吳茂森，陳慶賢，劉麗霞

（海南西部中心醫(yī)院藥學(xué)部，儋州 571700）

近年來，腫瘤已經(jīng)成為威脅人類生存健康的重要疾病，其中肺癌的發(fā)病率不斷上升。惡性腫瘤患者的生存率低，在很大程度上與干細(xì)胞樣細(xì)胞的存在有關(guān)。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、增殖、分化的能力，參與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］，腫瘤干細(xì)胞是目前廣大專家學(xué)者廣泛關(guān)注的問題之一。腫瘤的發(fā)展受癌基因、抑癌基因、生長因子的影響。血瘀證是惡性腫瘤臨床患者中醫(yī)癥狀，主要治療手段是活血化瘀，川芎嗪是中藥活血藥中川芎的主要有效成分。本實(shí)驗(yàn)主要是研究分析了川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞原癌基因表達(dá)的抑制作用。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑細(xì)胞株：高轉(zhuǎn)移性人巨細(xì)胞肺癌細(xì)胞PG-BE1，購自上海酶研生物科技有限公司上海酶研生物科技有限公司。主要試劑：鹽酸川芎嗪（常州制藥廠）；雙抗（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）（Gibco公司）；人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）（上海酶聯(lián)免疫生物有限公司）；重組人表皮生長因子（EGF）［（賽默飛飛世爾（上海）］；胰島素（美國 Sigma公司）；B27添加劑（美國Gibco公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（上海浩然生物科技有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Sigma-Aldrich 公司）；VEGE ELISA試劑盒（美國R&D公司）；β-Actin Rabbit mAb（美國CST公司）；Anti-BCRP/ABCG2抗體（美國Abcam公司）；Anti-HIF-1-α抗體（美國Abcam公司）；Goat Anti-Rabbit IgG H＆ L（HRP）、GoatF（ab’）2 ployclonal Secondary Antibody to mouse IgG+IgM+IgAH&L（HRP）（均購自美國Abcam公司）；主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（上海京孚公司）；光學(xué)顯微鏡（上海光學(xué)儀器一廠）；PCR儀（美國ABI公司）；低溫高速離心機(jī)（美國Thermo公司）；-80℃冰箱（海爾）；酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）；微量移液器等。

1.2 PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞分選采用無血清成球培養(yǎng)法分選PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞：常規(guī)復(fù)蘇PG-BE1細(xì)胞后在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在達(dá)到指數(shù)生長期的時(shí)候，胰酶消化、沖洗、重新置于培養(yǎng)基中，調(diào)整其濃度為2×104個(gè)/mL，接種2mL/孔于六孔板中。待細(xì)胞成球、表面顏色變暗、折光度變低時(shí)收集細(xì)胞。

1.3 檢測PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與親代細(xì)胞的克隆形成能力采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與親代細(xì)胞的克隆形成能力：收集兩種細(xì)胞，消化后置于培養(yǎng)基中，調(diào)整其濃度為200個(gè)/mL，分別接種2mL/孔于六孔板中。培養(yǎng)6天后棄去培養(yǎng)液，用95%乙醇固定并結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下觀察。每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野下超過10個(gè)細(xì)胞的克隆灶數(shù)目。

1.4 檢測PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與親代細(xì)胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達(dá)Western blot法檢測PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與親代細(xì)胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達(dá)：收集兩種細(xì)胞后，提取各組細(xì)胞總蛋白并測定其總蛋白濃度。制備濃縮膠與分離膠、加樣、電泳、膜轉(zhuǎn)移、脫脂奶粉封閉、一抗與二抗孵育、暗室中發(fā)光、數(shù)據(jù)分析。以原代細(xì)胞光密度值作為參照，采用相對(duì)光密度值（RQ）表示。

1.5 分組與藥物干預(yù)將PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)48h，之后隨機(jī)分為空白對(duì)照組、低、中、高劑量川芎嗪組（分別為100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL），在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)，之后收集各組細(xì)胞。

1.6 各組PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的VEGF表達(dá)ELISA法檢測各組PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的VEGF表達(dá)：將各組細(xì)胞的上清液收集后，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒步驟操作。

1.7 各組PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的HIF-1α和ABCG2蛋白表達(dá)Westen blot法檢測各組PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的HIF-1α和ABCG2蛋白表達(dá)：收集各組細(xì)胞，按照1.4.3的步驟操作，檢測HIF-1α和ABCG2蛋白的表達(dá)。

1.8 VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表達(dá)RT-PCR檢測VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表達(dá)：收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，按照熒光定量PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，使用SDS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，多組內(nèi)兩組間比較采用 LSD檢驗(yàn)。以P<0.05判定差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞分選接種后第3天開始可以看見有細(xì)胞球形成，之后球體逐漸越來越大，到第6天時(shí)，細(xì)胞球表面顏色變暗、球體折光度變低，結(jié)果見圖1。

圖1 PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞形成的細(xì)胞形態(tài)（×200）

2.2 PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞克隆形成能力PG-BE1原代細(xì)胞與干細(xì)胞樣細(xì)胞的平板克隆灶形成數(shù)目分別為（8.47±1.48）個(gè)、（4.25±1.09）個(gè)，兩組相比較，PGBE1干細(xì)胞樣細(xì)胞克隆灶形成能力更強(qiáng)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與親代細(xì)胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達(dá)以原代細(xì)胞光密度值作為參照（設(shè)為1.00），并與其相比較，PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達(dá)均強(qiáng)于原代細(xì)胞（P<0.05，表1、圖2）。

表1 PG-BE1原代細(xì)胞與干細(xì)胞樣細(xì)胞表面相關(guān)標(biāo)記蛋白的表達(dá)

圖2 Westen blot檢測SOX-2、OCT-4、Nanog蛋白表達(dá)的結(jié)果

2.4 不同濃度川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響低、中、高濃度的川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的VEGF表達(dá)均有抑制作用（P<0.05），各藥物組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表2）。

表2 不同濃度川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響（ng/mL）

2.5 不同濃度川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞HIF-1α和ABCG2表達(dá)的影響低、中、高濃度的川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的HIF-1α和ABCG2表達(dá)均有抑制作用（P<0.05），各藥物組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表3、圖3）。

2.6 不同濃度川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表達(dá)的影響低、中、高濃度的川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表達(dá)均有抑制作用（P<0.05），各藥物組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表4）。

表3 不同濃度川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞HIF-1α和ABCG2表達(dá)的影響

圖3 不同濃度川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞HIF-1α和ABCG2的表達(dá)

表4 不同濃度川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

中草藥對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，其可能是通過抗腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路［2-4］。川芎是一種活血藥，常用于活血行氣，祛風(fēng)止痛，活血祛瘀作用廣泛，適宜瘀血阻滯各種病癥，近年來發(fā)現(xiàn)川芎嗪具有抗腫瘤的作用，其主要的有效成分就是川芎嗪。有研究報(bào)道，腫瘤組織中存在著少數(shù)具有自我更新能力的細(xì)胞就是腫瘤干細(xì)胞，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)的根源，當(dāng)機(jī)體腫瘤干細(xì)胞高度表達(dá)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［5］。肺癌干細(xì)胞比普通肺細(xì)胞更容易突變轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，經(jīng)過多次突變就會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榉伟└杉?xì)胞。

目前，干細(xì)胞表面標(biāo)志相關(guān)基因主要有Oct-4、Sox-2、Nanog［6］。Oct-4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，Sox-2屬于Sox家族成員，Nanog于胚胎干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，在維持干細(xì)胞干性的自我更新及多能性等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此廣大學(xué)者認(rèn)為這三種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)是區(qū)別其他普通腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志之一。本研究結(jié)果顯示，Oct-4、Sox-2、Nanog三種轉(zhuǎn)錄因子在PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的表達(dá)高于其原代細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1是存在于低氧微環(huán)境中作用于細(xì)胞核的的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在腫瘤生成與轉(zhuǎn)移、腫瘤干細(xì)胞干性維持、血管生成等方面起著重要作用，其過度表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的生長增殖。HIF-1α是HIF-1的特異性氧調(diào)節(jié)亞單位，可以通過刺激Oct4、Sox2等關(guān)鍵基因促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的維持，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)［7］，還參與腫瘤血管的生成，刺激血管生成因子分泌，通過抑制HIF-1α基因的表達(dá)，來協(xié)調(diào)其下游的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)［8］。HIF-1α在正常組織中不表達(dá)，而在肺癌、宮頸癌、乳腺癌等腫瘤組織中過度表達(dá)［9-11］。本實(shí)驗(yàn)研究中，western blot結(jié)果顯示不同濃度的川芎嗪對(duì)HIF-1α有一定的抑制作用，而RT-PCR實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)，提示川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的抑制作用可能與HIF-1α表達(dá)有關(guān)。

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的血管生成因子，存在于人體的各個(gè)器官組織，在缺氧環(huán)境下，癌基因和抑癌基因會(huì)對(duì)VEGF進(jìn)行調(diào)節(jié)，增加VEGF表達(dá)［12］。目前報(bào)道，正常組織中VEGFmRNA表現(xiàn)為陰性，而在惡性腫瘤組織中則表達(dá)為陽性。而VEGF是HIF-1α分子介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生過程中密切相關(guān)的基因之一，是HIF-1α最重要的靶基因，HIF-1α高表達(dá)時(shí)會(huì)上調(diào)VEGF基因的表達(dá)，因?yàn)镠IF-1是VEGF的主要刺激因子。VEGF會(huì)導(dǎo)致血管通透性增強(qiáng)，加快腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的進(jìn)程，另外腫瘤細(xì)胞也可以通過合成、分泌VEGF，再反過來促進(jìn)腫瘤血管的生長［13］。血管生成推動(dòng)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為腫瘤細(xì)胞的增長創(chuàng)造了有利條件，加速腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等［14-15］。川芎嗪等活血藥能降低腫瘤的微血管密度，抑制腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)，對(duì)腫瘤血管的生成產(chǎn)生一定的抑制作用。HIF-1α是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要標(biāo)記物，而VEGF是其重要的靶基因，因此準(zhǔn)確檢測HIF-1α、VEGF將對(duì)肺癌的臨床工作具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA實(shí)驗(yàn)檢測，顯示不同濃度的川芎嗪均抑制PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的VEGF的表達(dá)，RT-PCR結(jié)果顯示川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的VEGF mRNA的表達(dá)也有作用，推測其作用機(jī)制可能是通過抑制HIF-1α基因的表達(dá)，進(jìn)一步抑制VEGF的表達(dá)。

ABCG2是三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)家族的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要存在于細(xì)胞膜上，在維持機(jī)體正常生理功能和細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用，其在正常人胚胎干細(xì)胞中并不表達(dá)，而對(duì)腫瘤則會(huì)導(dǎo)致其耐藥，它的過度表達(dá)與腫瘤密切相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物［16］。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過ATP水解釋放能量來使細(xì)胞中的能量、代謝物、藥物等物質(zhì)逆濃度梯度滲出洗胞外面，而川芎嗪具有阻滯Ca2+活性的功能，可能通過抑制ATP依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)來起到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用［17］。本實(shí)驗(yàn)研究以ABCG2蛋白作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，觀察川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的作用，western blot檢測結(jié)果顯示不同濃度的川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的ABCG2表達(dá)均有一定的抑制作用，進(jìn)一步經(jīng)PT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可明顯抑制ABCG2 mRNA的表達(dá)，western blot與PT-PCR的結(jié)果基本一致。川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的殺傷作用可能是通過抑制ABCG2蛋白在mRNA水平上的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

本研究結(jié)果顯示，無血清培養(yǎng)法可以有效聚集PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞，相對(duì)于原代細(xì)胞而言，PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的HIF-1α、VEGF表達(dá)均上調(diào)，具有更強(qiáng)的促血管生成能力，其表面高表達(dá)ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，比普通細(xì)胞的耐藥性更強(qiáng)。表明川芎嗪對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞HIF-1α、VEGF、ABCG2表達(dá)在某種程度上有一定抑制作用。

腫瘤干細(xì)胞是引起腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)的根本原因，近年來對(duì)干細(xì)胞的研究越來越多越來越深。中醫(yī)藥是我國的瑰寶，有效的運(yùn)用中醫(yī)藥來調(diào)控治療腫瘤是一種好的治療方法。而在研究肺癌干細(xì)胞的領(lǐng)域中，還有許多問題亟待解決，需要廣大學(xué)者的積極努力探索。