摘 要： 蛋白質(zhì)的糖基化對(duì)于其作為生物治療劑至關(guān)重要，已經(jīng)展開(kāi)了許多對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞生產(chǎn)蛋白糖基化的研究。生物過(guò)程參數(shù)和培養(yǎng)基添加劑可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的糖基化。本文介紹了工程策略方面的進(jìn)展。

關(guān)鍵詞： CHO細(xì)胞;糖基化;蛋白

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞被廣泛用于生物治療藥物的生產(chǎn)中，部分原因是它們能夠產(chǎn)生糖基化的蛋白質(zhì)。糖基化通過(guò)影響分子的半衰期和效率而在蛋白質(zhì)功能中起關(guān)鍵作用，并有可能對(duì)糖蛋白的安全性產(chǎn)生不利影響[1]。研究人員采用不同的方法包括改變工藝條件、補(bǔ)充培養(yǎng)基添加劑以及宿主細(xì)胞系的修飾來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子的糖基化譜。

糖蛋白通常是指各種翻譯后修飾，尤其是蛋白質(zhì)N-糖基化，它對(duì)蛋白質(zhì)的功效和免疫原性起著至關(guān)重要的作用。蛋白質(zhì)功能受糖基化作用，在結(jié)合、溶解度、穩(wěn)定性和折疊等方面有影響。

1 通過(guò)工藝優(yōu)化控制糖基化

通過(guò)優(yōu)化工藝條件如溶解氧（DO）、pH、溫度和培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間等從而影響蛋白質(zhì)的糖基化。

Chotigeat及其同事發(fā)現(xiàn)，將重組人CHO的卵泡刺激素（hFSH）的表達(dá)受β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制的重組CHO細(xì)胞系在無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基上穩(wěn)定灌流培養(yǎng)。增加DO濃度提升了唾液酸轉(zhuǎn)移酶的活性，F(xiàn)SH亞型向較低的pI部位轉(zhuǎn)移，這使得唾液酸含量的增加。隨著hFSH比生產(chǎn)率的增加，其亞型分布向低pI亞型轉(zhuǎn)移[2]。

相反，對(duì)Epo-Fc融合蛋白[3]和rEPO[4]的研究發(fā)現(xiàn)DO對(duì)唾液酸化沒(méi)有影響。對(duì)表達(dá)EPO的CHOK1細(xì)胞的進(jìn)一步研究表明，DO對(duì)觸角程度沒(méi)有影響，但是有一個(gè)最佳的DO范圍可使巖藻糖基化最大化。對(duì)于IgG1的末端半乳糖基化，隨著DO濃度的降低觀察到聚糖鏈半乳糖基化程度降低[5]。

CHO培養(yǎng)過(guò)程中向較低培養(yǎng)溫度的轉(zhuǎn)變也會(huì)影響糖基化。使用表達(dá)人組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）的CHO細(xì)胞進(jìn)行的研究與多糖位點(diǎn)占有率的增加和溫度的降低相關(guān)[6]。對(duì)高度糖基化融合蛋白Epo-Fc的研究中確定降低培養(yǎng)溫度會(huì)降低產(chǎn)物唾液酸化。對(duì)表達(dá)人EPO的DUXB11細(xì)胞的類似研究發(fā)現(xiàn)，低于32°C的溫度會(huì)導(dǎo)致四唾液酸化的N-聚糖，酸性同工型和四觸角結(jié)構(gòu)減少。

對(duì)于在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞中表達(dá)的兩種不同的重組糖蛋白，重組人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）和重組酶（糖蛋白2-GP2）。這兩個(gè)分子都包含一個(gè)可變占據(jù)的N-糖基化位點(diǎn)。Martin Gawlitzek等研究了影響這些分子位點(diǎn)占據(jù)的不同環(huán)境因素（占位點(diǎn)的程度）。向培養(yǎng)基中添加額外的錳或鐵會(huì)使完全占據(jù)的t-PA（I型t-PA）的比例增加約2.5-4%。將培養(yǎng)溫度從37℃降低到33℃或31℃，t-PA的位點(diǎn)占用率提高4%。對(duì)于重組酶（GP2），發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)pH和丁酸鹽添加的時(shí)間可用于將N-聚糖位點(diǎn)占用控制在特定范圍內(nèi)。培養(yǎng)液pH值的升高與位點(diǎn)占用率的降低相關(guān)。這些結(jié)果顯示了細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的重組糖蛋白的產(chǎn)品質(zhì)量的重要性。

2 培養(yǎng)基成分補(bǔ)充

除了優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件外，補(bǔ)充培養(yǎng)基也是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)糖基化的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。CHO細(xì)胞產(chǎn)生的嵌合重鏈抗體（EG2）的糖基化模式受培養(yǎng)物中葡萄糖降解的影響，非糖基化mAb的比例隨著細(xì)胞暴露在葡萄糖耗盡的培養(yǎng)基中的時(shí)間而增加。

Jintao Liu發(fā)現(xiàn)有限的核苷酸糖前體和細(xì)胞外唾液酸酶不影響唾液酸含量的降低。寡糖分析表明缺乏蛋白質(zhì)半乳糖基化是唾液酸含量降低的潛在原因;通過(guò)在2 L生物反應(yīng)器中對(duì)半乳糖的補(bǔ)充，顯示總唾液酸含量增加了44%，在CHO-GS宿主中表達(dá)的Fc融合蛋白的唾液酸化多糖含量增加了20.3。在最近的研究中，錳被證明在葡萄糖限制的培養(yǎng)基中添加時(shí)可以增加M5高甘露糖聚糖。

3 展望

新型基因組編輯工具的出現(xiàn)開(kāi)辟了細(xì)胞系工程領(lǐng)域，并為工程化CHO細(xì)胞產(chǎn)生的治療藥物的糖基化提供了許多選擇。隨著用于評(píng)估聚糖譜的分析方法的不斷改進(jìn)，準(zhǔn)確地分離具有高比生產(chǎn)率和所需糖型的克隆的能力將得到改善，優(yōu)化細(xì)胞系發(fā)育從而生成具有目標(biāo)糖基化譜的克隆。

參考文獻(xiàn)：

[1]Rudd P M，Elliott T，Cresswell P，et al.Glycosylation and the Immune System[J].Science，2001，291（5512）：2370-2376.

[2]Chotigeat W，Watanapokasin Y，Mahler S，et al.Role of environmental conditions on the expression levels，glycoform pattern and levels of sialyltransferase for hFSH produced by recombinant CHO cells[J].Cytotechnology，1994，15（1）：217-221.

[3]Trummer E，F(xiàn)auland K，Seidinger S，et al.Process parameter shifting：Part II.Biphasic cultivation—A tool for enhancing the volumetric productivity of batch processes using Epo-Fc expressing CHO cells[J].Biotechnology and bioengineering，2006，94（6）：1045-1052.

[4]Restelli V，Wang M D，Huzel N，et al.The effect of dissolved oxygen on the production and the glycosylation profile of recombinant human erythropoietin produced from CHO cells[J].Biotechnology and bioengineering，2006，94（3）：481-494.

[5]Kunkel J P，Jan D C H，Jamieson J C，et al.Dissolved oxygen concentration in serum-free continuous culture affects N-linked glycosylation of a monoclonal antibody[J].Journal of Biotechnology，1998，62（1）：55-71.

[6]Gawlitzek M，Estacio M，Tobias Fürch，et al.Identification of cell culture conditions to control N‐glycosylation site‐occupancy of recombinant glycoproteins expressed in CHO cells[J].Biotechnology & Bioengineering，2009，103（6）.

作者簡(jiǎn)介： 杜秀冬，男，漢族，河北宣化人，本科，工程師，研究方向：醫(yī)療工程。