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        小麥類胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因Lcye功能分析

        2020-09-14 07:21:54翟勝男李豪圣宋健民劉愛峰曹新有程敦公李法計(jì)何中虎夏先春劉建軍
        作物學(xué)報(bào) 2020年10期
        關(guān)鍵詞:突變型黃色素突變體

        翟勝男 郭 軍 劉 成 李豪圣 宋健民 劉愛峰 曹新有 程敦公 李法計(jì) 何中虎 夏先春,* 劉建軍,*

        小麥類胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因功能分析

        翟勝男1郭 軍1劉 成1李豪圣1宋健民1劉愛峰1曹新有1程敦公1李法計(jì)1何中虎2夏先春2,*劉建軍1,*

        1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 山東濟(jì)南 250100;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

        小麥籽粒黃色素是面粉及面制品黃度形成的主要原因, 其主要成分是類胡蘿卜素。ε-番茄紅素環(huán)化酶(LCYE)是小麥類胡蘿卜素生物合成途徑的關(guān)鍵酶, 前人對(duì)其研究多集中于QTL定位、基因克隆和分子標(biāo)記開發(fā), 而基因功能和遺傳調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究利用TILLING技術(shù)篩選EMS誘變?nèi)后w, 對(duì)功能及遺傳調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究, 以期深入認(rèn)識(shí)小麥籽粒黃色素含量形成的分子機(jī)制。在2491份M2代EMS誘變?nèi)后w中共檢測(cè)到21個(gè)基因的點(diǎn)突變, 包含6個(gè)錯(cuò)義突變, 2個(gè)同義突變和13個(gè)內(nèi)含子突變,基因在該誘變?nèi)后w中的突變頻率為1/266.1 kb。PARSENP軟件預(yù)測(cè)分析顯示, M090815 (C2202T)和M091648 (G3284A)兩個(gè)錯(cuò)義突變可能嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)功能。MEME分析結(jié)果表明, M090815和M092230 (G2195A)突變位點(diǎn)位于基因保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)。6個(gè)錯(cuò)義突變植株與野生型雜交構(gòu)建的F2代群體中, M090815突變位點(diǎn)顯著降低籽粒黃色素含量, 證實(shí)該位點(diǎn)對(duì)LCYE功能具有重要影響。qRT-PCR (quantitative real-time PCR)分析也顯示, M090815突變位點(diǎn)顯著降低基因表達(dá)水平, 且和基因表達(dá)降低趨勢(shì)相似, 而在花后14~28 d表現(xiàn)出補(bǔ)償效應(yīng)。本研究不僅驗(yàn)證基因功能, 也為面粉及其制品顏色性狀改良提供了理論依據(jù)和種質(zhì)資源。

        EMS; TILLING; 面粉顏色; 黃色素含量; 遺傳育種

        面粉色澤是評(píng)價(jià)小麥粉品質(zhì)的重要感官指標(biāo)和市場(chǎng)指標(biāo)。黃色素是小麥籽粒中最主要的天然色素, 是面粉及其制品黃度形成的主要原因。籽粒黃色素含量與面粉、面團(tuán)黃度以及面包、面條顏色顯著相關(guān), 相關(guān)系數(shù)分別高達(dá)0.8~0.9和0.69~0.76[1-4]。中式面制品, 如面條、饅頭、包子、餃子等對(duì)面粉的白度要求比較高。

        類胡蘿卜素是構(gòu)成黃色素的主要組分。類胡蘿卜素, 尤其是β-胡蘿卜素, 具有抗氧化、抗癌、維生素A原、預(yù)防眼睛老年性黃斑病變、延緩衰老、提高免疫力等重要生理保健功能。人類和動(dòng)物不能自身合成類胡蘿卜素, 因此必須從外界攝取[5-6]。近年來, 隨著人們營(yíng)養(yǎng)和保健意識(shí)的增強(qiáng), 提高小麥籽粒類胡蘿卜素含量、培育亮黃色的面粉和面制品小麥品種, 逐漸成為新的育種目標(biāo)。

        植物類胡蘿卜素生物合成涉及一個(gè)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6-7]。番茄紅素環(huán)化是類胡蘿卜素合成途徑的重要分支點(diǎn)。植物體內(nèi)普遍存在ε-番茄紅素環(huán)化酶(lycopene epsilon cyclase, LCYE)和β-番茄紅素環(huán)化酶(lycopene beta cyclase, LCYB)兩種番茄紅素環(huán)化酶。Howitt等[8]克隆了普通小麥基因, 發(fā)現(xiàn)其與3B染色體上黃色素含量QTL位點(diǎn)共分離, 證實(shí)基因是影響籽粒黃色素含量的關(guān)鍵基因。董長(zhǎng)海[9]克隆了普通小麥3B和3D染色體上的基因全長(zhǎng), 并針對(duì)B基因組序列差異開發(fā)了顯性標(biāo)記。Crawford和Francki[10]克隆了基因, 并根據(jù)序列差異開發(fā)了功能標(biāo)記。綜上所述, 目前對(duì)小麥基因研究局限于QTL定位、基因克隆和分子標(biāo)記開發(fā), 其功能和遺傳調(diào)控機(jī)制尚不明確, 嚴(yán)重影響和制約了小麥面粉及其制品顏色性狀遺傳改良的育種進(jìn)程。因此, 加強(qiáng)基因功能及其遺傳調(diào)控機(jī)制研究, 有助于進(jìn)一步了解小麥籽粒黃色素含量形成的分子機(jī)制, 為培育符合市場(chǎng)需求的小麥新品種奠定理論基礎(chǔ)。

        定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)(targeting induced local lesions in genomes, TILLING)是一種將誘發(fā)產(chǎn)生高頻率點(diǎn)突變的化學(xué)誘變方法與PCR篩選和高通量檢測(cè)方法有效結(jié)合, 快速高效檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域點(diǎn)突變, 通過對(duì)其表型鑒定分析, 獲得基因功能的反向遺傳學(xué)研究方法[11-12]。與轉(zhuǎn)基因和分子標(biāo)記輔助選擇等分子育種技術(shù)相比, TILLING技術(shù)還具有誘變育種穩(wěn)定快、僅改變少數(shù)目標(biāo)性狀、無需進(jìn)行繁瑣耗時(shí)的轉(zhuǎn)基因及雜交、回交等優(yōu)點(diǎn), 是一種高效定向的分子育種技術(shù)[13-14]。隨著測(cè)序技術(shù)及作物基因組學(xué)的迅速發(fā)展, TILLING技術(shù)將在小麥基因功能分析、遺傳調(diào)控及重要農(nóng)藝、品質(zhì)性狀遺傳改良中發(fā)揮重要作用[15-17]。

        本研究應(yīng)用TILLING技術(shù)篩選甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)誘變?nèi)后w, 根據(jù)小麥基因序列設(shè)計(jì)特異引物, 通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)突變位點(diǎn), 獲得不同等位基因變異的突變植株, 對(duì)不同等位基因的遺傳群體與表型進(jìn)行分析, 鑒定各突變位點(diǎn)對(duì)LCYE功能的影響, 揭示小麥類胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因的功能和遺傳調(diào)控機(jī)制, 為面制品顏色性狀遺傳改良提供理論基礎(chǔ)和種質(zhì)資源。

        1 材料與方法

        1.1 EMS誘變?nèi)后w構(gòu)建

        EMS誘變?nèi)后w構(gòu)建參照Slade等[18]方法。首先篩選一批純合穩(wěn)定、大小一致、籽粒飽滿的濟(jì)麥20和濟(jì)麥22小麥種子, 利用1.2%濃度的EMS進(jìn)行誘變處理, 產(chǎn)生一系列的點(diǎn)突變; 將處理后的種子溫室種植獲得突變?nèi)后wM1代; M1代種子大田種植獲得2491份M2代植株(1251份濟(jì)麥20, 1240份濟(jì)麥22)。

        1.2 應(yīng)用TILLING技術(shù)篩選EMS突變體庫

        EMS突變庫篩選參照Till等[19]方法, 具體步驟如下: (1) 突變體DNA池構(gòu)建: 應(yīng)用CTAB法[20]分別提取每個(gè)M2突變體植株的基因組DNA, 將其存放于96孔板中。利用NanoDrop-2000超微量分光光度儀(thermo scientific)測(cè)定DNA的濃度和質(zhì)量。按8個(gè)樣品一組將DNA進(jìn)行等量混合, 構(gòu)建8倍DNA混合池, 4℃保存?zhèn)溆谩?2)特異性引物設(shè)計(jì): 基于小麥同源基因序列差異, 設(shè)計(jì)A、B和D基因組特異性引物。利用中國(guó)春缺體-四體材料及PCR產(chǎn)物測(cè)序方法, 進(jìn)行引物基因組特異性驗(yàn)證; 應(yīng)用CODDLE (codons optimized to discover deleterious lesions, http://www.proweb.org/coddle/)軟件分析擴(kuò)增區(qū)域是否對(duì)基因功能起重要作用。最終4對(duì)特異性引物, 用于突變體篩選(表1)。(3) PCR擴(kuò)增與異源雙鏈生成: 以DNA混合池為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)體系: DNA 50 ng, PreMix 7.5 μL, 10 μmol L?1上、下游引物各1 μL, ddH2O補(bǔ)足至15 μL; 反應(yīng)程序: 首先95℃變性5 min; 然后95℃變性30 s, 退火溫度從66℃開始, 每個(gè)循環(huán)降低0.3℃, 退火45 s, 72℃延伸1.5 min, 重復(fù)35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min; 然后99℃ 10 min, 85℃ 1 min, 退火溫度從85℃開始, 每個(gè)循環(huán)降低0.5℃, 退火時(shí)間30 s, 共99個(gè)循環(huán); 最后16℃保溫備用。如果DNA混合池樣本目標(biāo)片段中含有突變位點(diǎn), 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過反復(fù)變性、復(fù)性將形成野生型和突變體擴(kuò)增片段的異源雙鏈(即含有錯(cuò)配堿基)。(4) CEL I酶切: 用特異性識(shí)別并切割錯(cuò)配堿基的核酸內(nèi)切酶CEL I剪切異源雙鏈核酸分子。酶切反應(yīng)體系: 10×消化緩沖液2 μL, CEL I 1 μL, 異源雙鏈DNA 15 μL, ddH2O補(bǔ)足至20 μL。45℃反應(yīng)20 min, 隨后加入EDTA (0.25 mol L–1) 5 μL終止酶切反應(yīng)。(5) 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè): 利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)CEL I酶切片段, 篩選獲得含有突變位點(diǎn)的陽性DNA混合池。對(duì)陽性DNA混合池中的每個(gè)樣本DNA逐一與野生型DNA進(jìn)行等量混合, 重復(fù)上述步驟, 篩選獲得陽性突變體單株。(6) 突變樣本克隆測(cè)序: 對(duì)突變個(gè)體PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序, 鑒定突變類型和位置。

        表1 利用TILLING技術(shù)篩選Lcye突變體的引物信息

        1.3 突變位點(diǎn)對(duì)蛋白功能影響預(yù)測(cè)

        利用PARSESNP (project aligned related sequen ces and evaluate SNPs, http://www.proweb.org/pars esnp/)軟件分析突變體植株DNA序列的突變類型, 預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)對(duì)LCYE功能是否造成影響。當(dāng)PSSM值大于10和SIFT (sorting intolerant from tolerant)值小于0.05的氨基酸改變被認(rèn)為可能對(duì)蛋白質(zhì)功能造成重要影響[21-22]。

        1.4 突變位點(diǎn)功能分析

        為了減小其他突變背景影響, 將含有錯(cuò)義突變位點(diǎn)的純合M3植株與野生型植株進(jìn)行雜交, 構(gòu)建F2代群體, 用于分析突變位點(diǎn)對(duì)基因表達(dá)水平及蛋白質(zhì)功能的影響。F2群體于2014—2015年度種植于北京, 行長(zhǎng)2 m, 行距25 cm, 每行20株, 每個(gè)F2群體種20行, 田間管理采用常規(guī)方法。

        利用克隆測(cè)序的方法, 鑒定F2群體中每個(gè)株系基因型(純合突變型、雜合突變型和野生型)。每種基因型各選取10個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程一致的生物學(xué)重復(fù), 記錄開花期, 分別采集花后7、14、21和28 d籽粒, 立即置于液氮中, ?80℃保存, 用于RNA提取和基因表達(dá)水平分析。單株收獲, 成熟籽粒?20℃保存, 用于黃色素含量測(cè)定。

        利用實(shí)時(shí)定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術(shù), 測(cè)定F2群體中純合突變型、雜合突變型和野生型植株籽粒不同發(fā)育時(shí)期(花后7、14、21和28 d)基因及其各同源基因表達(dá)量, 分析突變位點(diǎn)對(duì)基因表達(dá)水平的影響。具體步驟為: 應(yīng)用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN Biotech, 中國(guó)北京)分別提取花后7、14、21和28 d籽粒總RNA, 純合突變型、雜合突變型和野生型植株各3個(gè)生物學(xué)重復(fù); 利用PrimeScript RT Reagent試劑盒(TaKaRa Bio Inc., Otsu, Japan)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 置于–20℃保存?zhèn)溆? 基于小麥同源基因cDNA序列間的保守性和差異性, 設(shè)計(jì)基因的保守性引物和A、B、D基因組特異性引物(表2), 對(duì)其進(jìn)行溶解曲線分析和qRT-PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序, 驗(yàn)證引物保守性和特異性, 普通小麥基因(AB181991)作為內(nèi)參基因; 反應(yīng)體系: LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green (Roche Applied Sciences, USA) 10 μL, 上下游引物0.5 μmol L?1, cDNA 50 ng, ddH2O補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 20 s和72℃ 20 s, 共40個(gè)循環(huán); 應(yīng)用公式2?ΔΔCT計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量[23]。首先, 利用同一樣本中基因轉(zhuǎn)錄水平來校正目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)水平; 其次將野生型植株花后28 d籽粒目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1, 計(jì)算不同基因型植株的籽粒不同發(fā)育時(shí)期目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本3次技術(shù)重復(fù), 基因相對(duì)表達(dá)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(standard error, SE)表示。

        表2 Lcye基因的qRT-PCR引物信息

        測(cè)定F2群體中純合突變型、雜合突變型與野生型植株籽粒黃色素含量, 分析突變位點(diǎn)對(duì)LCYE蛋白功能的影響。每種基因型測(cè)定5個(gè)單株, 平均值作為該基因型的黃色素含量。籽粒黃色素含量的測(cè)定參照AACC方法14-50, 稍作改動(dòng)。稱取1 g全麥粉, 用水飽和正丁醇溶液(5∶1)振蕩提取1 h; 2823′離心10 min。應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定上清液在436.5 nm處吸光值, 計(jì)算黃色素含量。每個(gè)樣本3次技術(shù)重復(fù), 黃色素含量用平均值±SE表示。

        1.5 LCYE功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

        利用NCBI (national center for biotechnology information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫, 獲得目前已知的27個(gè)物種基因的cDNA序列(附表1), 利用MEME Suite 5.1.0 (http://meme-suite. org/)預(yù)測(cè)LCYE功能結(jié)構(gòu)域, 分析各突變位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)域中的分布情況。

        1.6 統(tǒng)計(jì)分析

        應(yīng)用Student’s檢驗(yàn)對(duì)F2群體中純合突變型、雜合突變型和野生型植株籽?;虮磉_(dá)差異和黃色素含量進(jìn)行顯著性分析。基因在EMS誘變?nèi)后w中的突變密度=點(diǎn)突變數(shù)/檢測(cè)總堿基數(shù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 EMS突變體庫篩選

        應(yīng)用TILLING技術(shù), 在2491份M2代EMS誘變?nèi)后w中共檢測(cè)到21個(gè)基因的突變植株(表3)。采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分離CEL I酶切產(chǎn)物, 擴(kuò)增片段150 bp內(nèi)的錯(cuò)配超出檢測(cè)范圍, 將無法被檢測(cè)到, 因此推測(cè)基因在該EMS誘變?nèi)后w中的突變密度為1/266.1 kb。

        突變體克隆測(cè)序和序列分析顯示, 核苷酸從C到T的突變頻率為57.1%, G到A的突變頻率為38.1%, 還檢測(cè)到1個(gè)T到C的特異突變位點(diǎn)(表3)。根據(jù)突變位置分類, 8個(gè)位于外顯子區(qū), 13個(gè)分布于內(nèi)含子區(qū)(圖1)。外顯子區(qū)域的點(diǎn)突變又分為6個(gè)錯(cuò)義突變和2個(gè)同義突變(表3)。

        2.2 突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)功能影響預(yù)測(cè)

        PARSESNP軟件分析結(jié)果顯示, 錯(cuò)義突變體M090815 (C2202T)和M091648 (G3284A)的PSSM值分別為26.9和27.7, SIFT值均為0, 推測(cè)這些突變位點(diǎn)可能對(duì)LCYE蛋白功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響(表4)。

        表3 利用TILLING技術(shù)篩選獲得Lcye突變體信息

        Hom: 純合突變型; Het: 雜合突變型。Hom: homozygous mutants; Het: heterozygous mutants.

        圖1 Lcye突變位點(diǎn)分布圖

        黃色箭頭代表外顯子; 連線代表內(nèi)含子。

        Exons are represented by yellow arrows and introns by connecting lines.

        表4 突變位點(diǎn)對(duì)蛋白功能影響嚴(yán)重度預(yù)測(cè)

        2.3 突變體Lcye基因表達(dá)和黃色素含量分析

        將6個(gè)純合錯(cuò)義突變體與野生型植株雜交, 構(gòu)建F2代群體, 分析突變位點(diǎn)對(duì)基因表達(dá)水平和籽粒黃色素含量的影響。結(jié)果表明, 6個(gè)F2群體中, 僅M090815 (C2202T)突變位點(diǎn)顯著降低了基因表達(dá)和黃色素含量(圖2和圖3), 表明該突變位點(diǎn)對(duì)LCYE蛋白功能產(chǎn)生重要影響。

        突變體M090815構(gòu)建的F2群體中, 不同基因型植株籽粒及其同源基因表達(dá)水平如圖2所示?;ê?~21 d, 純合突變型植株籽?;蚩偙磉_(dá)量降低至野生型的59.0%~83.0%, 雜合型降低至71.5%~91.1%, 花后28 d各基因型表達(dá)差異不顯著。除了純合突變型在花后28 d表達(dá)量顯著高于野生型外, 花后各時(shí)期和基因表達(dá)顯示相似的下降趨勢(shì), 純合突變型植株表達(dá)量降低至野生型的70.0%~78.7%和55.5%~92.0%,雜合型降低至83.1%~90.0%和75.2%~90.0%。在花后7 d, 各基因型表達(dá)量差異不顯著,花后14~28 d, 表現(xiàn)出補(bǔ)償效應(yīng), 純合突變型比野生型表達(dá)量高33.4%~70.0%, 雜合型高0.7%~ 48.1%。相應(yīng)地, 在突變體M090815構(gòu)建的F2群體中, 純合突變型植株成熟籽粒黃色素含量顯著低于雜合突變型和野生型植株(圖3, 1.63 vs. 1.90和2.02 μg g?1)。

        圖2 突變體M090815的F2群體中不同基因型植株籽粒Lcye及其同源基因的相對(duì)表達(dá)量

        *和**分別代表0.05和0.01顯著水平的差異。Hom: 純合突變型; Het: 雜合突變型; WT: 野生型。

        *< 0.05, **< 0.01. Hom: homozygous mutants; Het: heterozygous mutants; WT: wild-type genotypes.

        圖3 突變體M090815的F2群體中不同基因型植株籽粒黃色素含量

        Fig. 3 Yellow pigment content of different genotypes in F2populations derived from homozygous M090815 mutant crossed with wild-type plant

        *代表0.05顯著水平的差異。Hom: 純合突變型; Het: 雜合突變型; WT: 野生型。

        *< 0.05. Hom: homozygous mutants; Het: heterozygous mutants; WT: wild-type genotypes.

        2.4 LCYE功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

        基于擬南芥()、水稻()、大麥()等27個(gè)物種已知的基因cDNA序列(附表1), 利用MEME Suite 5.1.0預(yù)測(cè)LCYE功能結(jié)構(gòu)域, 共檢測(cè)到3個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖4)。6個(gè)錯(cuò)義突變中, M090815 (C2202T)和M092230 (G2195A)突變位點(diǎn)恰好位于結(jié)構(gòu)域1內(nèi), 且M090815突變位點(diǎn)在27個(gè)物種中非常保守, M092230突變位點(diǎn)存在G、A和U三種堿基變異。

        圖4 Lcye功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

        3 討論

        3.1 LCYE調(diào)控小麥籽粒類胡蘿卜素合成

        小麥籽粒類胡蘿卜素影響面制品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和表觀色澤。番茄紅素環(huán)化是類胡蘿卜素合成途徑中一個(gè)重要的分節(jié)點(diǎn), 番茄紅素在LCYB催化下, 經(jīng)β-β途徑生成β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)和堇菜黃質(zhì)等葉黃素類物質(zhì); 在LCYE和LCYB共同催化下,經(jīng)β-ε途徑生成α-胡蘿卜素和葉黃體素。類胡蘿卜素含量和組成在小麥籽粒發(fā)育過程中是動(dòng)態(tài)變化的, 具有復(fù)雜的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[8]。β-β途徑在籽粒發(fā)育早期占有較高表達(dá)水平, 隨著籽粒生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)量和所占比例逐漸下降, 成熟籽粒幾乎檢測(cè)不到玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和堇菜黃質(zhì)等類胡蘿卜素。相反, β-ε途徑在整個(gè)籽粒發(fā)育過程中穩(wěn)定表達(dá), 葉黃體素成為構(gòu)成成熟籽粒類胡蘿卜素的主要成分[8]。

        通過調(diào)節(jié)LCYB和LCYE的相對(duì)活性和相對(duì)含量可以決定番茄紅素轉(zhuǎn)化為α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的比例。在番茄突變體中,轉(zhuǎn)錄水平提高, 果實(shí)內(nèi)δ-胡蘿卜素含量大量增多; 而在番茄突變體中,過表達(dá), 果實(shí)中累積大量的β-胡蘿卜素[24]。對(duì)比兩種突變體的差異進(jìn)一步證實(shí)番茄果實(shí)中類胡蘿卜素的積累主要是相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平上差異表達(dá)的結(jié)果[25]。

        Richaud等[26]應(yīng)用TILLING技術(shù), 篩選硬粒小麥突變體, W437*()突變位點(diǎn)顯著增加突變體葉片中β-胡蘿卜素和類胡蘿卜素的含量, 但對(duì)籽粒中類胡蘿卜素含量無顯著影響。本研究利用TILLING技術(shù)篩選普通小麥EMS突變體庫, 獲得基因一系列等位變異, 研究其對(duì)基因表達(dá)和籽粒黃色素含量的影響, 為基因功能研究和面制品顏色性狀改良奠定理論基礎(chǔ)和提供重要種質(zhì)資源。

        3.2 Lcye突變體篩選

        TILLING技術(shù)有效結(jié)合了高頻率點(diǎn)突變與現(xiàn)代分析檢測(cè)技術(shù), 僅需要較小的突變?nèi)后w便可快速有效地篩選到一系列目標(biāo)基因點(diǎn)突變, 逐漸成為植物功能基因組學(xué)、作物遺傳育種以及自然資源遺傳多樣性評(píng)估等研究的重要手段[27-28]。目前, 該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水稻[29]、玉米[30]、小麥[31-32]、大麥[33]、高粱[34]等20多種作物。研究表明小麥基因突變頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于擬南芥、水稻和玉米等植物, TILLING技術(shù)在小麥等麥類作物中的應(yīng)用潛力更為巨大、前景更為光明。

        對(duì)于小麥等基因組復(fù)雜的多倍體物種, 基因多拷貝是限制TILLING技術(shù)高效應(yīng)用的一個(gè)瓶頸。設(shè)計(jì)特異性引物至關(guān)重要, 否則會(huì)影響檢測(cè)效率。小麥基因A、B和D同源基因間序列相似性非常高(89.1%~97.0%), 設(shè)計(jì)特異性引物非常困難。結(jié)合CODDLE程序給出的EMS誘導(dǎo)植株產(chǎn)生有害突變的可能范圍, 最終篩選到4對(duì)引物用于突變體檢測(cè)(表1)。

        酶切產(chǎn)物的檢測(cè)方法有多種, 一般采用高效液相色譜技術(shù)、聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳以及雙色紅外熒光檢測(cè)技術(shù)[35-38]。本研究采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)技術(shù), 既不使用熒光標(biāo)記引物, 又不使用昂貴的變性凝膠電泳成像系統(tǒng), 有效地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程, 降低了實(shí)驗(yàn)成本, 在一定程度上擴(kuò)大TILLING的應(yīng)用范圍和工作效率。共篩選到21個(gè)突變位點(diǎn), 推測(cè)在EMS誘變?nèi)后w中的突變頻率為(1/266.1 kb), 遠(yuǎn)低于Uauy等[37]應(yīng)用非變性聚丙烯酰胺凝膠技術(shù)檢測(cè)到的六倍體小麥突變頻率(1/38 kb)。這可能是由于基因目標(biāo)區(qū)域G/C含量不同或者非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)對(duì)8樣本DNA混池的檢測(cè)靈敏度較低所致。

        3.3 影響LCYE功能的重要調(diào)控位點(diǎn)

        基于擬南芥、水稻、大麥等27個(gè)物種的cDNA序列, 利用MEME預(yù)測(cè)LCYE功能結(jié)構(gòu)域, 結(jié)果顯示M090815 (C2202T)和M092230 (G2195A)突變位點(diǎn)恰好位于結(jié)構(gòu)域1內(nèi)(圖4)。M092230 (G2195A)突變位點(diǎn)在自然界物種進(jìn)化中存在G、A和U三種堿基變異, 因此推測(cè)G到A核苷酸突變對(duì)LCYE功能未產(chǎn)生影響。而M090815 (C2202T)突變位點(diǎn)在27個(gè)物種中高度保守, 推測(cè)該位點(diǎn)對(duì)LCYE功能具有重要影響。PARSESNP軟件預(yù)測(cè)顯示M090815 (C2202T)和M091648 (G3284A)突變位點(diǎn)可能對(duì)蛋白功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響(表4), 進(jìn)一步表明M090815 (C2202T)突變位點(diǎn)對(duì)LCYE蛋白功能的重要性。M090815構(gòu)建的F2群體中, 與野生型植株相比, 純合突變型植株籽粒黃色素含量顯著下降(圖3), 證實(shí)M090815 (C2202T)突變位點(diǎn)對(duì)LCYE功能具有重要影響。然而在M091648構(gòu)建的F2群體中純合突變型與野生型植株相比籽粒黃色素含量差異并不顯著。這種不一致性可能是由于PARSESN軟件是基于序列同源性及氨基酸物理特性進(jìn)行突變位點(diǎn)對(duì)蛋白功能影響嚴(yán)重度的預(yù)測(cè), 而有些位點(diǎn)可能并不參與蛋白功能調(diào)控[21-22]。

        對(duì)M090815構(gòu)建的F2群體進(jìn)行及其同源基因表達(dá)水平分析顯示, 與野生型植株相比, 純合突變型植株籽粒基因總表達(dá)量顯著降低(圖2)。籽粒發(fā)育各時(shí)期, 除在純合突變型植株中表達(dá)水平在花后28 d高于野生型外,和基因表達(dá)水平均呈下降趨勢(shì)。而在花后7 d, 各基因型植株表達(dá)差異不顯著, 花后14~28 d, 表現(xiàn)出補(bǔ)償效應(yīng)。推測(cè)和基因表達(dá)受協(xié)同調(diào)控, 而表達(dá)調(diào)控機(jī)制可能與之不同。序列分析發(fā)現(xiàn),與和的序列相似性分別為89.1%和89.2%, 而和基因序列相似性高達(dá)97.0%, 為上述推測(cè)提供間接支持。鑒于上述結(jié)果只通過一個(gè)F2群體獲得, 因此仍需進(jìn)一步研究。

        3.4 分子育種

        種質(zhì)資源缺乏成為小麥面粉及其制品顏色改良的“瓶頸”, 嚴(yán)重影響我國(guó)小麥品種面制品顏色性狀的遺傳改良。EMS誘變可以創(chuàng)造大量的等位變異, 且在后代穩(wěn)定遺傳, 由于不涉及轉(zhuǎn)基因操作, 獲得的優(yōu)異突變體可以直接用于育種實(shí)踐[39-40]。在我國(guó), 面制品以蒸煮為主, 細(xì)膩潔白的面粉備受消費(fèi)者青睞。本研究采用TILLING技術(shù)篩選獲得的顯著降低籽粒黃色素含量的M090815突變體, 該突變體農(nóng)藝性狀與野生型濟(jì)麥20無顯著差異, 可作為面粉顏色遺傳改良的重要種質(zhì)資源。此外, 濟(jì)麥20為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)面包、面條兼用型強(qiáng)筋小麥; 濟(jì)麥22為超高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)廣適多抗小麥品種, 兩個(gè)均為大面積推廣種植的優(yōu)良品種, 綜合性狀良好。以上述兩個(gè)品種作誘變基礎(chǔ)材料創(chuàng)制的優(yōu)異突變體, 更適宜于用作雜交親本, 以期快速培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥新品種。

        競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR (Kompetitive Allele Specific PCR, KASP)是基于引物末端堿基的特異性匹配對(duì)SNP進(jìn)行雙等位基因分型技術(shù), 具有高通量、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好和檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn), 是目前廣泛使用的SNP分型方法[41-42]。因此, 在后續(xù)工作中針對(duì)M090815突變體基因C2202T的SNP變異位點(diǎn)開發(fā)KSAP標(biāo)記, 以期為利用M090815突變體對(duì)面制品顏色性狀進(jìn)行高效、可靠的分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支撐。

        4 結(jié)論

        本研究以濟(jì)麥20和濟(jì)麥22的EMS誘變?nèi)后w為材料, 利用TILLING技術(shù)篩選小麥類胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因的突變體, 共獲得21個(gè)基因的點(diǎn)突變。生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)水平和黃色素含量測(cè)定均顯示, M090815 (C2202T)突變位點(diǎn)對(duì)LCYE蛋白功能具有重要影響。M090815突變位點(diǎn)顯著降低基因表達(dá)水平, 且和基因表達(dá)降低趨勢(shì)相似, 而在花后14~28 d表現(xiàn)出補(bǔ)償效應(yīng)。本研究獲得的突變體不僅為開展基因功能研究提供了良好的試驗(yàn)材料, 也為面制品顏色性狀遺傳改良提供了豐富的種質(zhì)資源。

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        附表1 27個(gè)物種基因cDNA序列信息

        Supplementary table 1 Information of cDNA sequences of Lcye genes in 27 plant species

        GenBank: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.

        Functional analysis ofgene involved in the carotenoid synthesis in common wheat

        ZHAI Sheng-Nan1, GUO Jun1, LIU Cheng1, LI Hao-Sheng1, SONG Jian-Min1, LIU Ai-Feng1, CAO Xin-You1,CHENG Dun-Gong1, LI Fa-Ji1, HE Zhong-Hu2, XIA Xian-Chun2,*, and LIU Jian-Jun1,*

        1Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

        Yellow pigment in wheat grains, mostly composed of carotenoids, is a main factor for the yellowness of flour and its end-used products. Lycopene epsilon cyclase (LCYE) is a key enzyme for the carotenoid biosynthesis pathway in wheat. Previous studies ofgene mainly focused on QTL mapping, gene cloning, and molecular marker development, but its function and genetic regulatory mechanisms remained unclear. In the present study, in order to further understanding the molecular mechanism of yellow pigment formation in wheat grains, the function and genetic regulation ofwere studied by TILLING to screen the EMS-mutagenised population. A total of 21mutations including six missense mutations, two synonymous mutations and 13 intron mutations were detected consisted from 2491 M2EMS-mutagenised population. The mutation frequency ofin the population was 1/266.1 kb. Two missense mutations (M090815 and M091648) were predicted to have severe effects on LCYE protein function based on PARSENP software. MEME analysis showed that the mutation sites of M090815 and M092230 were located on the conserved domain ofgene. In F2populations crossing by six missense mutants and the wild type, C2202T mutation in M090815 significantly reduced yellow pigment content in grains, indicating the mutation played an important effect on LCYE function. The quantitative real-time PCR (qRT-PCR) results also showed that the expression level ofgene were significantly reduced, and the decrease trend ofandexpression level was similar during different seed developmental stages, while the expression level ofexhibited a compensation effect at 14–28 days post anthesis. This study identifiedgene function, and provided germplasms and a theoretical basis for the improvement of flour color traits and end-used products.

        EMS; TILLING; flour color; yellow pigment content; genetics and breeding

        10.3724/SP.J.1006.2020.01013

        本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31701420), 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CXGC2018E01), 中國(guó)科協(xié)青年人才托舉工程(2017QNRC001)和山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目(2019LGC001)資助。

        This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31701420), the Agricultural Scientific and Technological Innovation Project of Shandong Academy of Agricultural Sciences (CXGC2018E01), the Young Elite Scientists Sponsorship Program by CAST (2017QNRC001), and the Agricultural Variety Improvement Project of Shandong Province (2019LGC001).

        夏先春, E-mail: xiaxianchun@caas.cn, Tel: 010-82108610; 劉建軍, E-mail: ljjsaas@163.com, Tel: 0531-66659561

        E-mail: zsn19870322@163.com, Tel: 0531-66659561

        2020-02-18;

        2020-06-02;

        2020-06-12.

        URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200612.1151.004.html

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