含量和SOD 活性比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與胺碘酮組（1μg/ml）比較，bP ＜0.05；與胺碘酮組（3μg/ml）比較，cP ＜0.05

組別 胺碘酮濃度 n MDA（nmol/mg） SOD（U/mg）對(duì)照組 6胺碘酮組 6 1.33±0.19 24.27±0.83 1μg/ml 6 2.05±0.19a 21.27±0.97a 3μg/ml 6 2.51±0.17ab 18.05±1.06ab 6μg/ml 6 3.47±0.14abc 13.53±0.98abc

3.討論

胺碘酮是臨床上用于預(yù)防和治療心律失常的常見(jiàn)藥物之一，由于其具有潛在的致命性的肺毒性[5]（彌漫性肺纖維化、慢性間質(zhì)性肺炎和急性呼吸窘迫癥等），近年來(lái)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛的關(guān)注。胺碘酮導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)病機(jī)制可能與各種類(lèi)型的細(xì)胞共同作用（肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，炎性細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞），線粒體功能障礙，免疫介導(dǎo)的機(jī)制，血管緊張素系統(tǒng)等有關(guān)[6]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)胺碘酮誘導(dǎo)HELF 細(xì)胞的增值，破壞了HELF 細(xì)胞的氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡（ROS，MDA 升高，SOD下降），造成了細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

肺纖維化是以纖維病灶為基礎(chǔ)性的病理改變，主要由大量的細(xì)胞外基質(zhì)和增殖轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞組成，其中成纖維細(xì)胞在肺纖維化過(guò)程中起著重要作用。肺成纖維細(xì)胞常見(jiàn)為梭形和扁平星形等[7]，形態(tài)可根據(jù)細(xì)胞功能變化而改變。本研究中，在胺碘酮誘導(dǎo)下，HELF 細(xì)胞增值活躍，細(xì)胞明顯變細(xì)變長(zhǎng)，胞體變小，數(shù)量增多，并且與胺碘酮的濃度正相關(guān)，這說(shuō)明胺碘酮可促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖，并隨著濃度的增加，增殖越活躍。這與臨床的發(fā)現(xiàn)是一致的，在臨床上，胺碘酮的治療時(shí)間和每日的劑量與胺碘酮導(dǎo)致的肺毒性有一定的聯(lián)系[8]。

近年來(lái)大量的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是肺纖維化形成及發(fā)展的重要病理機(jī)制之一[9-11]。早在1988 年Cantin AM 等[12]提出了間質(zhì)性肺炎中存在氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，ROS 是引起肺損傷的主要原因,并能影響肺組織修復(fù)[13]。正常情況下，ROS引發(fā)的組織損傷可被內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)所抑制。然而,當(dāng)過(guò)量的氧化物產(chǎn)生，引起氧化一抗氧化系統(tǒng)失衡時(shí)，使得抗氧化物不足以應(yīng)對(duì)，組織就會(huì)發(fā)生不可逆性損傷[14]。MAD 又稱(chēng)丙二醛,是自由基攻擊生物膜時(shí)，不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。SOD 是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的主要酶類(lèi)，在肺組織中有極強(qiáng)的抗氧化力，具有抗氧化、抗炎等作用[15]，SOD 活性的大小能反應(yīng)其抗氧化能力。本研究發(fā)現(xiàn)，胺碘酮誘導(dǎo)HELF 細(xì)胞產(chǎn)生ROS、增加MDA 含量，降低SOD 活性，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，這表明胺碘酮可能破壞了機(jī)體氧化應(yīng)激平衡，造成了細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，從而促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)程。

綜上所述，胺碘酮誘導(dǎo)HELF 細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增值，呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。研究結(jié)果提示維持氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡，阻斷肺成纖維細(xì)胞異常增殖，可能成為治療肺纖維化的一個(gè)靶點(diǎn)。