徐騰 劉睿 李林 王天星 李迪 劉欣然 李勇

摘 要：目的：研究牛骨膠原低聚肽對正常小鼠傷口愈合的影響及探討其可能作用機(jī)制。方法：SPF級ICR雄性小鼠240只，隨機(jī)分為1個(gè)對照組和5個(gè)BCOPs劑量組（0.375、0.75、1.5、3.0、6.0g/kg·BW）。用打孔器建立皮膚打孔手術(shù)模型，術(shù)后連續(xù)灌胃16 d，并在術(shù)后第4、8、12、16 d分批處死老鼠，測量不同時(shí)間點(diǎn)小鼠傷口剩余面積，檢測血清中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1α）濃度，并進(jìn)行HE染色行病理組織學(xué)觀察。結(jié)果：與對照組相比，牛骨膠原低聚肽組小鼠術(shù)后傷口面積明顯縮?。≒<0.05），血清SDF-1α濃度顯著增加（P<0.05）。并且同一時(shí)間點(diǎn)HE染色顯示，牛骨膠原低聚肽組小鼠皮膚傷口上皮化水平、血管增生及纖維母細(xì)胞水平均優(yōu)于對照組。結(jié)論：牛骨膠原低聚肽具有促進(jìn)小鼠術(shù)后傷口愈合的作用，其機(jī)制可能與提高血清SDF-1α濃度有關(guān)。

關(guān)鍵詞：牛骨膠原低聚肽;傷口愈合;基質(zhì)細(xì)胞衍生因子;小分子生物活性肽

傷口愈合是一個(gè)由多細(xì)胞、多分子參與的精細(xì)修復(fù)過程，并且細(xì)胞之間必須相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用[1-2]。當(dāng)皮膚受損后，傷口愈合進(jìn)程也迅速開始，主要包括凝血期、炎癥期、增生期和重塑期，這四個(gè)階段連續(xù)發(fā)生并又相互交錯(cuò)[3]。在凝血期，凝血系統(tǒng)被激活后，血小板在受損部位聚集;在炎癥期，可以觀察到如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等白細(xì)胞;增生期則以纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的遷移與增生，最終導(dǎo)致上皮血管再生，形成肉芽組織為主要特征;重塑期持續(xù)時(shí)間較長，過量的膠原被多種蛋白水解酶降解，完成組織修復(fù)[4-6]。很多情形下，創(chuàng)傷需要快速愈合，例如燒傷、外科創(chuàng)傷、糖尿病褥瘡等[7]。因此，有必要尋找一種能夠讓傷口快速愈合、增加患者舒適、減少創(chuàng)傷后遺癥的藥物或功能性食品[8]。

研究表明，小分子生物活性肽（BAP）可明顯改善氮吸收，提高內(nèi)臟蛋白水平，增加體重，改善患者的免疫功能，且不會(huì)造成病人腸道不耐受，是臨床營養(yǎng)制劑的良好原料。研究發(fā)現(xiàn)，海參肽、人參肽等小分子肽在抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和傷口愈合等方面有著重要作用[9-10]?，F(xiàn)階段對于提取自牛骨的肽類物質(zhì)報(bào)道大多局限在對提取工藝的研究上，尚缺乏對其功能和應(yīng)用方面的研究報(bào)道[11-12]。本研究采用皮膚打孔手術(shù)模型，研究一種提取自牛骨骼的小分子肽類物質(zhì)即牛骨膠原低聚肽（BCOPs）對傷口愈合的促進(jìn)作用及其可能機(jī)制，為BCOPs在作為促進(jìn)傷口愈合功能性因子的保健食品及藥品的開發(fā)方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

BCOPs，為淡白色固體粉末，經(jīng)凱氏定氮儀測定肽含量為92.77 g/100 g、酸溶蛋白含量為95.5 g/100 g。利用高效液相色譜儀分析其游離氨基酸組成可知，氨基酸總量占2.73%，其中精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸較多。本樣品購自北京天肽生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

4%水合氯醛、青霉素G、4%甲醛溶液;6 mm打孔器、Adventurer TM 通用分析天平（美國奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）、立式熒光顯微鏡（日本尼康公司，NIKON E400）、尼康D7200單反相機(jī)（日本尼康公司）、Eppendorf 高速冷凍離心機(jī)（德國艾本德股份公司）、電熱恒溫水浴鍋（北京天林恒泰科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

為排除雌激素的作用，本研究從北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買了240只6～8周齡，體質(zhì)量為18～22 g的 ICR雄性小鼠（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（京）2011-0039;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0012）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房自由飲食。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室條件符合國標(biāo)清潔級標(biāo)準(zhǔn)，溫度范圍為（25±1）℃，相對濕度為50%～60%，室內(nèi)照明控制在12h/12h明暗周期節(jié)律。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)隨機(jī)分組原則，將240只小鼠按體重隨機(jī)分為6個(gè)干預(yù)劑量組：1個(gè)對照組和5個(gè)BCOPs劑量組（0.375、0.75、1.5、3.0、6.0 g/kg·BW），分別對應(yīng)BCOPs（0.375）、BCOPs（0.75）、BCOPs（1.5）、BCOPs（3.0）、BCOPs（6.0）。每個(gè)干預(yù)劑量組再隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)亞組（n=10），在術(shù)后4、8、12、16 d依次對4個(gè)亞組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行內(nèi)眥取血、取樣。

1.4.2 皮膚打孔手術(shù)模型的建立 4%水合氯醛腹腔麻醉小鼠后，剃干凈小鼠背部毛發(fā)，用聚維酮碘和乙醇消毒后，使用4 mm打孔器在小鼠背部中線相距1cm處鉆取全層皮膚，不傷及肌肉層，單側(cè)孔相距1.5 cm，注射青霉素G（1 000 IU/g·體重）以防止感染。術(shù)后禁食6h，正常飲水。將手術(shù)當(dāng)天記為術(shù)后0 d（POD 0），術(shù)后6 h進(jìn)行受試物干預(yù)，每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品。其中對照組給予蒸餾水，5個(gè)BCOPs劑量組依次灌胃給予相應(yīng)濃度受試物，灌胃量為1 mL/100 g，干預(yù)時(shí)間為16 d。在實(shí)驗(yàn)期間密切觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況，包括毛色、精神狀態(tài)、日?；顒?dòng)情況等。

1.4.3 傷口愈合率觀察 在術(shù)后1、3、5、7、11、15 d給傷口拍攝照片;同時(shí)描摹傷口剩余面積，經(jīng)掃描儀掃描之后，使用Photoshop軟件計(jì)算傷口處像素點(diǎn)，等比例換算出面積，像素與實(shí)際面積比約為138∶1。

1.4.4 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1α）測量 在術(shù)后4、8、12、16 d經(jīng)內(nèi)眥采血分批處死小鼠，留取血清，用ELISA法測定血清SDF-1α濃度。

1.4.5 病理觀察 在術(shù)后8 d取小鼠傷口邊緣3 mm皮膚留存，經(jīng)4%甲醛溶液固定，行HE染色。在光鏡下進(jìn)行觀察傷口上皮化、纖維母細(xì)胞增生情況，并拍攝照片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。連續(xù)變量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行組間的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，方差不齊者以Dunnetts T3法對多組均數(shù)進(jìn)行post-hoc分析。使用graphpad prism 5繪制圖表。確定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況

實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠未死亡現(xiàn)象，正常進(jìn)食、飲水，生長、活動(dòng)未見異常，毛色、精神狀況未見異常。

2.2 傷口愈合觀察

2.2.1 肉眼觀察 傷口愈合良好，未出現(xiàn)紅腫、積血、積液等不良反應(yīng)，術(shù)后15 d，可見傷口基本填平，傷口面積縮小，傷口顏色逐漸向正常皮膚組織轉(zhuǎn)變（圖1）。

2.2.2 牛骨膠原低聚肽對皮膚傷口大小的影響 如表1所示，術(shù)后3 d，BCOPs劑量組傷口剩余面積均小于對照組，其中BCOPs（0.375、0.75、1.5）劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;術(shù)后7d，BCOPs劑量組傷口剩余面積均比對照組小，所有劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示牛骨肽使傷口愈合進(jìn)程加快;術(shù)后15 d，BCOPs劑量組傷口剩余面積均小于對照組，BCOPs（0.375、0.75、1.5、3.0）劑量組與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。圖2為術(shù)后傷口剩余面積隨時(shí)間變化的折線圖。

2.3 牛骨膠原低聚肽對小鼠血清SDF-1α濃度的影響

如表2所示，在術(shù)后4、8、12 d，BCOPs各劑量組小鼠血清中SDF-1α濃度均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后16 d，BCOPs各劑量組小鼠血清中SDF-1α濃度平均值均高于對照組，其中BCOPs（1.5、3.0、6.0）劑量組小鼠血清中SDF-1α濃度高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 皮膚打孔手術(shù)模型HE染色觀察

如圖3所示，對照組傷口上皮化較差，皮膚表皮層斷裂不連續(xù)，同時(shí)纖維母細(xì)胞增生較少，血管數(shù)量較少;BCOPs（0.375）劑量組皮膚表皮連續(xù)，表皮層增厚，纖維母細(xì)胞數(shù)量增多;BCOPs（0.75）劑量組鏡下可見纖維母細(xì)胞分化，胞漿較少，核變長，血管較多;BCOPs（1.5）劑量組鏡下可見基底細(xì)胞緊密排列，真皮層膠原纖維趨于整齊;BCOPs（3.0）劑量組鏡下可以發(fā)現(xiàn)膠原纖維排列整齊，上皮化良好，表皮層較厚，并且開始出現(xiàn)毛囊;BCOPs（6.0）劑量組鏡下可見皮下組織分化良好的細(xì)胞。

3 討論

傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，是機(jī)體對損傷刺激的生理反應(yīng)，其迅速開始于創(chuàng)傷發(fā)生后[6]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)外傷時(shí)，血管收縮，血小板在受損部位聚集，并釋放生長因子吸引炎癥細(xì)胞;同時(shí)，凝血系統(tǒng)被激活后產(chǎn)生了凝血酶，促進(jìn)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。在之后的2～3 d內(nèi)，多種炎癥細(xì)胞在傷口趨化和聚集，在吞噬入侵細(xì)菌的同時(shí)也會(huì)釋放出多種生長因子。傷口愈合的增生期通常發(fā)生在創(chuàng)傷發(fā)生后的7～14 d，增生期是創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵階段，特征之一便是上皮化[5]。在此期間，多種細(xì)胞增殖速度增加，多種生長因子發(fā)揮重要作用[13-15]。其后傷口愈合組織的重塑期和細(xì)胞增殖階段彼此重疊，其過程可達(dá)數(shù)年甚至終生。目前，針對肽對促進(jìn)傷口愈合作用的研究較少，劉悅等[16]、黃亞增等[17]研究發(fā)現(xiàn)，豬骨多肽在一定程度上可以抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠蛋清性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)，并能夠抑制棉球肉芽腫的滲出及抑制其增生，可應(yīng)用于防治風(fēng)濕、類風(fēng)濕疾病，并且在骨折修復(fù)、骨質(zhì)疏松方面也有一定作用。

本研究以蒸餾水作為對照，采用皮膚打孔手術(shù)模型，鉆取小鼠背部兩側(cè)直徑4 mm的全層皮膚，來探討B(tài)COPs對術(shù)后的傷口愈合是否具有促進(jìn)作用，結(jié)果顯示，術(shù)后3 d，BCOPs（0.375、0.75、1.5）劑量組傷口剩余面積小于對照組（P<0.05）;術(shù)后7 d，所有BCOPs干預(yù)組的傷口剩余面積明顯小于對照組（P<0.05），這表明BCOPs劑量組的傷口愈合情況明顯優(yōu)于對照組，提示BCOPs對于傷口愈合具有一定的促進(jìn)作用。與此同時(shí)，本研究繪制了術(shù)后小鼠傷口剩余面積隨時(shí)間變化的折線圖，可見BCOPs（0.75）劑量組在術(shù)后0～11 d具有較快的愈合速度。對傷口剩余面積的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，傷口剩余面積會(huì)在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生較大變化，對照組約發(fā)生在術(shù)后7 d，BCOPs劑量組有所提前，約發(fā)生在術(shù)后5 d。根據(jù)手術(shù)后15 d結(jié)果，BCOPs（6.0）劑量組小鼠傷口剩余面積與對照組相比無顯著性差異，從折線圖也未見其傷口愈合速度明顯快于對照組，因此初步推測高劑量組在傷口愈合后期作用并不明顯。

有研究顯示，SDF-1α不僅具有促血管生成作用[18]，還可以增加外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能，繼而改善內(nèi)皮修復(fù)能力，維持內(nèi)皮損傷和修復(fù)之間的動(dòng)態(tài)平衡，恢復(fù)及改善內(nèi)皮功能[19]。對不同時(shí)期小鼠血清中SDF-1α的濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后4、8、12 d，BCOPs劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清SDF-1α的濃度與對照組相比，均明顯升高（P<0.05）。BCOPs能夠促進(jìn)SDF-1α的分泌，從而促進(jìn)血管生成，改善內(nèi)皮修復(fù)能力，這也可能是BCOPs對傷口愈合具有促進(jìn)作用的機(jī)制之一。傷口愈合增生期約發(fā)生在創(chuàng)傷造成的7 d后[20]。本研究在術(shù)后8 d觀察傷口組織病理情況，在BCOPs劑量組中發(fā)現(xiàn)大量上皮化、血管增生以及纖維母細(xì)胞分化的證據(jù)，以上發(fā)現(xiàn)也說明了BCOPs具有一定的促進(jìn)傷口愈合的作用。

綜上所述，本研究通過建立小鼠傷口模型，探討B(tài)COPs對傷口愈合是否具有促進(jìn)作用，結(jié)果顯示，BCOPs可以有效促進(jìn)小鼠傷口愈合，縮短傷口愈合周期，其可能的機(jī)制之一是通過促進(jìn)SDF-1α的分泌從而促進(jìn)血管生成，加快傷口愈合。傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，BCOPs對于促進(jìn)傷口愈合的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Atiyeh BS，Ioannovich J，Al-Amm CA，et al.Management of acute and chronic open wounds：the importance of moist environment in optimal wound healing[J].Curr Pharm Biotechnol，2002，3（3）：179-195.

[2]Kasuya A，Tokura Y.Attempts to accelerate wound healing[J].J Dermatol Sci，2014，76（3）：169-172.

[3]Darestani KD，Mirghazanfari SM，Moghaddam KG，et al. Leech therapy for linear incisional skin-wound healing in rats[J].J Acupunct Meridian Stud，2014，7（4）：194-201.

[4]Tanno H，Kawakami K，Ritsu M，et al.Contribution of invariant natural killer T cells to skin wound healing[J].Am J Pathol，2015，185（12）：3248-3257.

[5]柏書博.小鼠放創(chuàng)復(fù)合傷傷口愈合延遲機(jī)理研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2011.

[6]張靜，張仲，胡永清，等.傷口愈合的研究進(jìn)展[J].中華骨科雜志，2005，25（1）：58-60.

[7]Kandhare AD，Alam J，Patil MV，et al.Wound healing potential of naringin ointment formulation via regulating the expression of inflammatory，apoptotic and growth mediators in experimental rats[J].Pharm Biol，2016，54（3）：419-432.

[8]Bowler PG.Wound pathophysiology，infection and therapeutic options[J].Ann Med，2002，34（6）：419-427.

[9]劉睿，任金威，陳啟賀，等.人參低聚肽對急性酒精性肝損傷大鼠的保護(hù)作用[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，43（15）：2820-2824.

[10]何麗霞，陳啟賀，劉睿，等.海參寡肽海參寡肽：免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究[J].科技導(dǎo)報(bào)，2016，34（11）：42-47.

[11]何蘭.牛骨膠原蛋白的提取及復(fù)合海綿的制備研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[12]付文雯，馬美湖，蔡朝霞.牛骨蛋白酶解制取肽鈣的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵科技，2009，45（1）：1-5.

[13]Smith PD，Kuhn MA，F(xiàn)ranz MG，et al.Initiating the inflammatory phase of incisional healing prior to tissue injury[J].J Surg Res，2000，92（1）：11-17.

[14]Stadelmann WK，Digenis AG，Tobin GR.Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds[J].Am J Surg，1998，176（2A Suppl）：26S-38S.

[15]鐵璐，伊利夏提·肖開提，王憲，等.糖尿病傷口愈合的分子機(jī)制[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2010，41（6）：407-412.

[16]劉悅，吳剛，李磊.骨肽注射液治療中老年骨質(zhì)疏松癥療效觀察[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，10（6）：404-405.

[17]黃亞增，侯思恩，趙紅英，等.骨肽注射液（古欣肽）在四肢骨折合并腫脹病人的療效觀察[J].海峽藥學(xué)，2004，16（4）：99-101.

[18]馮帥南，王莎莉，朱方強(qiáng)，等.基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的新血管形成[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（11）：2019-2023.

[19]鄭浩.基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1a對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響及其機(jī)制探討[D].杭州：浙江大學(xué)，2008.

[20]Stadelmann WK，Digenis AG，Tobin GR.Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds[J].Am J Surg，1998，176（2A Suppl）：26S-38S.

Abstract：ObjectiveTo investigate the influence and mechanism of bovine collagen oligopeptide on wound healing in mice.MethodA total of 240 ICR mice were randomly assigned to 6 groups，including a control group and 5 bovine collagen oligopeptide intervention groups （0.375、0.75、1.5、3.0、6.0g/kg·BW）.And each group was randomly assigned to 4 subgroups.The mice were carried out by mice stomach-lavaging continuously for 16 days after excisional wound model.And the mice would be sacrificed separately at day 4，day8，day12 and day 16.Wound closure was assayed，and the serum SDF-1α parameter was conducted.After fixation of the skin biopsy samples in 4% formalin，they were embedded in paraffin and stained with HE.ResultWe found that bovine collagen oligopeptide treatment could significantly decrease the wound region （P<0.05）and increase the secret of SDF-1α （P<0.05）.ConclusionThese findings suggest that bovine collagen oligopeptide have an obvious promote on wound healing and the underlying mechanism may be related to enhancing SDF-1α.

Keywords：bovine collagen oligopeptide（BCOPs）;wound healing;SDF-1α;BAP

（責(zé)任編輯 李婷婷）