楊少東，曾春賢，張志尚，張進(jìn)華，李小娟，廖星海，溫志強(qiáng)，鄭清友

（南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院，深圳 518000）

隨著我國老年化的加劇和檢測技術(shù)的提高，近年來我國前列腺癌患者發(fā)病人數(shù)呈上升趨勢，在男性腫瘤中的比例逐年升高，已上升至泌尿系腫瘤的首位。目前前列腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此對前列腺癌的研究意義重大。相關(guān)的研究表明，前列腺癌的發(fā)生和預(yù)后與雄性激素和前列腺中雄性激素受體之間的相互作用關(guān)系密切［1］。因此，我們一直在探索雄性激素及其受體相互作用的機(jī)制及其影響因素，以便更進(jìn)一步了解前列腺癌的發(fā)病機(jī)制。P21活化激酶6（p21-activated kinase 6，PAK6）能夠與雄激素受體結(jié)合從而影響細(xì)胞信號的傳遞和細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)通過檢測和比較前列腺癌和前列腺增生組織中PAK6蛋白的表達(dá)情況，并比較不同臨床分期前列腺癌PAK6蛋白的表達(dá)情況，探討前列腺癌細(xì)胞的增殖程度與PAK6蛋白表達(dá)的關(guān)系，以及PAK6蛋白與前列腺癌局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2015年6月～2020年2月本院確診和治療的前列腺癌和前列腺增生患者共88例，其中42例前列腺癌患者（觀察組），均在我院行經(jīng)直腸前列腺癌穿刺活檢術(shù)或前列腺癌根治術(shù)，術(shù)后病理結(jié)果為前列腺腺癌，排除前列腺其他類型腫瘤及良性腫瘤；46例前列腺增生患者（對照組），術(shù)后病理結(jié)果均為良性前列腺增生，排除不典型增生病例。在42例前列腺癌患者中，均完善盆腔MR、腹部CT、骨掃描等影像學(xué)檢查，其中臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者有20例，Ⅰ-Ⅱ期的患者有22例。本研究兩組對比患者年齡、病程、合并基礎(chǔ)疾病等基線資料對研究結(jié)果無不良影響，具有可行性。前列腺癌臨床分期Ⅲ-Ⅳ期患者是指T3及T3以上分期或存在局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者［2］，其余患者為Ⅰ-Ⅱ期患者，如表1。

表1 前列腺癌臨床分期［2］

1. 2 標(biāo)本來源收集南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院病理科2015～2020年前列腺增生和前列腺癌石蠟組織標(biāo)本共88例，新鮮切片后采用隨機(jī)代碼標(biāo)識，閱片者不知患者具體臨床信息。

1. 3 主要試劑兔抗PAK6多克隆抗體、一抗抗體稀釋液、酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、DAB顯色劑（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，北京）。

1. 4 免疫組織化學(xué)

1. 4. 1 所用標(biāo)本組織均經(jīng)手術(shù)獲得采用10%福爾馬林固定，常規(guī)取材，石蠟包埋后4μm 連續(xù)切片，其中第一和第三張玻片行HE染色確認(rèn)存在前列腺癌細(xì)胞，取第二張玻片依次進(jìn)行常規(guī)脫蠟水化，高溫修復(fù)抗原，滴加兔抗PAK6多克隆抗體（1：200）或磷酸鹽緩沖液（空白對照劑），滴加酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，滴加顯色劑（聯(lián)苯二胺），蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。

1. 4. 2 結(jié)果判斷PAK6蛋白陽性定位主要在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為黃色或者棕黃色顆粒即為陽性表達(dá)。判斷其表達(dá)結(jié)果采用半定量積分法［3］，即根據(jù)顯色的強(qiáng)度和陽性細(xì)胞的比例情況作為最終判定結(jié)果，如表2。兩者相加積分≤1分為陰性（-）；2分為陽性（+）；3～4分為中度陽性（++）；＞ 4 分為強(qiáng)陽性（+++）。

表2 免疫組化半定量積分法

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。對細(xì)胞陽性表達(dá)率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，對陽性表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時，表示差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 PAK6前列腺增生在和前列腺癌組織中的表達(dá)46 例的標(biāo)本中PAK6 表達(dá)陰性共有14例，陽性共有32例，陽性率為69.57%（32/46）；42例PCa 中PAK6表達(dá)陰性共有3例，陽性共有39例，陽性率為92.86%（39/42）。PAK6在前列腺癌組織的表達(dá)陽性率比前列腺增生組織高，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），前列腺癌組織的表達(dá)強(qiáng)度比前列腺增生組織明顯增強(qiáng)（P<0.05），見表3，圖 1。

表3 PAK6在各組組織中的表達(dá)（n）

圖1 PAK6在前列腺增生及不同臨床分期PCa 組織中的表達(dá)

2. 2 PAK6 在不同臨床分期前列腺癌組織中的表達(dá)臨床Ⅲ-Ⅳ期患者PAK6表達(dá)陰性1例，陽性的19例，陽性率98%（19/20）；Ⅰ-Ⅱ期PAK6表達(dá)陰性2例，陽性共20例，表達(dá)陽性率90.91%（20/22），兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05。但臨床Ⅲ-Ⅳ期的表達(dá)強(qiáng)度比Ⅰ-Ⅱ期明顯增強(qiáng)，兩者比較差異顯著（P<0.01）見表4，圖1。臨床Ⅰ和Ⅱ期組間以及臨床Ⅲ和Ⅳ期組間的PAK6表達(dá)陽性率和表達(dá)強(qiáng)度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

表4 PAK6在前列腺癌（Ⅰ-Ⅱ期）和前列腺癌（Ⅲ-Ⅳ期）組織中的表達(dá)（n）

3 討論

早期前列腺癌患者目前首選的治療方法是根治性前列腺切除術(shù)，而晚期患者一般失去根治性手術(shù)機(jī)會，常用的治療方法是去勢治療和（或）抗雄治療、化學(xué)治療、局部放療等。一般經(jīng)過一段時間（約12-18個月）的內(nèi)分泌去勢治療后，常常成為去勢抵抗性前列腺癌（Castration-resistant prostate cancer，CRPC），其中的機(jī)制和原理尚不明確，但基于去勢治療早期良好的抗癌效果，如果能夠研究清楚雄激素及其受體在前列腺癌中的作用以及后期去勢抵抗的產(chǎn)生機(jī)制，想必對我們治療前列腺癌將會有很大的幫助。p21活化蛋白激酶（PAK）是一類進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［4］，目前主要有 6 個家族成員（PAK1～6）［5］，它們都具有相似的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)［6］，但功能上有所不同，在細(xì)胞的存活和調(diào)節(jié)以及腫瘤的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移上具有重要的作用［7］。PAK6是雄激素受體相關(guān)蛋白，可與雄激素受體的配體結(jié)合域上的氨基酸序列結(jié)合［8］，從而阻止雄激素受體向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄［9］。Liu T等人研究發(fā)現(xiàn) PAK6通過削弱核移位和促進(jìn) e3連接酶 mdm2通過泛素-蛋白酶體途徑降解而抑制前列腺癌的發(fā)生［10］。本研究88例組織標(biāo)本中共有71例陽性表達(dá)，其中前列腺增生組織標(biāo)本陽性率69.57%，PCa標(biāo)本為92.86%，PCa 的表達(dá)陽性率及表達(dá)強(qiáng)度明顯高于前列腺增生組織，兩者均有顯著性差異，這與黃新敏等人研究發(fā)現(xiàn)相似［11］。前列腺癌的預(yù)后與臨床分期和腫瘤gleason評分相關(guān)，因此我們仔細(xì)的分析PAK6表達(dá)在腫瘤的不同臨床分期之間的差異.免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，在PCa 組織中PAK6 表達(dá)中，臨床Ⅲ-Ⅳ期和Ⅰ-Ⅱ期的患者中其PCa組織PAK6 陽表達(dá)率無明顯差異，這可能是與我們的樣本數(shù)量較少有關(guān)，但臨床Ⅲ-Ⅳ期的PAK6表達(dá)強(qiáng)度明顯比臨床Ⅰ-Ⅱ高。PAK6在正常的前列腺上皮細(xì)胞表達(dá)較弱［12］，因此似乎存在這樣的關(guān)系，PAK6的表達(dá)程度從正常前列腺組織、前列腺增生、前列腺癌中呈遞增趨勢。正常前列腺組織的細(xì)胞中增殖的速度最慢，細(xì)胞分裂較少；前列腺增生細(xì)胞增殖速度及細(xì)胞分裂情況次之；前列腺癌細(xì)胞增生速度最快、細(xì)胞分裂最多。這樣提示在前列腺組織中PAK6的表達(dá)程度與細(xì)胞的增殖程度存在正相關(guān)性。但是還是不能由此得出PAK6促使細(xì)胞的增殖或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，正如Liu T等人研究發(fā)現(xiàn)，剔除PAK6基因反而使腫瘤惡化程度加劇，腫瘤增殖速度加快［10］。PAK6在前列腺細(xì)胞增殖中的作用機(jī)理還需要進(jìn)一步研究和明確。臨床Ⅲ-Ⅳ期的患者是指存在腫瘤局部侵襲或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況，我們研究表明Ⅲ-Ⅳ期的前列腺癌組織中PAK6的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于臨床Ⅰ-Ⅱ期的前列腺癌組織，結(jié)果提示PAK6可能參與了前列腺癌細(xì)胞的局部侵襲或轉(zhuǎn)移。有相關(guān)研究表明雄性激素與其受體結(jié)合后可刺激PAK6發(fā)生自激活，磷酸化相應(yīng)的絲氨酸和蘇氨酸，在前列腺癌細(xì)胞的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中起到促進(jìn)作用［13-14］。Al-Azayzih等報(bào)道，在前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)移中，mi R-23A-PAK6-LIMK1途徑參與其中并起到重要的作用。通過抑制mi R-23A可以使絲切蛋白的磷酸化減弱，導(dǎo)致肌動蛋白受抑制，從而影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［15-16］。目前尚不能排除隨著前列腺腫瘤細(xì)胞惡性程度的加劇，導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞的PAK6蛋白表達(dá)的強(qiáng)度反應(yīng)性增多的可能。PAK6蛋白在前列腺腫瘤細(xì)胞的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚未完全明確，有待更深入地研究和討論。在臨床研究中，臨床分期與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，分期越高，預(yù)后越差。PAK6在前列腺癌不同分期的表達(dá)不同，一定程度上可作為前列腺癌患者預(yù)后的參考指標(biāo)。在本次實(shí)驗(yàn)中88例標(biāo)本中，PAK6的強(qiáng)陽性表達(dá)共11例，其中前列腺癌占81.82%，明顯高于前列腺增生，可能提示PAK6的強(qiáng)陽性表達(dá)對前列腺癌的診斷有一定的參考意義。本研究前列腺癌不同臨床分期的病例數(shù)不多，可能存在偏倚。王新敏13］等人發(fā)現(xiàn)在低分化前列腺癌中PAK6的表達(dá)明顯比高分化前列腺癌組織增加，分析原因可能是低分化前列腺癌細(xì)胞的惡性程度較高，細(xì)胞增殖明顯，機(jī)體反應(yīng)性的增加PAK6的分泌水平，更多的與被雄性激素激活的雄性激素受體相結(jié)合，從而抑制相應(yīng)基因表達(dá)及細(xì)胞增殖。在影響前列腺癌預(yù)后的病理分級和臨床分期這兩個因素中，腫瘤細(xì)胞分化級別和臨床分期越大，腫瘤的惡性程度越高，細(xì)胞增殖越明顯，則前列腺癌細(xì)胞的PAK6表達(dá)就越多，預(yù)后越差。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，我們推想PAK6可能在機(jī)體平衡抑制細(xì)胞增殖的過程起重要的調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞增殖越明顯，就需要更多的PAK6蛋白來抑制或者修正，從而起到抑制細(xì)胞增殖的作用。但是正如臨床結(jié)果所示，PAK6的反應(yīng)性增多并不能有效地阻斷前列腺增生或前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展，單靠機(jī)體自身的調(diào)節(jié)或者反饋，無法有效的抑制癌細(xì)胞的增殖發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，PAK6蛋白在前列腺癌組織中有明顯的表達(dá)，與臨床分期有一定的相關(guān)性，可能與前列腺癌的局部浸潤或轉(zhuǎn)移有關(guān)；PAK6在前列腺癌的表達(dá)可為臨床研究、診斷及預(yù)后預(yù)測提供新的思路。