郭詩曼，馮 啟

(浙江外國語學(xué)院科學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310023)

鏈格孢霉菌(Alternariatoxins) 是一種絲狀真菌，在蔬菜、水果及谷物中的病原體和腐生菌中多有發(fā)現(xiàn)[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這些代謝產(chǎn)物具有致突變、致癌、致畸、致死、細(xì)胞毒性、基因毒性、胚胎毒性、急性毒性等毒性[2]，比如研究人員發(fā)現(xiàn)了某些代謝物與人類食道癌密切相關(guān)[3]。農(nóng)作物被該菌侵染之后會出現(xiàn)小麥黑斑病、柑橘黑斑病等常見的病害，造成糧食減產(chǎn)或水果腐爛。鏈格孢霉菌的污染地域也十分廣闊，遍及歐洲、美洲及亞洲。歐洲食品安全局已經(jīng)對鏈格孢霉毒素進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評估，認(rèn)為具有遺傳毒性的交鏈孢酚與交鏈孢酚單甲醚應(yīng)該引起人們的重視[4]。而此前，該菌都未引起學(xué)者的關(guān)注，考慮其污染范圍、污染物種及毒理性質(zhì)，目前已經(jīng)有越來越多的科學(xué)家著手研究鏈格孢霉毒素。但是目前全世界范圍內(nèi)都沒有定制鏈格孢霉菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。本文詳細(xì)綜述了鏈格孢霉菌毒素的毒理性質(zhì)與污染現(xiàn)狀，概述了檢測方法，旨在推動我國盡快建立關(guān)于鏈格孢霉菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范。

1 簡介與毒理性質(zhì)

鏈格孢霉菌是一種廣泛分布于泥土的真菌，能通過田間侵染、貯存接觸等途徑污染農(nóng)作物。值得注意的是，由于鏈格孢霉菌能在低溫環(huán)境下完成生長繁殖，所以鏈格孢霉菌還是導(dǎo)致瓜果、蔬菜以及一些冷藏食品腐敗變質(zhì)主要真菌。鏈格孢霉菌能產(chǎn)生許多次級代謝產(chǎn)物，其中有一些已被證實(shí)具有明顯毒性[5]，但是只有很少一部分毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)被表征，這些毒素根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為五類(見表1和圖1)。其中，AOH、AME、TeA、TEN是目前科學(xué)家們關(guān)注最多的四種毒素。

表1 鏈格孢霉毒素分類

1.1 交鏈孢酚(AOH)

AOH的外觀為無色針狀晶體，分子式為C14H10O5，摩爾質(zhì)量為258.23，熔點(diǎn)350 ℃，密度1.56 g/cm3，與氯化物混合反應(yīng)后會呈現(xiàn)紫色，經(jīng)紫外線照射后會發(fā)出藍(lán)色熒光[6]。目前發(fā)現(xiàn)AOH 具有致突變性、致癌性、基因毒性、遺傳毒性、細(xì)胞毒性、胚胎毒性，但AOH對實(shí)驗(yàn)所用動物的急性毒性較低。

Celia等[7]評估了AOH引發(fā)毒性的途徑，結(jié)果顯示經(jīng)AOH處理24 h和48 h后的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或壞死，線粒體膜電位(Δψm)也出現(xiàn)相應(yīng)變化，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。Fernández等[8]也評估了AOH在人結(jié)腸腺癌(Caco-2)細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明，AOH在最高測試濃度下對Caco-2細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)AOH可引起細(xì)胞的致突變和轉(zhuǎn)化，還可誘導(dǎo)胎兒食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生。此外，有研究顯示AOH與我國某些地區(qū)食管癌高發(fā)密切相關(guān)[4]，且AOH的致癌機(jī)理與AOH的活性、癌基因的激活以及抑癌基因的變異密切相關(guān)。

Fliszár-Nyúl等[10]對AOH與牛、豬和大鼠蛋白的結(jié)合親和力進(jìn)行了測試，結(jié)果表明AOH與血清蛋白有很強(qiáng)的相互作用，提示了這些相互作用在體內(nèi)的潛在重要性。還有研究發(fā)現(xiàn)，AOH通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。拓?fù)洚悩?gòu)酶與DNA的超螺旋調(diào)節(jié)聯(lián)系在一起，并參與細(xì)胞的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等，AOH由此引起單鏈 DNA 和雙鏈 DNA 的斷裂[11]。Solhaug等[12]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)激通常與自噬有關(guān)，因此采用RAW264.7巨噬細(xì)胞模型來驗(yàn)證AOH誘導(dǎo)自噬的假說。透射電鏡分析表明，AOH處理的細(xì)胞不僅能清晰地顯示自噬相關(guān)的結(jié)構(gòu)，如自噬體和自體溶酶體，而且還能清晰地顯示板層小體的出現(xiàn)。長期的AOH處理使細(xì)胞形態(tài)由圓形變?yōu)樾切?，?半乳糖苷酶活性增加，這表明細(xì)胞最終進(jìn)入衰老。因此，這些數(shù)據(jù)表明AOH是自噬和衰老的誘導(dǎo)劑。且這些作用可能與AOH誘導(dǎo)的DSB(通過對拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的影響)有關(guān)，導(dǎo)致p53和Sestrin2-AMPK-mTOR-S6K信號通路的激活。

圖1 四種鏈格孢霉毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖

此外，有研究發(fā)現(xiàn)AOH 對細(xì)胞天然免疫具有調(diào)節(jié)作用，Grover等[13]研究了AOH對人支氣管上皮細(xì)胞株(Beas-2B)和小鼠巨噬細(xì)胞株(RAW 264.7)天然免疫的調(diào)節(jié)作用，在研究中發(fā)現(xiàn)AOH能抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)。用AOH處理Beas-2B細(xì)胞會引起形態(tài)學(xué)改變，包括分離的生長模式和伸長的手臂。AOH相關(guān)免疫抑制和形態(tài)學(xué)改變與這些真菌毒素在G2/M期引起細(xì)胞周期阻滯的能力有關(guān)。

1.2 交鏈孢酚單甲醚(AME)

AME的許多性質(zhì)都與AOH相似，如外觀都是無色針狀晶體，經(jīng)紫外線照射都可發(fā)出藍(lán)色熒光。AME的分子式是C15H12O5，摩爾質(zhì)量為272.25，熔點(diǎn) 267 ℃。AME具有致畸性、致突變性、致癌性、胚胎毒性、誘變性。

有學(xué)者對AME的誘變性進(jìn)行研究，如An等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AME是大腸桿菌ND-160菌株的一種強(qiáng)誘變劑，而AME的致突變性表現(xiàn)出對特定基因組區(qū)域或DNA序列的選擇性。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高劑量AME喂養(yǎng)后的胎鼠會出現(xiàn)不同的癥狀，例如平均體重減輕和嚴(yán)重的器官衰竭。AME還可能引起細(xì)胞周期變化，例如動脈內(nèi)出血，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞的產(chǎn)生。石智勇等[15]對食管癌高發(fā)區(qū)糧食中分離的AME在大鼠、小鼠體內(nèi)的分布進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AME對前胃、食管下半部分有較高的親和力。

AME與其他毒素之間存在協(xié)同作用。Bensassi等[16]研究了交替醇二元混合物(AOH和AME)對人腸細(xì)胞株HCT 116細(xì)胞的作用。發(fā)現(xiàn)將HCT 116細(xì)胞暴露于低劑量的AOH或AME時(shí)，會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，然而，當(dāng)二者加在一起時(shí)，它們的毒性潛力就會大大增加。因此，該研究表明，AOH與AME的結(jié)合具有明顯的相加性。

1.3 細(xì)交鏈孢菌酮酸(TeA)

TeA是一種油狀、褐色物質(zhì)，易溶于多種有機(jī)溶劑，能與許多物質(zhì)發(fā)生螯合[17]。作為美國食品和藥物管理局(FDA)在有毒化學(xué)物質(zhì)注冊中列出的唯一鏈格孢屬毒素，該毒素的特征是檢出率低，但產(chǎn)生毒素的能力非常強(qiáng)[2]。TeA具有急性及亞急性毒性、胚胎毒性、細(xì)胞毒性、致癌性以及致死性。

Yekeler等[18]研究了TeA對小鼠食管的可能毒性作用。小鼠口服TeA 10個(gè)月后，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)這些動物出現(xiàn)以極性喪失、核多形性和色素亢進(jìn)為特征的發(fā)育不良。經(jīng)TeA處理的粘膜上皮細(xì)胞電鏡觀察顯示，部分細(xì)胞核固縮、顆?；⑷旧|(zhì)增多、核輪廓不規(guī)則、核質(zhì)空泡化，在原子核中有明顯的多形性。綜上所述，Yekeler等認(rèn)為TeA具有較高的毒性，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化異常。Gregory等[19]研究了AOH、AME、ALT、TeA對雞胚的影響。采用卵黃囊注射方法，對7日齡雞胚分別注射1000、500和1000 μg劑量的AOH、AME和ALT時(shí)，沒有出現(xiàn)致死率或致畸作用。而對雞胚注射548 μg劑量的TeA時(shí)，就有50%雞胚出現(xiàn)死亡，證實(shí)了TeA有致死性。除上文提到的毒性外，還有研究發(fā)現(xiàn)TeA可作為一些抑制劑。如Zhou等[20]發(fā)現(xiàn)TeA是防治棉花和煙田等重要雙子葉草和單子葉雜草的一種生物除草劑。

1.4 騰毒素(TEN)

TEN表現(xiàn)為結(jié)晶狀，在有機(jī)溶劑中極易溶解，熔點(diǎn)為172～175 ℃[21]。TEN是環(huán)四肽類毒素，具有植物毒性，與植物萎黃病密切相關(guān)，能通過降低植物細(xì)胞內(nèi)ATP酶活性來抑制光合磷酸化。值得注意的是，TEN對哺乳動物的毒性試驗(yàn)?zāi)壳吧形匆妶?bào)道。

1.5 毒理學(xué)評估

2011年，歐洲食品安全局(EFSA)應(yīng)歐盟的請求，審查食品和飼料中鏈格孢霉毒素的安全性。經(jīng)研究，EFSA發(fā)現(xiàn)這些毒素一般存在于谷物和谷物制品、番茄和番茄制品、葵花籽和向日葵油、水果和水果制品以及啤酒和葡萄酒中。且鏈格孢霉毒素不僅能對許多作物造成植物疾病，其中一些毒素還能在體外和/或在大鼠體內(nèi)產(chǎn)生遺傳毒性[4]。因此，EFSA采用了毒性關(guān)注閾值(TTC)方法來評估人類飲食中接觸這些毒素的相對關(guān)注程度。對于遺傳毒性毒素AOH和AME，目前人們慢性飲食接觸量已超過了相關(guān)的TTC值，需要引起人們的關(guān)注。而非遺傳毒性的TeA和TEN的飲食接觸估計(jì)值低于相關(guān)的TTC值，被認(rèn)為不太可能成為人類健康的問題。同時(shí)，EFSA也對其攝入量發(fā)表了科學(xué)意見，TEN最大日攝入量閾值初步設(shè)為1500 ng/kg bw/d。我國國家風(fēng)險(xiǎn)評估中心也對鏈格孢霉毒素進(jìn)行了評估，結(jié)果表明：隨膳食攝入的TeA對2～6歲兒童會存在健康威脅。然而，目前除巴伐利亞外，世界各地均無關(guān)于鏈格孢霉菌毒素的法規(guī)，我國只在出口水果蔬菜中鏈格孢菌毒素的測定中規(guī)定了其檢出限為10 μg/kg。考慮其毒性、污染范圍、污染地域，筆者認(rèn)為我國應(yīng)盡快建立關(guān)于鏈格孢霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)與法規(guī)。

2 污染現(xiàn)狀

2.1 瓜果蔬菜

大多數(shù)果蔬營養(yǎng)豐富、含水量高，故極易于被鏈格孢霉毒素感染而得病。2000年以來，全球各地均有番茄、蘋果、藍(lán)莓、葡萄、柑橘等瓜果經(jīng)報(bào)道被AOH與AME感染。而在上述提到的這些瓜果蔬菜中，最易受鏈格孢霉毒素感染的是番茄及其制品等，且TeA檢出率最高，其次是AOH和AME。

Noser等[22]研究了瑞士市場中的85種番茄產(chǎn)品，包括去皮和切碎的西紅柿，番茄湯和番茄醬以及干的和新鮮的西紅柿，發(fā)現(xiàn)有7份樣品中檢出了TeA。Sanzani等[23]對意大利南部的鮮、干番茄中交鏈孢毒素含量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明所有番茄樣品均不同程度地受到TeA的污染，其次是AME、TEN和AOH。除上述國家外，美國、巴西、阿根廷、瑞士、意大利等地的番茄中均有交鏈孢霉毒素檢出。

除番茄外，橘類也非常容易被鏈格孢霉菌感染。史文景等[24]采用UPLC-ESI-MS-MS法測定了100個(gè)柑橘樣品中的鏈格孢霉毒素，結(jié)果顯示有15%柑橘果皮樣品呈陽性，7%份全果樣品呈陽性，同時(shí)有3份果肉樣品被檢測出AME。

2.2 谷物及其制品

鏈格孢霉菌是普遍存在于各種谷物中的主要致病真菌。與果蔬相比，寄生于谷物中的鏈格孢菌株種類比較少，但其分布非常廣，遍及全球各地，德國和阿根廷等國家還曾爆發(fā)過由鏈格孢霉毒素引起的小麥黑胚病，導(dǎo)致小麥急劇減產(chǎn)，損失慘重，為此，歐洲長期監(jiān)測鏈格孢霉菌對小麥的危害。

Jovana等[25]首次評價(jià)了鏈格孢霉菌侵染及其毒素對小麥品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，真菌污染顯著降低了貿(mào)易和工藝質(zhì)量參數(shù)。接種鏈格孢霉菌后的小麥體積重、千粒重和濕面筋含量顯著降低，蛋白質(zhì)含量顯著提高。AOH對體積重和千粒重影響最大(-0.847；-0.898)，與蛋白質(zhì)含量(0.758)呈極顯著正相關(guān)。鏈格孢霉菌另外還破壞了面粉面筋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致面團(tuán)能量降低和烘焙質(zhì)量下降。

Marina等[26]研究2001年至2010年勃蘭登堡州(德國)不同地區(qū)商業(yè)農(nóng)場的1064個(gè)新收獲的冬小麥樣本中的鏈格孢霉毒素含量。采用二極管陣列和熒光檢測器相結(jié)合的高效液相色譜法(HPLC)分析了AOH、AME、ALT和TeA。最常見的真菌毒素是TeA，1064份樣品中有322份(30.3%)受TeA污染，86份(8.1%)被AOH污染，33份(3.1%)被AME污染，267份(2.6%)樣品中有7份(2.6%)受ALT污染。所有年份的最高毒素含量分別為4224 μg(TeA)kg-1，832 μg(AOH)kg-1，905 μg(AME)kg-1和197 μg(ALT)kg-1。幾種真菌毒素在小麥樣品中的共現(xiàn)率較低：只有3份樣品被全部4種毒素污染，14份被3種毒素污染，61份被2種毒素污染，273份被一種毒素污染。

2.3 油料作物

油料作物是一種種子中含有大量脂肪的作物，可用于提取食用油或用作工業(yè)和醫(yī)學(xué)原料。油料作物及其產(chǎn)品(例如食用油)非常容易受到霉菌毒素的污染。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織的估計(jì)，每年全球約25%的農(nóng)產(chǎn)品被霉菌毒素污染，而油料作物無論是通過淋濾還是壓榨，其中的霉菌毒素都會隨之遷移到成品油中。Kralova等[27]2002-2003年共分析了在有機(jī)和/或常規(guī)耕作條件下種植的122個(gè)亞麻和84個(gè)豌豆種子樣本。結(jié)果顯示，有20份亞麻籽中檢出AME，其中2份和4份種還分別檢出ALT(交鏈孢烯)和AOH。Hickert等[28]對來自南非不同產(chǎn)地的不同品種的向日葵種子樣品(N=80)中鏈格孢屬真菌產(chǎn)生的15種毒素進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，超過80%的樣品對一種或多種的鏈格孢霉毒素檢測結(jié)果呈陽性，并且其中TEN的檢出率最高，為73%，其次是TeA，檢出率為51%。

3 檢測方法

3.1 高效液相色譜法

HPLC常用于真菌毒素的實(shí)驗(yàn)室仲裁檢測。Andersen等[29]建立了一種利用HPLC檢測和定量檢測蘋果致病性和產(chǎn)毒鏈格孢霉菌的實(shí)時(shí)PCR方法。實(shí)驗(yàn)對8株鏈格孢霉菌進(jìn)行了AM-毒素I基因及其產(chǎn)物的分析。結(jié)果表明，8株菌株均含有AM毒素基因，均能產(chǎn)生植物致病性觸須毒素。Pavón 等[30]采用HPLC對樣品中α-烯、互變酚和互變酚甲醚的發(fā)生情況進(jìn)行了分析，以評價(jià)PCR法鑒定含有鏈格孢霉毒素的番茄樣品的能力。PCR檢測表明有鏈格孢霉菌的存在，90份商品樣品中有41份(45.6%) DNA，而在31份PCR陽性樣品中，HPLC檢測到至少1份鏈霉菌毒素。鏈格孢霉菌DNA的檢測與所分析的鏈格孢霉毒素的存在有很好的相關(guān)性。

3.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是目前鏈格孢霉毒素最常用的測定方法。Lilly等[31]建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法，并應(yīng)用穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行了分析。方法檢出限(LOD)為0.86 g/kg，定量限(LOQ)為2.89 g/kg。共對德國市場的26個(gè)番茄樣品和4個(gè)鈴椒樣品進(jìn)行了分析。每個(gè)樣品中均檢出TeA，其濃度范圍為2330 μg/kg～3 g/kg。Sebastian等[32]建立了穩(wěn)定同位素稀釋HPLC-MS/MS方法，對德國市場上的20種番茄產(chǎn)品進(jìn)行了色譜分離，結(jié)果顯示所有產(chǎn)品均被TeA污染。Fraeyman等[33]建立了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定豬和肉雞血漿中TeA含量的方法，并對其結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。相關(guān)系數(shù)、擬合優(yōu)度系數(shù)、日內(nèi)和日間精度均在驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，鏈格孢霉毒素在豬和肉雞血漿中的定量限為5.0 ng/mL。

3.3 酶聯(lián)免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay)

除了上述傳統(tǒng)的檢測方法外，使用酶聯(lián)免疫吸附法快速靈敏地檢測交鏈孢菌毒素已成為近期研究的重點(diǎn)。Gross等[34]以天然污染的高粱粒和高粱為原料，以穩(wěn)定的同位素稀釋LC-MS法(SIDA)為參考方法，對TeA的ELISA進(jìn)行了比較分析。ELISA檢測高粱籽粒中LOD為30 μg/kg，高粱為220 μg/kg。SIDA在6～584 μg/kg(平均113 μg/kg)范圍內(nèi)對茶葉的陽性率為100%(n=28)。雖然ELISA法比SIDA法靈敏度低得多，但它可以作為高粱和高粱為基礎(chǔ)的嬰兒食品的篩選方法。

4 結(jié) 語

鏈格孢霉菌是一種能廣泛侵染農(nóng)作物、水果蔬菜的致病真菌，具有許多代謝產(chǎn)物，其中70多種被證實(shí)有明顯的毒性，如致畸性、致死性、致癌性、致突變性、細(xì)胞毒性、急性毒性、胚胎毒性等。科學(xué)家們主要關(guān)注的4種鏈格孢霉毒素為AOH、AME、TeA及TEN。這四種毒素常在谷物、水果、蔬菜、油料作物中被檢出，且有些檢出率極高，被污染的農(nóng)作物遍布世界各地，能引起許多農(nóng)作物病害。歐洲食品安全局已經(jīng)對鏈格孢霉毒素進(jìn)行了評估，結(jié)果表明隨著食品攝入的AOH與AME會對人體產(chǎn)生危害，并且對TEN的攝入量進(jìn)行了評估，其最大日攝入量閾值初步設(shè)為1500 ng/kg bw/d。鑒于其毒性、污染范圍及對人體的潛在危害，中國與世界各國未來應(yīng)加快速度建立鏈格孢霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，從而更好地為食品安全保駕護(hù)航。