段智紅 黃燕霞 呂應(yīng)年 黃永梅 梁力中 葉華 葉盛權(quán)

摘要：以海稻米為研究對象，研究提取溫度、提取溶劑、料液比、提取時間、提取次數(shù)等5個因素對海稻米中γ氨基丁酸（GABA）提取率的影響，采用正交試驗分析方法確定海稻米中GABA最優(yōu)工藝條件。結(jié)果表明：海稻米中GABA的最佳提取工藝為：提取溶劑為水、提取時間為1 h、提取次數(shù)3次、提取溫度60 ℃、提取物料比1 g∶15 mL，在此提取條件下的提取率為62μg/g。

關(guān)鍵詞：海稻米;γ氨基丁酸;提取率;優(yōu)化

γ氨基丁酸（GABA）主要是谷氨酸經(jīng)由谷氨酸脫羧酶 （GAD）催化脫羧而生成的一種天然非蛋白質(zhì)氨基酸[1]，在動植物以及微生物中分布廣泛。GABA藥理作用廣，對高血壓[2]、睡眠困難[3]、焦慮癥[45]、皮膚衰老[6]以及神經(jīng)退行性疾病[7]等均有療效，研究表明，GABA還有提高記憶力的功效[8]。海水稻是一種耐鹽堿的水稻新品種[910]，富含多種蛋白質(zhì)、脂肪及微量元素等。米胚中GABA的含量高達(dá)121714 9 mg/100 g[11]。作為新型功能性因子，GABA被廣泛運用于食品、醫(yī)藥、保健品等生產(chǎn)領(lǐng)域[1214]。目前，微生物發(fā)酵法[15]、化學(xué)合成法[16]以及從動植物中提取富集法[1718]是獲得GABA的幾種主要方法，然而，這類方法獲得GABA的得率并不高[1920]，因此，本研究探討了從海稻米中提取GABA的不同處理方法對GABA得率的影響，確定了提取GABA的最優(yōu)條件。

1材料與方法

11材料與儀器

海稻米，由陳日勝研究員饋贈;2，4二硝基氟苯（FDNB）、GABA（≥ 99%），均購自美國Sigma公司;乙腈（色譜純），購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇和其他化學(xué)試劑均為分析純;水為試驗室超純水機制水。

Agilent 1200 高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司;RE5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;FA1204B 型分析天平，上海天美天平儀器有限公司;800YX小型多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司;pHB3筆式pH計，上海三信儀表廠;TDZ4臺式低速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公室;DZG303A超純水機，上海碩鼎水處理設(shè)備有限公司;DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

12方法

121GABA的提取方法試驗用海稻米經(jīng)800YX小型多功能粉碎機粉碎得海稻米粉末，稱取一定量的海稻米粉末于燒杯中，以料液比（g/mL）為1∶15的比例加入蒸餾水，60 ℃下磁力攪拌提取1 h，提取液經(jīng)抽濾得濾液，濾渣再加等量的提取溶劑重復(fù)提取2遍，將3次抽濾后得到的濾液合并后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至一定體積，將濃度液轉(zhuǎn)移至15 mL容量瓶中，加入蒸餾水至刻度線，備用。

122GABA的含量測定試驗以2，4二硝基氟苯（FDNB）為衍生化試劑對樣品進(jìn)行柱前衍生化，采用高效液相法對海稻米提取物中GABA進(jìn)行測定[2122]。

123單因素試驗按照121 的提取方法，選取溫度、提取溶劑、料液比、提取時間、提取次數(shù)等5個因素進(jìn)行單因素試驗，探索不同影響因素對海稻米提取液中GABA提取率的影響。試驗分別以水、50%乙醇、80%乙醇、 無水乙醇溫為提取溶劑，料液比（g /mL）為1∶5、1∶75、1∶10、1∶15、1∶20，在25、45、60、70、80 ℃水浴條件下對海稻米粉提取 05、1、2、3、4 h，并分別計算出GABA得率。

124正交試驗由單因素試驗結(jié)果選出對 GABA 得率影響較大的3個因素進(jìn)行正交試驗，并對試驗參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[2324]（表1）。

2結(jié)果與分析

21提取溫度對GABA提取率的影響

從圖1可以看出，GABA的提取率隨著提取溫度的逐漸升高先增大后減小且在60℃有最大值，這可能是由于溫度過高，破壞了GABA的分子間作用力和分子結(jié)構(gòu)，使GABA逐漸分解或析出，導(dǎo)致提取率下降。因此，本試驗選取60 ℃為最佳提取溫度。

22提取溶劑對GABA提取率的影響

由圖2可知，用蒸餾水作為提取溶劑時，GABA的提取率最高，而且，提取溶劑

中乙醇含量越高，GABA的提取率越低，這可能是與GABA分子具有極易溶于水、微溶于熱有機溶劑的理化性質(zhì)有關(guān)，因此，本試驗選取水作為提取溶劑。

23提取料液比對GABA提取率的影響

由圖3可知，GABA的提取率隨著料液比的增加先驟增后趨于平穩(wěn)。當(dāng)提取溶劑較少時（料液比低于1∶75），GABA的提取率較低，可能是海稻米粉出現(xiàn)吸水膨脹，將大部分提取溶劑吸收導(dǎo)致GABA提取率較低，隨著料液比的不斷增加，GABA的提取率也逐漸增大，當(dāng)物料比超過1∶15時，GABA的提取率基本保持不變，因此，本試驗確定最佳料液比為1∶15。

24提取時間對GABA提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的延長，GABA的提取率呈現(xiàn)出先增大后減少的趨勢，在提取時間為1 h時有1個最大值，GABA的提取率有先增大后減少的趨勢，因此，本試驗最佳提取時間是1 h。

25提取次數(shù)對GABA提取率的影響

從圖5可以看出，GABA的提取率隨著提取次數(shù)的增加逐漸下降，當(dāng)提取次數(shù)超過3次時，幾乎無法提取到GABA，且隨著提取次數(shù)的增加，提取耗材也隨之增加，因此，本試驗的最佳提取次數(shù)為3次。

26單因素試驗結(jié)果

從海稻米中提取GABA的最佳條件為：提取溶劑為水、提取時間1 h、最佳提取次數(shù)3次、提取溫度60 ℃、物料比1g∶15mL。

27正交試驗結(jié)果

將表2試驗數(shù)據(jù)輸入至SPSS 170 軟件并對試驗結(jié)果進(jìn)行分析[25]。從表3可以看出，取提取溶劑、提取溫度和提取次數(shù)的Sig值分別為0232、0462、0692，均不低于005，由此可得出：不同影響因素對GABA得率無明顯差異;對GABA得率影響最大的因素是提取溶劑，其次是提取溫度和提取次數(shù)。由表4～6可以看出，每個影響因素的最佳水平為提取溫度為60 ℃、提取次數(shù)為3次、提取溶劑為水，該結(jié)果與單因素試驗結(jié)果吻合。最后，為了驗證試驗結(jié)果，我們稱取20000 g 海稻米粉末，采用上述最優(yōu)提取條件，重復(fù)平行試驗3次，按照“122”的測定方法進(jìn)行測定，GABA最終平均得率為0006 2% （表7），這說明該方法重復(fù)性良好。

3結(jié)論

20世紀(jì)末，GABA以茶飲料的形式在食品中出現(xiàn)，此后各種富含GABA的茶產(chǎn)品不斷問世[2630]，引起了廣泛的關(guān)注，因此，如何快速大量地獲得GABA并實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)是目前急需解決的問題。本研究著力于海稻米中GABA提取工藝優(yōu)化，確立了最佳方法為：提取溶劑為水、提取時間1 h、提取次數(shù)3次、提取溫度60℃、提取料液比1g∶15 mL。在此條件下對試驗進(jìn)行驗證，GABA的最終提取率為0006 2%。本試驗確定了海稻米GABA的最佳提取條件，提高了GABA的提取率，為海稻米的開發(fā)利用以及高GABA含量海稻米片劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)?！?/p>

參考文獻(xiàn)

[1]肖君榮，余以剛，柯于家，等高GABA發(fā)芽糙米制備新方法[J]. 食品科技，2014（7）：152157

[2]蔣芮，等谷物中γ氨基丁酸（GABA）富集工藝的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2018（1）：347352

[3]吳春蘭，黃亞輝，賴幸菲，等γ氨基丁酸（GABA）毛葉茶品質(zhì)成分分析及其改善睡眠作用的研究[C]. 廣東省研究生學(xué)術(shù)論壇園藝分論壇，2013

[4]田娜γ氨基丁酸對小鼠早期胚胎植入的毒性作用及機制研究[D]. 重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2017

[5]姚子鵬乳酸菌發(fā)酵黃漿水生產(chǎn)GABA的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014

[6]王維高產(chǎn)γ氨基丁酸釀酒酵母的篩選及在梨酒釀造中的應(yīng)用[D]. 石家莊：河北科技大學(xué)，2015

[7]李連娥GABA系統(tǒng)調(diào)節(jié)對阿爾茲海默病及正常衰老的影響[D]. 昆明：昆明理工大學(xué)，2017

[8]黃敏欣廣東客家黃酒產(chǎn)γ氨基丁酸的影響因素及代謝調(diào)控研究[D]. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，2016

[9]楊軍，王海鳳，郭濤海稻86的秈粳性鑒定[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，48（10）：2426

[10]祝一文，等‘海稻86’耐鹽堿脅迫生理機制的初步研究[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2018（1）：3239

[11]陳春旭，等鹽脅迫對發(fā)芽糙米富集γ氨基丁酸及蛋白組分變化的影響[J]. 食品科學(xué)，2018，39（5）：8792

[12]饒煥新全細(xì)胞催化產(chǎn)GABA工程菌株的構(gòu)建及其發(fā)酵生產(chǎn)[D]. 福州：福建師范大學(xué)，2016

[13]石洋華富含γ氨基丁酸梨酒的釀造[D]. 石家莊：河北科技大學(xué)，2016

[14]尹然高產(chǎn)γ氨基丁酸（GABA）優(yōu)良菌種的選育及發(fā)酵工藝的研究[D]. 哈爾濱：哈爾濱商業(yè)大學(xué)，2016

[15]楊宏芳，等微生物發(fā)酵法制備γ氨基丁酸的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（24）：7678

[16]張聰，應(yīng)國海一種新的γ氨基丁酸合成方法[J]. 精細(xì)與專用化學(xué)品，2009，17（16）：2627

[17]王凱凱，等γ氨基丁酸（GABA）形成機理及富集方法的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2018（14）：323329

[18]鄧小玲，張娜，寧發(fā)子一種從桑葉中提取γ氨基丁酸的方法：，CN106608837A[P].2017

[19]趙琳，等高效液相色譜法測定苦蕎及其萌發(fā)物中γ氨基丁酸的含量[J]. 食品工業(yè)，2012（6）：124126

[20]楊晶晶，等γ氨基丁酸的制備方法與含量測定研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（3）：351356

[21]張志清，徐杰，叢軍，等高效液相色譜法測定發(fā)芽麥粒中γ氨基丁酸（GABA）含量[J]. 中國糧油學(xué)報，2015，30（11）：135139

[22]段智紅，黃永梅，呂應(yīng)年，等2，4二硝基氟苯柱前衍生HPLCUV法測定海稻米中的γ氨基丁酸含量[J].食品工業(yè)科技，2018（20）：111

[23]林智，尹軍峰，譚俊峰厭氧處理對茶葉中γ氨基丁酸含量及其品質(zhì)的影響[C].中國茶葉學(xué)會海峽兩岸茶葉學(xué)術(shù)研討會，2003：16

[24]謝娟，謝憲群綠茶中γ氨基丁酸提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)，2016（8）：1415

[25]朱紅兵，席凱強SPSS 170中的正交試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析[J]. 首都體育學(xué)院學(xué)報，2013，25（3）：283288

[26]李常鈺，王超超，楊慧萍發(fā)芽糙米中γ氨基丁酸的富集與測定[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2011，12（2）：47

[27]朱曉立，裘暉γ氨基丁酸的生物學(xué)功能及其在食品上的應(yīng)用[J]. 食品工程，2008（2）：3437

[28]張盈嬌，等富γ氨基丁酸（GABA）金川發(fā)芽紅糙米制備工藝研究[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2017，23（8）：4547

[29]楊四潤GABA普洱茶的研究[D]. 昆明：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012

[30]朱豪廣東客家黃酒中γ氨基丁酸的研究[D]. 廣州：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，2014