章烈，王向陽，王輝

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 胃腸外科 ，湖北 武漢 430014）

胃癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，每年約951 600例新發(fā)和723 100例死亡病例[1]。胃癌治療方法包括手術(shù)、放化療和生物治療等，但其高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點是導(dǎo)致患者生存率較低的主要原因[2-3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNA）是一類RNA分子，長度約200 nt，參與細(xì)胞增殖和凋亡、周期控制、細(xì)胞發(fā)育和分化等生物學(xué)過程[4-5]。lncRNA失調(diào)與人類多種疾病密切相關(guān)[6]。lncRNA RAB1A-2（RAB1A-2）最早在小鼠胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)和鑒定[7]，定位于染色體2p14，是一種mTORC1激活劑，其與肺癌細(xì)胞DNA異常擴(kuò)增和細(xì)胞增殖及侵襲密切相關(guān)[8]。然而，RAB1A-2在胃癌中的表達(dá)及作用尚未見報道，本研究旨在探討胃癌患者中RAB1A-2的表達(dá)及作用。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

本研究收集在武漢市中心醫(yī)院胃腸外科行胃癌切除術(shù)的胃癌患者組織標(biāo)本68例?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 經(jīng)病理確診為胃腺癌；(2) 胃癌的治療按NCCN指南標(biāo)準(zhǔn)治療；(3)患者不存在除胃癌之外其他惡性腫瘤；(4) 患者具有完整的隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)者。根據(jù)國際癌癥控制聯(lián)盟（UICC）和美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）胃癌TNM分期系統(tǒng)推薦的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分類系統(tǒng)（第8版）[9]對病理切片進(jìn)行再評估以達(dá)到準(zhǔn)確分期目的。收集組織樣品并在液氮中快速冷凍并儲存在-80 ℃直至分析。本研究征得醫(yī)院倫理委員會同意實施。

1.2 患者臨床資料收集和隨訪

采集患者年齡、性別、腫瘤大小等臨床資料?？偵鏁r間定義為術(shù)后至隨訪結(jié)束或死亡時間。經(jīng)門診或電話方式隨訪，每半年隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括患者生存情況，共2例失訪。

1.3 主要實驗儀器和試劑

3種人胃癌細(xì)胞系（SGC-7901、MKN-45和BGC-823）和正常胃黏膜細(xì)胞系（GES-1）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海）。RABA-2 沉默序列（si-RAB1A-2）、RAB1A-2過表達(dá)序列（mimic-RAB1A-2）和陰性對照序列（si-NC）由上海吉瑪生物公司合成。MTT試劑盒購于美國Invitrogen公司、細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640購于美國Gibco 公司，LipofectamineTM3000購于美國Invitrogen 公司，qPCR引物由廣州銳博生物公司設(shè)計并合成。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組培養(yǎng)基為含10% 胎牛血清的Eagle 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為：37 ℃、含5%CO2，取對數(shù)期生長良好的SGC-7901 細(xì)胞系在六孔板上生長至匯合時用LipofectamineTM3000 將si-RAB1A-2（RAB1A-2 干擾組）、RAB1A-2 模擬物（RAB1A-2 模擬物組）和陰性對照序列（陰性對照組）分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h 收獲細(xì)胞，采用qRT-PCR 檢測確定轉(zhuǎn)染效率。

1.4.2 細(xì)胞增殖和凋亡檢測采用MTT 試劑盒測定細(xì)胞增殖能力，于450 nm 處測定每孔吸光度，細(xì)胞活力=（OD 樣本/OD 對照）×100。根據(jù)制造商方案，使用膜聯(lián)蛋白-V-Fluos（Annexin-VFluos）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.4.3 Transwell 實驗將3 組細(xì)胞分別種植于Transwell 小室的上部室中，采用無血清培養(yǎng)基200 μL 孵育，下室填充采用含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基600 μL，待24 h 后，采用多聚甲醛固定細(xì)胞，用0.1% 結(jié)晶紫染色，在400× 顯微鏡下，取10 個視野計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)并計算平均值。

1.4.4 實 時 定 量RT-PCR（qRT-PCR）按RNA 試劑提取說明書提取組織和細(xì)胞總RNA 后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在ABI-7500 平臺上采用SYBR Premix Ex Taq TM II 試劑盒行PCR 擴(kuò)增，GAPDH作為內(nèi)參。qRT-PCR 引物序列如下：RAB1A-2 序列：正向：5'-GCT AGT TGG ACT GGA GAT TTG G-3'， 反向：5'-TTA TTA CCA CAG GAG GGA GCA C-3'；GAPDH 序列：正向：5'-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3'， 反向：5'-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3'。 擴(kuò)增條件是：95 ℃5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后行熔解曲線分析，采用 2-ΔΔCt法計算細(xì)胞系及組織中RAB1A-2 相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RAB1A-2 在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，胃癌組織中RAB1A-2相對表達(dá)量高于癌旁組織（P＜0.05）（圖1A）。3種胃癌細(xì)胞系（MKN-45、BGC-823和SGC-7901）中RAB1A-2相對表達(dá)量高于正常胃黏膜細(xì)胞系GES-1（均P＜0.05）（圖1B）。

2.2 RAB1A-2 的表達(dá)與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系

以6 8例胃癌組織RABA-2 表達(dá)的中位值為界，將患者分為AB1A-2 高表達(dá)組（34例）和RAB1A-2低表達(dá)組（34例）。RAB1A-2表達(dá)與腫瘤大小、T分類、N分類和TNM分期明顯有關(guān)（均P＜0.05），而與年齡、性別、分化程度無明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表1）。

圖1 qRT-PCR 檢測RAB1A-2 表達(dá) A：RAB1A-2 在胃癌組織與癌旁組織中的表達(dá)；B：RAB1A-2 在胃癌細(xì)胞系與胃黏膜細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 1 RAB1A-2 expression determined by qRT-PCR A: The expressions of RAB1A-2 in gastric cancer tissue and adjacent tissue; B: The expressions of RAB1A-2 in gastric cancer cell lines and normal gastric mucosa cell line

表1 RAB1A-2 的表達(dá)與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系 [n（%）]Table 1 Relations of RAB1A-2 expression with clinicopathologic factors of gastric cancer patients [n (%)]

2.3 RAB1A-2 的表達(dá)與胃癌患者總生存率的關(guān)系

生存分析結(jié)果顯示，RAB1A-2高表達(dá)組3年總生存率為63.2%，RAB1A-2低表達(dá)組3年總生存率為87.5%，RAB1A-2高表達(dá)組3年總生存率低于RAB1A-2低表達(dá)組（P＜0.001）；RAB1A-2高表達(dá)組5年總生存率為27.5%，RAB1A-2低表達(dá)組5年總生存率為68.2%，RAB1A-2高表達(dá)組5年總生存率低于RAB1A-2低表達(dá)組（P＜0.001）（圖2）。

圖2 RAB1A-2 高低表達(dá)組患者總生存曲線Figure 2 The overall survival curves of the patients with high and low RAB1A-2 expression

2.4 轉(zhuǎn)染效率檢測

RAB1A-2模擬物組RAB1A-2相對表達(dá)量高于陰性對照組，RAB1A-2干擾組RAB1A-2相對表達(dá)量低于陰性對照組（均P＜0.01）（圖3），提示轉(zhuǎn)染效果可，可行下一步試驗。

2.5 RAB1A-2 對胃癌細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果示：RAB1A-2模擬物組A450nm值高于陰性對照組（P＜0.0 1）；RAB1A-2干擾組 A450nm值低于陰性對照組（P＜0.01）（圖4）。

圖3 qRT-PCR 測定轉(zhuǎn)染效率Figure 3 Transfection efficiency determination by qRT-PCR

2.6 RAB1A-2 對胃癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，陰性對照組細(xì)胞凋亡率為（8.3±0.8）%，RAB1A-2模擬物組細(xì)胞凋亡率為（5.2±0.6）%，RAB1A-2干擾組細(xì)胞凋亡率為（15.4±2.4）%；RAB1A-2模擬物組細(xì)胞凋亡率低于陰性對照組，RAB1A-2干擾組細(xì)胞凋亡率高于陰性對照組（均P＜0.01）（圖5）。

圖4 各組細(xì)胞的增殖曲線Figure 4 The proliferation curve of each group of cells

2.7 RAB1A-2 對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，RAB1A-2模擬物組侵襲細(xì)胞數(shù)多于陰性對照組[（80±13）個vs.（45±8）個，P＜0.01]；RAB1A-2干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)少于陰性對照組[（20±4）個vs.（45±8）個，P＜0.01]（圖6）。

圖5 RAB1A-2 對胃癌細(xì)胞凋亡的影響 A：流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；B：細(xì)胞凋亡率比較Figure 5 The effect of RAB1A-2 on apoptosis of gastric cancer cells A: Flow cytometry analysis; B: Comparison of apoptosis rates

圖6 RAB1A-2 對胃癌細(xì)胞侵襲 A：Transwell 實驗結(jié)果；B：侵襲細(xì)胞數(shù)比較Figure 6 Effect of RAB1A-2 on invasion of gastric cancer cells A: Transwell assay; B: Comparison of numbers of invading cells

3 討 論

在我國，胃癌是高發(fā)腫瘤，致癌因素包括飲食結(jié)構(gòu)的改變、工作壓力增大及幽門螺桿菌感染等。胃癌患者預(yù)后較差，嚴(yán)重危及我國人民健康[10]。癌癥發(fā)生和發(fā)展是多分子參與的多步驟過程，深入研究胃癌發(fā)病的分子機制對胃癌治療尤為重要[11-12]。文獻(xiàn)報道許多miRNA及l(fā)ncRNA參與了胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移過程[13-14]，是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)分子[15-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織及細(xì)胞系中RAB1A-2表達(dá)量高于胃癌旁組織及細(xì)胞系，提示RAB1A-2可能參與胃癌進(jìn)展。文獻(xiàn)[17]報道在非小細(xì)胞肺癌中，RAB1A-2表達(dá)顯著上調(diào)，這與上述報道存在一致性，提示RAB1A-2為潛在的腫瘤促進(jìn)因子。RAB1A-2高表達(dá)與胃癌患者腫瘤大小、T分類、N分類及TNM分期均顯著相關(guān)，提示RAB1A-2高表達(dá)代表著腫瘤惡性程度較高的表型，參與胃癌進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)RAB1A-2 高表達(dá)組患者術(shù)后總生存率低于RAB1A-2低表達(dá)組患者，提示lncRAB1A-2與患者預(yù)后不良相關(guān)。

lncRNA是胃癌發(fā)生和進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)分子[18-19]，多個lncRNA參與胃癌發(fā)生和進(jìn)展，且與胃癌預(yù)后相關(guān)。長鏈非編碼RNA 如OXA11-AS[20]和HOTAIR[21]均參與胃癌發(fā)生和進(jìn)展，在胃癌組織中表達(dá)異常，且與胃癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)，而最近研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1是胃癌的分子標(biāo)志物[22]。體外功能研究中，通過干擾RNA分別沉默和上調(diào)胃癌細(xì)胞系中RAB1A-2表達(dá)，結(jié)果顯示RAB1A-2高表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。在胃癌細(xì)胞系中，多個不同的長鏈非編碼RNA可影響癌細(xì)胞增殖和侵襲，比如lncRNA PVT1即可在體外抑制胃癌細(xì)胞系的凋亡[23]。研究顯示RAB1A-2高表達(dá)在小鼠胚胎發(fā)育過程中可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA組裝和細(xì)胞分裂異常[8,24]，促進(jìn)細(xì)胞不受控增殖。上述研究結(jié)果也提示RAB1A-2過表達(dá)通過促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲并抑制凋亡而導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不佳。

成纖維細(xì)胞生長因子1 是成纖維細(xì)胞生長因子家族成員之一，其在細(xì)胞增殖、生存、遷移、侵襲、分化及血管生成中起重要作用[25]。研究表明低濃度得成纖維細(xì)胞生長因子1可促進(jìn)腫瘤新生血管形成[26]，并有抗凋亡作用。成纖維細(xì)胞生長因子1激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，可促進(jìn)腫瘤發(fā)生和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[27]。在卵巢癌中[28]，成纖維細(xì)胞生長因子1上調(diào)表達(dá)促進(jìn)腫瘤新生血管形成，并與預(yù)后不良相關(guān)。在肺癌[17]中，RAB1A-2可能通過影響成纖維細(xì)胞生長因子1表達(dá)，調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路，進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞增殖。在胃癌中，RAB1A-2是否也通過此信號通路影響胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲，值得進(jìn)一步研究，此外本研究存在如下不足：(1) 納入病例數(shù)目較少，尚未分析胃癌組織RAB1A-2表達(dá)對胃癌患者是否存在診斷價值；(2) 本研究尚未在模式動物中探討RAB1A-2表達(dá)與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織和細(xì)胞系中RAB1A-2表達(dá)上調(diào)，RAB1A-2高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的分子標(biāo)志物，體外實驗證實RAB1A-2高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲并抑制凋亡。RAB1A-2在胃癌中起促癌作用，可能是胃癌的潛在治療靶點。