苗天培，張震宇，李 中

（1.河北大學醫(yī)學院，保定 071000；2.河北大學附屬醫(yī)院乳腺外科，保定 071000）

三陰性乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和Her2/neu受體均為陰性的乳腺癌，在所有乳腺癌患者中約占15%［1-2］。與普通乳腺癌相比，TNBC具有發(fā)病年齡相對較輕、腫瘤惡性程度較高以及發(fā)生復發(fā)和轉移的可能性更大等特點，對全球婦女健康產生重大影響［3］。免疫靶向治療是近年來受到廣泛關注的癌癥治療方式，與放化療相比，免疫治療可針對腫瘤發(fā)生免疫逃逸的通路進行靶向抑制，以此來抑制腫瘤生長，取得了良好的效果，美國FDA已批準將T細胞的共抑制分子程序性死亡受體/配體-1（Programmed death receptor/ ligand-1，PD-1/PD-L1）抗體藥物Pembrolizumab和Nivolumab用于幾類惡性腫瘤的治療［4-5］。因此，有必要對PD-1/PD-L1在TNBC患者中的表達改變及其臨床意義進行研究，本研究就此展開討論，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取河北大學附屬醫(yī)院乳腺外科2016年1月～2019年10月收治的三陰乳腺癌患者50例作為研究對象，患者年齡36～73歲，平均56.02±9.30歲，納入研究組，選擇同期于我院進行治療的非三陰性乳腺癌患者55例作為對照，患者年齡27～83歲，平均年齡53.04±11.06歲，納入對照組，兩組患者在年齡、病理類型、組織學分級方面差異無統(tǒng)計學意義。納入標準：①乳腺癌及三陰性乳腺癌的診斷參照中國癌癥協(xié)會發(fā)布的《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2019版）》，患者均經病理組織學確診。②入院前未經放化療治療。③臨床資料完整。④患者對本研究知情同意。排除標準：①患者合并乙肝、艾滋病等嚴重傳染性疾病者。②合并除乳腺癌外導致患者免疫功能嚴重不全疾病者。③患者肝腎功能不全，對放化療無法耐受者。

1.2 PD-1/PD-L1在外周血及病灶組織的mRNA表達所有入選患者入院后次日清晨抽取其外周靜脈血2mL，采用淋巴細胞分離液按照步驟制備為外周血單個核淋巴細胞液。對醫(yī)院保存患者乳腺癌病灶組織標本進行收集，將血液標本與組織標本均采用密度梯度離心法提取其RNA，并逆轉錄為cDNA，試劑盒購自北京TIANGEN生化科技有限公司。采用熒光定量聚合酶鏈式擴增法（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain amplification，RT-PCR法）檢測癌組織及外周血中PD-1/PD-L1水平，所用引物序列為：PD-1：上游：5’－CGGCCAGTTCCAAACCCT－3’，下 游：5’－CCATTCCGCTAGGAAAGACA－3’。PD-L1：上游 5’-TGGCATTTGCTGAACGCATTT-3’，下游 5’-TGCAGC CAGGTCTAATTGTTTT-3’，所選內參基因為GAPDH，引物序列：上游5’-GTACGACTCACTATAGGGA -3’，下游5’-AACAGCGACACCCACTCCTCCA-3’，引物設計采用Prime 5.0軟件，由南京擎科生物科技有限公司合成，相對表達結果計算采用2-?ct法計算得出。

1.3 統(tǒng)計學分析收集的實驗數(shù)據使用SPSS 17.0進行分析，實驗數(shù)據中符合正態(tài)分布的計量資料采用mean±SD表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，同組比較以配對t進行，計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，兩組比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關性分析法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者PD-1、PD-L1水平比較與對照組相比，研究組患者癌組織及外周血中PD-1、PD-L1水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 兩組患者PD-1/PD-L1水平比較

2.2 轉移及未轉移組患者PD-1、PD-L1水平比較共有12例三陰乳腺癌患者發(fā)生腫瘤的局部轉移，與未轉移組相比，轉移組三陰乳腺癌組患者癌組織及外周血中PD-1、PD-L1水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 轉移及未轉移組患者PD-1、PD-L1水平比較

2.3 化療前后患者PD-1、PD-L1水平比較與治療前相比，經過放化療治療后，患者PD-1、PD-L1水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

表3 化療前后患者PD-1、PD-L1水平比較

2.4 PD-1、PD-L1水平相關性分析相關性分析結果表明，癌組織與外周血中PD-1/PD-L1水平均呈正相關關系，癌組織與外周血中PD-1、PD-L1水平與CD4+T淋巴細胞水平均呈負相關關系，均具有統(tǒng)計學意義，見表4。

表4 PD-1、PD-L1水平相關性分析

3 討論

乳腺癌是當今時代對女性健康危害較為嚴重的惡性疾病，發(fā)病率較高，近年來隨著醫(yī)學技術的進步，該病的早期診斷及治療有了長足的進步，但對于晚期患者來說，對身體傷害極大的放化療仍是患者進行治療的主要手段。美國國家綜合癌癥網絡中心（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）對12000名乳腺癌患者調查結果表明，與非TNBC患者相比，TNBC患者在發(fā)現(xiàn)疾病后2年內乳腺癌特異性生存率、總體生存率更低［7］，尋找特異性高的分子用于TNBC的治療評價及預后預測具有重要價值。PD-1是近年來免疫學界受到廣泛關注的明星分子，屬于B7H4蛋白超家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的配體包括 PD-L1 及 PD-L2［8］。既往研究［9］表明，以PD-1、CTLA-4、CD28、Tim-3、TIGIT、LAG3等為代表的共信號分子可對T細胞功能產生抑制，是腫瘤逃逸的關鍵機制之一，而以PD-1抗體為主的免疫靶向腫瘤治療藥物已在臨床中有所應用［10］，然而，PD-1/PD-L1在TNBC的治療及預后方面的作用仍不明確。

目前PD-1的檢測主要有幾種方式，通過免疫組化檢測其組織中的蛋白表達、通過流式細胞術檢測其在T細胞表面的表達、通過ELISA法檢測其蛋白在外周血中的表達以及通過RT-PCR檢測其在外周血或病灶組織出的mRNA水平，與其他方法相比，RT-PCR法具有檢測靈敏、成本相對較低等優(yōu)勢［11-12］。本研究通過對外周血及病灶組織處PD-1/PD-L1 mRNA水平進行檢測，結果表明，與非TNBC相比，TNBC組PD-1/PD-L1明顯上調，而與非轉移TNBC患者相比，發(fā)生轉移的TNBC患者PD-1/PD-L1水平更高，同時，放化療治療可明顯降低TNBC患者PD-1/PD-L1水平。此前研究［13］表明，高PD-1陽性免疫細胞浸潤與患者TNBC生存期縮短有關，而PD-1+細胞與TNBC患者高組織學分級、腫瘤分期存在聯(lián)系。RNA測序結果［14］也顯示，與非TNBC相比，TNBC患者PD-L1表達顯著增加。在國內學者的研究中，張亞等［15］發(fā)現(xiàn) PD-1 和 PD-L1 在乳腺癌組織中呈高表達，與腫瘤的侵襲轉移及不良預后存在緊密聯(lián)系，駱麗等［16］研究表明 PD-L1及PD -1在TNBC中高表達，可以作為TNBC免疫治療的靶標及預后標記物，而腫瘤體積大、BLBC、Ki67 增殖指數(shù)高及高 TIL是PD-L1及PD-1 表達的危險因素，此外PD-1/PD-L1表達在 TNBC中存在組織學異質性。

本研究結果證明了三陰乳腺癌患者比普通乳腺癌患者癌組織及外周血中發(fā)生了明顯的PD-1/PD-1通路上調，且與腫瘤轉移、放化療治療存在聯(lián)系，因此對于臨床治療效果的判別具有一定價值，但本研究依然存在一定的缺陷，例如病例數(shù)較少、未對其預后價值進行分析等，其機制有待深入研究。