李瑜 馬俊 高海娜 孫瑩瑩 唐曉東 成群 徐聰

摘?要：使用水、氯化鈉、乙醇和氫氧化鈉等不同提取液分別提取堇葉碎米薺中的蛋白質(zhì)、多糖、核酸等有機(jī)硒大分子及無(wú)機(jī)硒，并采用氫化物發(fā)生-原子熒光法（HG-AFS）測(cè)定其硒含量，研究硒在堇葉碎米薺中的賦存形態(tài)及分布規(guī)律。結(jié)果表明：堇葉碎米薺不同部位硒含量分布規(guī)律為莖葉>根;葉片中有機(jī)硒的含量不僅高于無(wú)機(jī)硒，且有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率達(dá)到60%以上，硒多糖是堇葉碎米薺有機(jī)硒賦存形態(tài)的主要組成部分，占樣品總硒的28.74%，其次為硒蛋白，硒蛋白組分中水溶性蛋白結(jié)合硒含量最高，占總蛋白含硒量的 24.04% 。

關(guān)鍵詞：堇葉碎米薺;硒;賦存形態(tài);分布規(guī)律

全世界約2/3的地區(qū)屬缺硒地區(qū)，中國(guó)約有 72% 的土壤處于缺硒地帶[1-6]。目前，利用食品途徑強(qiáng)化硒元素成為功能性食品的研究熱點(diǎn)，但無(wú)機(jī)硒的亞硒酸鈉毒性高，吸收利用率低，而經(jīng)過植物轉(zhuǎn)化的硒蛋白、硒代氨基酸、硒多肽、硒多糖等有機(jī)形態(tài)硒生物活性強(qiáng)，安全無(wú)副作用，更有利于人體的吸收[7-9]。安康是目前發(fā)現(xiàn)全國(guó)面積最大天然富硒土壤區(qū)域，中硒以上水平的土壤達(dá)52%[10]。堇葉碎米薺是一種具有超富集硒能力的植物[11-12]，其嫩莖葉含有豐富的蛋白質(zhì)、可溶性糖、氨基酸、纖維素等營(yíng)養(yǎng)成分[13]。對(duì)堇葉碎米薺中的硒賦存形態(tài)的研究有利于從堇葉碎米薺中提取硒蛋白和硒多糖等大分子生物有機(jī)硒，開發(fā)補(bǔ)硒強(qiáng)化劑系列產(chǎn)品。本試驗(yàn)初步研究了堇葉碎米薺中硒的分布和賦存形態(tài)，旨在為高聚硒植物堇葉碎米薺硒產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

選擇安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院栽培高硒堇葉碎米薺，并將根部和葉部分別經(jīng)過60 ℃烘箱中烘干后用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過 80 目篩備用。

1.2?試劑

硼氫化鉀、氫氧化鉀、氯仿、正丁醇、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250等試劑均為分析純;硝酸、高氯酸、鹽酸為優(yōu)級(jí)純，水為超純水。

1.3?主要設(shè)備

AFS-830原子熒光分光光度計(jì)（配有氫化物發(fā)生器和硒空心陰極燈）、恒溫磁力攪拌器、凱氏定氮儀、紫外可見分光光度計(jì)、離心機(jī)、電子天平等。

1.4?方法

1.4.1?無(wú)機(jī)硒的提取?準(zhǔn)確稱取1.00g高硒堇葉碎米薺干粉置于250mL錐形瓶中，加30mL去離子水超聲抽提30min后小火微沸20min，再離心15min（5 000r/min）。然后取上清液用1/3提取液體積的環(huán)己烷進(jìn)行萃取，分出水相后定容至25mL后測(cè)定硒含量。

1.4.2?總可溶性蛋白的提取?準(zhǔn)確稱取5.00g高硒堇葉碎米薺干粉置于250mL三角瓶中，加50mL KH2PO4-Na2HPO4 （pH 8.5）在磁力攪拌器上提取4h，再離心15min（5 000r/min）后取上清液待用;殘?jiān)謩e用40mL和30mL浸提液重復(fù)提取、離心后合并上清液定容至200mL待用;然后吸取20mL上清液緩慢加入磨細(xì)的硫酸銨固體至飽和，于 4℃下靜置過夜后取出離心15min（5 000r/min），取沉淀用浸提液復(fù)溶后定容至25mL待測(cè)。

1.4.3 硒多糖的提取?準(zhǔn)確稱取5.00脫脂高硒堇葉碎米薺干粉放在燒杯中，加入100mL去離子水在磁力攪拌器上于80℃恒溫條件提取2h，再離心15min（50 000r/min）后取上清液。殘?jiān)?00mL去離子水重復(fù)提取后合并上清液倒入分液漏斗中，加1/3提取液體積的 Sevag試劑劇烈振蕩?kù)o置5min，分出水相后再加入1/3體積的 Sevag試劑，重復(fù)2次得到粗多糖溶液。在粗多糖溶液中加入4倍體積的95%乙醇于4℃下靜置過夜后，離心15min（5 000r/min）后取沉淀重復(fù)醇析2次，將沉淀復(fù)溶定容至50mL待測(cè)。

1.4.4?硒核酸的提取?準(zhǔn)確稱取5.00g脫脂高硒堇葉碎米薺置于250mL燒杯中，加入100mL 12%NaCl溶液于90℃水浴提取2h后離心15min（50 000r/min），取上清液，濾渣用相同方法重提1次，合并上清液后用Sevag法去蛋白，再用6 mol HCl將上清液調(diào)pH至2.5后4℃下靜置12h，使用冷凍離心機(jī)離心10min（3 000r/min）后得到核酸沉淀，將沉淀用95%乙醇淋洗3次后用12% 的NaCL溶液復(fù)溶并定容至25mL待用。

1.4.5?硒在蛋白質(zhì)中的分布?使用 Osborne分級(jí)分離方法，依次以去離子水、稀鹽、乙醇、稀堿作為提取試劑從高硒堇葉碎米薺中分離提取不同種類的蛋白質(zhì)，得到水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白四種蛋白質(zhì)組分。

1.4.6?蛋白質(zhì)含量測(cè)定?按照考馬斯亮藍(lán) G-250染色法測(cè)定高硒堇葉碎米薺中蛋白質(zhì)含量。

1.4.7?樣品多糖含量測(cè)定?采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定高硒堇葉碎米薺中多糖含量。

1.4.8?硒含量的測(cè)定?按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》（GB 5009.93—2017），采用雙道原子熒光光度計(jì)檢測(cè)硒含量指標(biāo)。。

1.4.9?數(shù)據(jù)處理?利用 Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?堇葉碎米薺不同部位硒含量分布

由表1可知，經(jīng)富硒培育的堇葉碎米薺可食部位莖葉部總硒含量高于根部，達(dá)到110.194 mg/kg，通過對(duì)堇葉碎米薺進(jìn)行無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，莖葉部有機(jī)硒含量也比根部高，從對(duì)有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化能力來看，莖葉部有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為64.10%，大于根部的53.20%，說明堇葉碎米薺莖葉部位對(duì)土壤中硒的吸收和轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)。

2.2?堇葉碎米薺中蛋白質(zhì)和多糖的含量測(cè)定

根據(jù)三次檢測(cè)結(jié)果，按回歸方程求得多糖含量為486mg/g，占干重的9.72%，總可溶性蛋白質(zhì)含量為115.365mg/g，占干重的2.3%，在堇葉碎米薺不同種類蛋白質(zhì)中，以水溶性蛋白質(zhì)含量最高，堿溶性次之，醇溶性最低（表2）。

2.3?硒在堇葉碎米薺中的賦存形態(tài)研究

從圖1可以看出，高硒堇葉碎米薺中有機(jī)硒的含量占總硒含量的64.10%，大于無(wú)機(jī)硒所占比例。有機(jī)硒組分中，多糖硒的硒含量為66.124mg/kg，占總硒的 28.74%，是堇葉碎米薺中硒的主要存在形態(tài)，其次是蛋白硒，硒含量為85.805mg/kg，占總硒的19.72%，核酸硒占總硒的8.04%，其他形態(tài)的硒占7.6%，以非蛋白硒形式存在也占有一定的比例，可能有單質(zhì)硒、小分子硒或其他大分子硒等形式存在，還有待進(jìn)一步研究。說明堇葉碎米薺中的硒主要分布在多糖中，其賦存狀態(tài)主要是與多糖結(jié)合形式存在，其次是與蛋白質(zhì)結(jié)合形式，但也有部分硒與核酸或其他形式存在。

2.4?硒在堇葉碎米薺不同蛋白組分中硒含量分析

堇葉碎米薺中蛋白質(zhì)含量雖然較多糖少，但是硒含量較高，隨著近年來蛋白硒產(chǎn)品越來越受到人們的關(guān)注和歡迎，有必要進(jìn)一步研究弄清硒在蛋白質(zhì)中的分布情況，試驗(yàn)利用不同提取液將蛋白質(zhì)分成4種組分，研究硒在蛋白質(zhì)中的分布情況。從圖2可以看出，不同種類蛋白質(zhì)結(jié)合硒量的含量為水溶性蛋白硒>堿溶性硒>鹽溶性硒>醇溶性，這說明，在利用堇葉碎米薺進(jìn)行硒蛋白產(chǎn)品開發(fā)時(shí)要多以水溶性和堿溶性蛋白的提取為主。

3?結(jié)論

堇葉碎米薺不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，還是一種富集硒能力非常強(qiáng)的植物，研究發(fā)現(xiàn)，堇葉碎米薺的莖葉部比根部更利于吸收、轉(zhuǎn)化土壤中硒元素，可以作為有機(jī)硒的載體進(jìn)行有機(jī)硒產(chǎn)品的開發(fā);同時(shí)，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也能看到，多糖硒是堇葉碎米薺最主要的有機(jī)硒形態(tài)，其次是蛋白硒，水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白以及堿溶性蛋白都能結(jié)合堇葉碎米薺中一定量的硒元素，但是以水溶性、堿溶性蛋白硒形式存在的硒組分最多。

多糖具有多種藥用生理活性，除了比較廣泛的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤生物活性外，還具有降血糖、防癌治癌、抗衰老等作用。因此，將硒與多糖的有機(jī)結(jié)合得到的有機(jī)硒化合物硒多糖，可使硒和多糖的生理和藥理功能得到充分優(yōu)化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，堇葉碎米薺的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化能力并不是很高，這可能與培育高硒堇葉碎米薺時(shí)選擇的硒源、栽培時(shí)間短等有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)?！?/p>

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