朱振成，羅昆侖，謝偉選，祝夢(mèng)嬌，朱慶洲，柏楊，李福利，劉偉偉

（安徽醫(yī)科大學(xué)無(wú)錫臨床醫(yī)學(xué)院/中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 無(wú)錫 214044）

膽囊癌（gallbladder carcinoma，GBC）是預(yù)后極差的惡性疾病，發(fā)病率在胃腸道腫瘤中排名第五，病死率近年來(lái)逐年升高，5年生存率難以突破10%，探究快速、有效的預(yù)后指標(biāo)有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展，及時(shí)調(diào)整治療方案[1-3]。炎癥與GBC發(fā)生發(fā)展相關(guān)，已有多個(gè)研究報(bào)道外周血炎癥相關(guān)參數(shù)在評(píng)估GBC預(yù)后上存在價(jià)值，其中以中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞數(shù)比值（neutrophillymphocyte ratio，NLR）相關(guān)性最強(qiáng)[4-6]。近來(lái)有研究[7-8]報(bào)道術(shù)前/術(shù)后中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值（preoperative plus postoperative neutrophillymphocyte ratio，PP-NLR）與格拉斯哥預(yù)后評(píng)分（Glasgow prognostic score，GPS）在肝癌、胃癌等腫瘤中與患者生存相關(guān)，較單純的術(shù)前或術(shù)后NLR更為全面有效，但相關(guān)研究在GBC中較少。本研究旨在通過(guò)回顧性分析明確PP-NLR及GPS是否在預(yù)測(cè)GBC預(yù)后上存在價(jià)值，并分析比較其預(yù)測(cè)效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì) 第九〇四醫(yī)院自2005年1月—2015年12月收治并行手術(shù)治療的140例GBC患者臨床資料，電話(huà)隨訪其生存（截止2018年12月）。其中男49例，女91例；年齡36～85歲，中位年齡64歲，平均（62.9±10.7）歲。血型中A型53例，B型34例，AB型18例，O型35例。實(shí)驗(yàn)室檢查見(jiàn)術(shù)前白細(xì)胞（7.02±3.93）×109/L，術(shù)前CRP（4.90±22.60）g/L，術(shù)前白蛋白（39.19±5.48）m g/L，術(shù)前中性粒細(xì)胞（5.35±3.70）×109/L，術(shù)前淋巴細(xì)胞（1.46±0.58）×109/L，術(shù)后中性粒細(xì)胞（4.76±3.64）×109/L，術(shù)后淋巴細(xì)胞（1.59± 0.61）×109/L。腫瘤大?。?.97±2.20）cm。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 經(jīng)外科治療，術(shù)后病理確認(rèn)為GBC；(2) 具有完整的術(shù)前及術(shù)后（術(shù)前1周、術(shù)后1個(gè)月）的實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查資料；(3)術(shù)后規(guī)律隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 術(shù)后1個(gè)月內(nèi)或圍術(shù)期死亡； (2) 合并其他腫瘤病史；(3)術(shù)前1周或術(shù)后1個(gè)月合并感染性疾病（如肺部感染）或自身免疫性疾病[7]。

1.2 觀察指標(biāo)

一般資料：性別、年齡。病理學(xué)特征：腫瘤分化程度、腫瘤突破漿膜/侵犯肝臟、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。外周血參數(shù)：術(shù)前白細(xì)胞水平、術(shù)前CRP、術(shù)前及術(shù)后中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、術(shù)前血小板等。腫瘤標(biāo)志物：癌胚抗原（CEA）、CA19-9。預(yù)后情況：以患者總體生存期（OS）作為評(píng)價(jià)預(yù)后的指標(biāo)，定義為手術(shù)到患者死亡的時(shí)間，以月為單位。計(jì)算手術(shù)前后NLR：(1) 術(shù)前NLR定義為術(shù)前1周中性粒細(xì)胞絕對(duì)值與淋巴細(xì)胞絕對(duì)值之比[7]； (2) 術(shù)后NLR定義為術(shù)后1個(gè)月中性粒細(xì)胞絕對(duì)值與淋巴細(xì)胞絕對(duì)值之比[7]。

1.3 賦值

根據(jù)ROC曲線界值決定手術(shù)前后NLR界值，升高則分別賦值為1，反之則為0，PP-NLR定義為兩者賦值之和，分別為0、1、2[7]；將術(shù)前血清白蛋白＜35 g/L和術(shù)前CRP＞10 g/L分別賦值為1，否則為0，GPS定義為兩者賦值之和，分別為0、1、2[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。建立受試者工作曲線（ROC曲線）確定手術(shù)前后NLR界值。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)或方差分析（ANOVA）；偏態(tài)分布的定量資料用中位數(shù)±四分位間距表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)；定性資料通過(guò)χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)分析。通過(guò)Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異性對(duì)比；Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行多因素分析。通過(guò)Spearman相關(guān)性分析研究因素間相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ROC 曲線確定界值

分別取患者手術(shù)前后NLR值建立ROC曲線，敏感度和特異度最大值點(diǎn)為其界值，作為術(shù)前、術(shù)后NLR的界值。結(jié)果顯示術(shù)前NLR的界值為2.51，此時(shí)的敏感度為0.961，特異度為0.788（圖1A）；術(shù)后NLR的界值為2.38，此時(shí)的敏感度為0.745，特異度為0.712（圖1B）。

2.2 PP-NLR 及GPS 與患者生存之間的關(guān)系

納入研究的共1 4 0例G B C 術(shù)后患者中，至今存活有1 9例，1、2、3、5年生存率分別為5 5.0%、3 5.7%、2 2.1%、1 7.9%，平均生存期（24.2±23.6）個(gè)月，中位生存期12.0 個(gè)月（圖2 A）。PP-NLR=0、1、2 的3組患者1年生存率分別為97.6%、62.5%、16.9%；3年生存率分別為5 8.5%、1 7.5%、0%；5年生存率為4 1.5%、1 0.0%、0%，均顯示逐漸降低趨勢(shì)，Kaplan-Meier生存分析顯示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.0 5），生存曲線見(jiàn)各組間生存情況存在顯著差異（P＜0.05）（圖2B）。GPS=1和GPS=2的兩組患者生存曲線未見(jiàn)顯著差異，但GPS=0和GPS=1或2的兩組患者之間生存差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2C）。Kaplan-Meier生存分析顯示GPS=0和GPS=1+GPS=2兩組1年生存率分別為81.0%和23.5%；3年生存率分別為35.4%和4.9%；5年生存率為30.4%和1.6%，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2D）。

圖1 不同時(shí)期NLR 的ROC 曲線 A：術(shù)前NLR；B：術(shù)后NLRFigure 1 ROC curves of NLR in different time periods A: Preoperative NLR; B: Postoperative NLR

圖2 生存曲線分析 A：140例GBC 患者總體生存曲線；B：不同PP-NLR 值（PP-NLR=0、PP-NLR=1，PP-NLR=2）患者的生存曲線；C：不同GPS 值（GPS=0、GPS=1、GPS=2）GBC 患者的生存曲線；D：不同GPS 值（GPS=0、GPS=1 或2）患者生存曲線Figure 2 Survival curve analysis A: The overall survival curve of the 140 GBC patients; B: The survival curves of patients with different PP-NLR values (PP-NLR=0, PP-NLR=1, PP-NLR=2); C: The survival curves of patients with different GPS values (GPS=0, GPS=1, GPS=2); D: The survival curves of patients with different GPS values (GPS=0, GPS=1 or 2)

2.3 不同PP-NLR 分組下患者臨床資料對(duì)比

根據(jù)PP-NLR賦值分組的3組患者在性別、年齡、病理類(lèi)型、血小板、膽堿酯酶方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。在低根治率、原發(fā)灶突破漿膜/侵犯肝臟、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、低分化程度、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)模式、晚期腫瘤、黃疸、高白細(xì)胞水平、腫瘤指標(biāo)等方面差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表1）。

表1 不同PP-NLR 患者的臨床資料比較Table 1 Comparison of the clinical data of patients with different PP-NLR

2.4 不同GPS 分組下患者臨床資料對(duì)比

GPS=1和GPS=1+GPS=2兩組患者在性別、年齡、術(shù)前膽紅素水平、術(shù)前及術(shù)后淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CEA、LDH中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。 在低根治率、原發(fā)證突破漿膜/侵犯肝臟、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、低分化程度、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)模式、晚期腫瘤、高CRP水平、CA19-9等方面差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表2）。

表2 不同GPS 分組患者的臨床資料對(duì)比Table 2 Comparison of the clinical data of patients with different GPS

2.5 PP-NLR 及GPS 與病理特征之間的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析提示，PP-NLR 與GPS的升高與手術(shù)根治率和分化程度負(fù)相關(guān)，與原發(fā)灶突破漿膜/侵犯肝臟、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期、CEA及CA19-9正相關(guān)，且與腫瘤浸潤(rùn)型生長(zhǎng)的出現(xiàn)呈正相關(guān)（均P＜0.05）。此外，在根治率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、腫瘤分化程度與生長(zhǎng)模式、以及腫瘤標(biāo)志物CEA和CA19-9方面PP-NLR的相關(guān)性較GPS更強(qiáng)（表3）。

表3 PP-NLR 及GPS 與臨床病理特征之間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of PP-NLR and GPS with the clinicopathologic features

2.6 外周血炎癥相關(guān)指標(biāo)與病理特征對(duì)患者預(yù)后影響的單因素分析

單因素分析顯示PP-NLR、術(shù)前GPS、術(shù)前NLR、術(shù)后NLR、術(shù)前總膽紅素水平、術(shù)前CRP、術(shù)前白蛋白水平、術(shù)前血紅蛋白、術(shù)前CEA及CA19-9、腫瘤分化程度、原發(fā)灶突破漿膜/侵犯肝臟、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均會(huì)影響GBC術(shù)后生存；而年齡、性別、術(shù)前白細(xì)胞水平對(duì)預(yù)后的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表4-5）。

表4 140例GBC 患者外周血相關(guān)參數(shù)與總體生存的單因素分析Table 4 Univariate analysis of peripheral blood-related parameters and overall survival in the 140 GBC patients

表4 140例GBC 患者外周血相關(guān)參數(shù)與總體生存的單因素分析（續(xù)）Table 4 Univariate analysis of peripheral blood-related parameters and overall survival in the 140 GBC patients (continued)

表5 140例GBC 患者臨床病理因素對(duì)總體生存影響的單因素分析Table 5 Univariate analysis of the impact of clinicopathologic factors on overall survival in the 140 GBC patients

2.7 影響患者生存的Cox 多因素分析

Cox多因素分析結(jié)果顯示PP-NLR=1（HR=0.143，95% CI=0.079～0.261，P＜0.05）和PP-NLR=2（HR=0.357，95% CI=0.221～0.575，P＜0.05）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=3.278，95% CI= 2.063 ～5.209，P ＜0.0 5）、腫瘤分化程度（HR=2.329，95% CI=1.466～3.699，P＜0.05）為影響GBC術(shù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表6）。

表6 影響GBC 患者預(yù)后的外周血參數(shù)及病理特征的Cox 多因素分析Table 6 Cox multivariate analysis of peripheral blood parameters and pathological characteristics that affect the prognosis of patients with gallbladder cancer

3 討 論

GBC患者術(shù)后腫瘤病理特征及TNM分期常被用作評(píng)估預(yù)后和療效的重要因素，具有理論和實(shí)踐的依據(jù)。但在臨床實(shí)際工作中，很多情況下往往無(wú)法準(zhǔn)確分期，如術(shù)前、復(fù)發(fā)腫瘤和姑息性手術(shù)的患者等，為制定GBC患者手術(shù)及術(shù)后輔助治療方案帶來(lái)了不確定性。近年來(lái)隨著對(duì)炎癥、免疫微環(huán)境的研究不斷深入，GBC與炎癥、免疫之間的密切關(guān)系已經(jīng)廣泛被學(xué)者所認(rèn)可[10-16]。中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞是構(gòu)成免疫反應(yīng)的重要部分，在腫瘤形成后，外周血中性粒細(xì)胞會(huì)在趨化因子的作用下聚集在腫瘤組織中，轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophils，TANs），通過(guò)分泌彈性蛋白酶、MMP-9及活性氧等多種因子促進(jìn)腫瘤增殖，同時(shí)，術(shù)后淋巴細(xì)胞的明顯下降常與免疫抑制相關(guān)，其數(shù)值的及時(shí)恢復(fù)提示預(yù)后較好[17-20]。CRP和白蛋白反映了系統(tǒng)炎癥與營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，研究[21-23]表明外周血CRP的升高和白蛋白的降低與不良預(yù)后相關(guān)。外周血參數(shù)具有快速簡(jiǎn)便、可復(fù)性高的特點(diǎn)，利用外周血參數(shù)評(píng)估患者預(yù)后有助于及時(shí)掌握患者腫瘤進(jìn)展，為臨床手術(shù)和輔助治療提供參考。

盡管有研究[24-26]證明外周血中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、CRP和白蛋白等與腫瘤預(yù)后相關(guān)，但是單一指標(biāo)受外界影響變化較大，通過(guò)建立多變量模型共同考慮有助于提高準(zhǔn)確性。已有一系列研究報(bào)道術(shù)前NLR、血小板-淋巴細(xì)胞比值（plateletlymphocyte ratio，PLR）、單核-淋巴細(xì)胞比值（monocyte-lymphocyte ratio，MLR）等外周血參數(shù)與GBC、肝癌等多種腫瘤預(yù)后相關(guān)，其中以術(shù)前NLR相關(guān)性最強(qiáng)。Wu等[9]在新近的研究中發(fā)現(xiàn)術(shù)前GPS也與GBC患者預(yù)后相關(guān)，且較NLR預(yù)測(cè)效能更高。盡管術(shù)前外周血參數(shù)指標(biāo)可以在手術(shù)之前快速判定腫瘤大致預(yù)后，為手術(shù)治療提供一定參考，但是較為片面的關(guān)注術(shù)前指標(biāo)而忽視術(shù)后炎癥免疫狀態(tài)可能無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者預(yù)后，影響后續(xù)輔助治療的療效。Ohno等[27]在研究腎癌時(shí)提出術(shù)前NLR及術(shù)后NLR均未升高者預(yù)后明顯較好，結(jié)合術(shù)前及術(shù)后的NLR可能有助于觀測(cè)腫瘤患者術(shù)后療效。李堅(jiān)等[28]在研究NLR與結(jié)腸癌預(yù)后關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)NLR變化有助于觀測(cè)患者療效，為精準(zhǔn)化治療提供參考。吳美龍等[7]在研究肝癌預(yù)后因素時(shí)提出PP-NLR可以全面監(jiān)測(cè)患者術(shù)前及術(shù)后整個(gè)治療過(guò)程的炎癥免疫平衡狀態(tài)，與腫瘤預(yù)后相關(guān)性顯著（P＜0.05）。目前關(guān)于GPS在預(yù)測(cè)GBC預(yù)后中作用的報(bào)道極少，更無(wú)研究在GBC中結(jié)合術(shù)前及術(shù)后NLR評(píng)估預(yù)后，值得探究其有 效性。

本研究在建立ROC曲線后，通過(guò)其界值確定術(shù)前及術(shù)后的NLR臨界值分別為2.51及2.38，與其他相關(guān)研究大致相符[3,29-30]。通過(guò)外周血指標(biāo)計(jì)算得出PP-NLR及GPS，生存分析顯示PP-NLR=0、1、2各組間均存在差異（P＜0.05），而GPS=1和2組間生存無(wú)顯著差異、GPS=0組較GPS=1和2組生存期明顯延長(zhǎng)（P ＜0.0 5）。單因素分析提示PP-NLR及術(shù)前GPS均為影響GBC預(yù)后的因素，且Cox多因素分析結(jié)果顯示PP-NLR、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度為影響G B C 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），較術(shù)前GPS預(yù)測(cè)效能更高。相關(guān)性分析顯示PP-NLR與GPS與腫瘤分期分化、侵犯及轉(zhuǎn)移程度和腫瘤指標(biāo)等多種臨床病理因素相關(guān)，且以PP-NLR總體相關(guān)度更強(qiáng)，進(jìn)一步支持了PPNLR具有更強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力。術(shù)前聯(lián)合術(shù)后NLR評(píng)估患者預(yù)后不僅考慮了術(shù)前患者的系統(tǒng)炎癥免疫狀態(tài)，還考慮了術(shù)后患者免疫抑制的程度，綜合考量了患者術(shù)前及術(shù)后整個(gè)治療過(guò)程，較單一片面的觀測(cè)術(shù)前指標(biāo)預(yù)測(cè)效能更高，可以在術(shù)后腫瘤分期之外為評(píng)估患者療效提供一定的輔助。此外，動(dòng)態(tài)檢測(cè)患者不同時(shí)期的NLR值有助于實(shí)時(shí)觀測(cè)患者炎癥、免疫微環(huán)境變化，可能有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)，及時(shí)予以相應(yīng)的輔助放、化療；同時(shí)，對(duì)于NLR異常提示有免疫抑制的患者，可考慮在放化療之前予以治療增強(qiáng)免疫，以避免進(jìn)一步的免疫抑制出現(xiàn)。然而對(duì)于還未行手術(shù)治療的患者，PP-NLR的預(yù)測(cè)能力有限，此時(shí)術(shù)前GPS也可起到一定的評(píng)估作用，為手術(shù)治療提供參考。

綜上所述，炎癥及免疫微環(huán)境變化會(huì)對(duì)GBC的預(yù)后產(chǎn)生影響，系統(tǒng)炎癥免疫狀態(tài)相關(guān)指標(biāo)PPNLR和GPS在預(yù)測(cè)GBC患者預(yù)后上均存在價(jià)值，具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，與腫瘤侵襲、進(jìn)展相關(guān)。其中PP-NLR綜合考慮了患者術(shù)前及術(shù)后的系統(tǒng)炎癥狀態(tài)，觀測(cè)全面，預(yù)后判定效能較GPS更高。對(duì)于暫未手術(shù)的患者，GPS結(jié)合術(shù)前NLR、影像學(xué)相關(guān)資料有助于確定手術(shù)范圍，達(dá)到精準(zhǔn)切除，提高根治率。然而本研究也存在著一些不足，單中心及樣本量的不足可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定偏倚，鑒于PP-NLR及術(shù)前GPS的簡(jiǎn)便易取和高度可復(fù)性，進(jìn)一步多中心、大樣本的研究以明確其靈敏度可能是需要的，以期為改善GBC的不良預(yù)后提供新的思路。