瞿利花，陳陽曄，李 懿，何 煒，張 冉，申 麗

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013；2. 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，長沙 410013）

急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）由內(nèi)、外因素，嚴(yán)重的感染、休克、創(chuàng)傷和誤吸等誘因引起，臨床表現(xiàn)為呼吸困難和低氧血癥［1］。ALI特征為肺泡-毛細(xì)血管破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤，促炎因子和細(xì)胞毒性介質(zhì)釋放。ALI最終發(fā)展成呼吸衰竭和全身多器官功能衰竭而致死亡［2］。ALI 的死亡率為 40%-50%［3］。ALI 的早期治療對預(yù)防疾病的惡化非常重要。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）又名內(nèi)毒素，它能誘導(dǎo)機體感染，已被廣泛應(yīng)用于研究 ALI 的模型中［4］。目前臨床上常用的治療 ALI 的藥物大多為抗生素和糖皮質(zhì)激素類，易產(chǎn)生耐藥性和副作用大等問題，因此有效的藥物，對于預(yù)防和治療 ALI十分必要。

甘草酸（Glycyrrhizic acid，GA）是甘草中的主要活性成分之一，是一種五環(huán)三萜系列皂苷，五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)具有抗感染和抗病毒等作用且不良反應(yīng)少［5-6］。臨床上通常把甘草制劑用來治療病毒性肝炎等［7］，而它在預(yù)防和治療 ALI 方面的應(yīng)用很少。因此，研究 GA 在 ALI中的保護機制，可以為甘草這種物美價廉的中草藥，在急性肺損傷疾病的推廣應(yīng)用中奠定基礎(chǔ)。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2（Angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的同工酶，在2000 年被單獨克隆出來［8］。ACE2 可以切割 Ang I以產(chǎn)生無活性的 Ang-（1-9）肽，然后 ACE 或中性內(nèi)肽酶（NEP）將其轉(zhuǎn)化為血管舒張肽 Ang-（1-7），它能拮抗血管緊張素 II（Ang-II）引起的細(xì)胞損傷［9］。Ang-II 在ALI 過程中能引起炎癥反應(yīng)，它能被ACE2 降解。ACE2的缺失，導(dǎo)致由 Ang II 誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞在主動脈的表達顯著增加，加重血管炎癥［10］。然而，GA 是否可以通過調(diào)節(jié)ACE2 來影響 ALI 的進展尚無報道。本研究旨在探討 GA 對 LPS 誘導(dǎo)的 ALI 模型的保護并初步闡明GA 發(fā)揮作用的具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑甘草酸購自上海TCI 化成發(fā)展有限公司；LPS購自美國 Sigma 公司；ACE2多克隆抗體購自武漢三鷹生物公司；IHRP 標(biāo)記山羊抗兔 IgG購自武漢塞維爾生物公司。

1.2 實驗動物分組60 只小鼠隨機分 4 組：（1）對照組（Ctrl 組）；（2）GA 組 ：GA（200 mg/kg）；（3）LPS 組 ：LPS（10 mg/kg）；（4）GA+LPS 組 ：GA（200 mg/kg）1 h 后 LPS 給藥（10 mg/kg），所有的藥物都是腹腔注射。8 h 后取肺組織并稱量肺濕重（g），樣本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肺系數(shù)肺系數(shù)=（肺濕重體重比，Lung Coefficient）：是一項動物實驗的測量指標(biāo)，通常用來評估肺水腫程度，肺濕重（g）/體重（kg）×100%。取出小鼠全肺后，剔除多余組織、去除血跡，稱重（g），計算肺系數(shù)。

1.4 HE染色和免疫組化肺組織切片HE 染色，按照常規(guī)烤片-脫蠟-至水-染色-脫水-透明-封片進行。 肺組織免疫組化經(jīng)石蠟切片脫蠟后用EDTA進行抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。用BSA封閉2 h后，滴加稀釋好的一抗，4℃過夜。滴加二抗，室溫孵育1 h，滴加DAB顯色液，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，脫水封片，顯微鏡觀察。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達肺組織蛋白SDS-PAGE凝膠電泳；蛋白條帶轉(zhuǎn)移到甲醇浸泡活化后的PVDF膜上，5%的脫脂牛奶室溫封閉 1 h；加入一抗4℃冰箱孵育15～18 h；PBS洗滌后常溫孵育二抗 1 h；用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液，顯影成像。用Image J測定各條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析使用 SPSS 16.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)，用 One-way ANOVA 單因素方差分析檢驗，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。雙側(cè)P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GA對肺組織形態(tài)學(xué)的影響LPS處理后小鼠肺系數(shù)明顯升高（P<0.05）；GA給藥后組肺系數(shù)明顯低于LPS組（P<0.05，圖1A）。HE染色結(jié)果顯示：Ctrl 組肺泡組織結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)未見炎性細(xì)胞。LPS組肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤。而GA+LPS 組肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤明顯減少（圖1B）。

圖1 GA 對肺組織形態(tài)學(xué)的影響 A：肺系數(shù)，與Ctrl組相比***P<0.001；與LPS相比##P<0.01；B：小鼠肺組織病理變化（HE×200）。

2.2 GA 對肺組織 ACE2 的影響Western blotting和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，LPS 能下調(diào)ACE2的表達（P<0.05）；與LPS組相比，GA 處理后能顯著上調(diào) ACE2 的表達（P<0.05，圖2）。

圖 2 GA 對肺組織 ACE2 的影響 A ：與Ctrl組相比，*P<0.05 ；與LPS相比，#P<0.05 ；B ：肺組織免疫組化ACE2 蛋白的表達（×200）。

3 討論

在 ALI的發(fā)展過程中肺泡－毛細(xì)血管破壞，炎性細(xì)胞不斷聚集，導(dǎo)致了持續(xù)進展性的肺部炎癥［11-13］。當(dāng)這些癥狀無法得到有效緩解與控制時，往往發(fā)展為呼吸衰竭最終導(dǎo)致患者死亡。 目前的藥物治療仍舊無法滿足患者的需要，這也是 ALI 死亡率較高的主要原因。因此，尋找影響 ALI 發(fā)生發(fā)展中的特異性靶分子意義重大。

GA能發(fā)揮多種生物學(xué)功能。研究表明，GA能夠抑制角叉萊膠誘導(dǎo)的胸膜炎與支氣管肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞的浸潤［14］；也有研究發(fā)現(xiàn) GA 具有顯著的抗SARS 病毒作用［15］。這些研究提示，GA可能作為一種有效的藥物，用于肺部疾病的治療。我們的實驗研究結(jié)果表明，GA 治療后明顯緩解小鼠肺組織水腫和炎性細(xì)胞浸潤。由此我們發(fā)現(xiàn)GA 對肺組織具有保護作用，能夠緩解 LPS導(dǎo)致的ALI。

ACE2在ALI中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮 IIA 能夠上調(diào) ACE2 的表達，進而緩解百草枯誘導(dǎo)的ALI［16］。此外，脂氧素 A4 也可通過活化 ACE2-Ang（1-7）-Mas 信號改善 LPS 誘導(dǎo)的 ALI［17］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，GA 能夠緩解 LPS 引起的 ACE2 表達減少，由此提示，GA 對 ALI 的保護作用可能是通過上調(diào) ACE2 來實現(xiàn)的。

本研究通過LPS誘導(dǎo)的ALI的小鼠模型，小鼠肺組織出現(xiàn)明顯肺損傷，肺組織ACE2表達下調(diào)；GA處理后減輕肺損傷，肺組織ACE2水平上調(diào)，說明GA能明顯減輕LPS誘導(dǎo)的ALI的損傷程度，其機制可能與ACE2 激活有關(guān)。然而ALI發(fā)病機制復(fù)雜，GA治療ALI的具體作用機制仍需進一步探究。