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        牛骨膠原低聚肽對小鼠傷口愈合作用的研究

        2020-09-10 07:22:44徐騰劉睿李林王天星李迪劉欣然李勇
        中國食物與營養(yǎng) 2020年6期
        關(guān)鍵詞:傷口愈合

        徐騰 劉睿 李林 王天星 李迪 劉欣然 李勇

        摘 要:目的:研究牛骨膠原低聚肽對正常小鼠傷口愈合的影響及探討其可能作用機制。方法:SPF級ICR雄性小鼠240只,隨機分為1個對照組和5個BCOPs劑量組(0.375、0.75、1.5、3.0、6.0g/kg·BW)。用打孔器建立皮膚打孔手術(shù)模型,術(shù)后連續(xù)灌胃16 d,并在術(shù)后第4、8、12、16 d分批處死老鼠,測量不同時間點小鼠傷口剩余面積,檢測血清中基質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1α)濃度,并進行HE染色行病理組織學觀察。結(jié)果:與對照組相比,牛骨膠原低聚肽組小鼠術(shù)后傷口面積明顯縮?。≒<0.05),血清SDF-1α濃度顯著增加(P<0.05)。并且同一時間點HE染色顯示,牛骨膠原低聚肽組小鼠皮膚傷口上皮化水平、血管增生及纖維母細胞水平均優(yōu)于對照組。結(jié)論:牛骨膠原低聚肽具有促進小鼠術(shù)后傷口愈合的作用,其機制可能與提高血清SDF-1α濃度有關(guān)。

        關(guān)鍵詞:牛骨膠原低聚肽;傷口愈合;基質(zhì)細胞衍生因子;小分子生物活性肽

        傷口愈合是一個由多細胞、多分子參與的精細修復過程,并且細胞之間必須相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用[1-2]。當皮膚受損后,傷口愈合進程也迅速開始,主要包括凝血期、炎癥期、增生期和重塑期,這四個階段連續(xù)發(fā)生并又相互交錯[3]。在凝血期,凝血系統(tǒng)被激活后,血小板在受損部位聚集;在炎癥期,可以觀察到如巨噬細胞、中性粒細胞等白細胞;增生期則以纖維母細胞、內(nèi)皮細胞等的遷移與增生,最終導致上皮血管再生,形成肉芽組織為主要特征;重塑期持續(xù)時間較長,過量的膠原被多種蛋白水解酶降解,完成組織修復[4-6]。很多情形下,創(chuàng)傷需要快速愈合,例如燒傷、外科創(chuàng)傷、糖尿病褥瘡等[7]。因此,有必要尋找一種能夠讓傷口快速愈合、增加患者舒適、減少創(chuàng)傷后遺癥的藥物或功能性食品[8]。

        研究表明,小分子生物活性肽(BAP)可明顯改善氮吸收,提高內(nèi)臟蛋白水平,增加體重,改善患者的免疫功能,且不會造成病人腸道不耐受,是臨床營養(yǎng)制劑的良好原料。研究發(fā)現(xiàn),海參肽、人參肽等小分子肽在抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和傷口愈合等方面有著重要作用[9-10]?,F(xiàn)階段對于提取自牛骨的肽類物質(zhì)報道大多局限在對提取工藝的研究上,尚缺乏對其功能和應用方面的研究報道[11-12]。本研究采用皮膚打孔手術(shù)模型,研究一種提取自牛骨骼的小分子肽類物質(zhì)即牛骨膠原低聚肽(BCOPs)對傷口愈合的促進作用及其可能機制,為BCOPs在作為促進傷口愈合功能性因子的保健食品及藥品的開發(fā)方面提供科學依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 樣本

        BCOPs,為淡白色固體粉末,經(jīng)凱氏定氮儀測定肽含量為92.77 g/100 g、酸溶蛋白含量為95.5 g/100 g。利用高效液相色譜儀分析其游離氨基酸組成可知,氨基酸總量占2.73%,其中精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸較多。本樣品購自北京天肽生物科技有限公司。

        1.2 主要試劑與儀器

        4%水合氯醛、青霉素G、4%甲醛溶液;6 mm打孔器、Adventurer TM 通用分析天平(美國奧豪斯國際貿(mào)易有限公司)、立式熒光顯微鏡(日本尼康公司,NIKON E400)、尼康D7200單反相機(日本尼康公司)、Eppendorf 高速冷凍離心機(德國艾本德股份公司)、電熱恒溫水浴鍋(北京天林恒泰科技有限公司)。

        1.3 實驗動物

        為排除雌激素的作用,本研究從北京大學醫(yī)學部實驗動物中心購買了240只6~8周齡,體質(zhì)量為18~22 g的 ICR雄性小鼠(動物合格證號:SCXK(京)2012-0001;實驗動物許可證號:SYXK(京)2011-0039;實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2011-0012)。實驗動物房自由飲食。飼養(yǎng)實驗室條件符合國標清潔級標準,溫度范圍為(25±1)℃,相對濕度為50%~60%,室內(nèi)照明控制在12h/12h明暗周期節(jié)律。

        1.4 方法

        1.4.1 實驗動物分組 動物適應性喂養(yǎng)1周后,根據(jù)隨機分組原則,將240只小鼠按體重隨機分為6個干預劑量組:1個對照組和5個BCOPs劑量組(0.375、0.75、1.5、3.0、6.0 g/kg·BW),分別對應BCOPs(0.375)、BCOPs(0.75)、BCOPs(1.5)、BCOPs(3.0)、BCOPs(6.0)。每個干預劑量組再隨機分為4個實驗亞組(n=10),在術(shù)后4、8、12、16 d依次對4個亞組的實驗動物進行內(nèi)眥取血、取樣。

        1.4.2 皮膚打孔手術(shù)模型的建立 4%水合氯醛腹腔麻醉小鼠后,剃干凈小鼠背部毛發(fā),用聚維酮碘和乙醇消毒后,使用4 mm打孔器在小鼠背部中線相距1cm處鉆取全層皮膚,不傷及肌肉層,單側(cè)孔相距1.5 cm,注射青霉素G(1 000 IU/g·體重)以防止感染。術(shù)后禁食6h,正常飲水。將手術(shù)當天記為術(shù)后0 d(POD 0),術(shù)后6 h進行受試物干預,每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品。其中對照組給予蒸餾水,5個BCOPs劑量組依次灌胃給予相應濃度受試物,灌胃量為1 mL/100 g,干預時間為16 d。在實驗期間密切觀察實驗動物的一般情況,包括毛色、精神狀態(tài)、日?;顒忧闆r等。

        1.4.3 傷口愈合率觀察 在術(shù)后1、3、5、7、11、15 d給傷口拍攝照片;同時描摹傷口剩余面積,經(jīng)掃描儀掃描之后,使用Photoshop軟件計算傷口處像素點,等比例換算出面積,像素與實際面積比約為138∶1。

        1.4.4 基質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1α)測量 在術(shù)后4、8、12、16 d經(jīng)內(nèi)眥采血分批處死小鼠,留取血清,用ELISA法測定血清SDF-1α濃度。

        1.4.5 病理觀察 在術(shù)后8 d取小鼠傷口邊緣3 mm皮膚留存,經(jīng)4%甲醛溶液固定,行HE染色。在光鏡下進行觀察傷口上皮化、纖維母細胞增生情況,并拍攝照片。

        1.5 統(tǒng)計學處理

        用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。連續(xù)變量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示,行單因素方差分析,采用LSD法進行組間的統(tǒng)計檢驗,方差不齊者以Dunnetts T3法對多組均數(shù)進行post-hoc分析。使用graphpad prism 5繪制圖表。確定P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 實驗動物一般情況

        實驗期間各組小鼠未死亡現(xiàn)象,正常進食、飲水,生長、活動未見異常,毛色、精神狀況未見異常。

        2.2 傷口愈合觀察

        2.2.1 肉眼觀察 傷口愈合良好,未出現(xiàn)紅腫、積血、積液等不良反應,術(shù)后15 d,可見傷口基本填平,傷口面積縮小,傷口顏色逐漸向正常皮膚組織轉(zhuǎn)變(圖1)。

        2.2.2 牛骨膠原低聚肽對皮膚傷口大小的影響 如表1所示,術(shù)后3 d,BCOPs劑量組傷口剩余面積均小于對照組,其中BCOPs(0.375、0.75、1.5)劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);術(shù)后7d,BCOPs劑量組傷口剩余面積均比對照組小,所有劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示牛骨肽使傷口愈合進程加快;術(shù)后15 d,BCOPs劑量組傷口剩余面積均小于對照組,BCOPs(0.375、0.75、1.5、3.0)劑量組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。圖2為術(shù)后傷口剩余面積隨時間變化的折線圖。

        2.3 牛骨膠原低聚肽對小鼠血清SDF-1α濃度的影響

        如表2所示,在術(shù)后4、8、12 d,BCOPs各劑量組小鼠血清中SDF-1α濃度均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術(shù)后16 d,BCOPs各劑量組小鼠血清中SDF-1α濃度平均值均高于對照組,其中BCOPs(1.5、3.0、6.0)劑量組小鼠血清中SDF-1α濃度高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

        2.4 皮膚打孔手術(shù)模型HE染色觀察

        如圖3所示,對照組傷口上皮化較差,皮膚表皮層斷裂不連續(xù),同時纖維母細胞增生較少,血管數(shù)量較少;BCOPs(0.375)劑量組皮膚表皮連續(xù),表皮層增厚,纖維母細胞數(shù)量增多;BCOPs(0.75)劑量組鏡下可見纖維母細胞分化,胞漿較少,核變長,血管較多;BCOPs(1.5)劑量組鏡下可見基底細胞緊密排列,真皮層膠原纖維趨于整齊;BCOPs(3.0)劑量組鏡下可以發(fā)現(xiàn)膠原纖維排列整齊,上皮化良好,表皮層較厚,并且開始出現(xiàn)毛囊;BCOPs(6.0)劑量組鏡下可見皮下組織分化良好的細胞。

        3 討論

        傷口愈合是一個復雜的過程,是機體對損傷刺激的生理反應,其迅速開始于創(chuàng)傷發(fā)生后[6]。當機體出現(xiàn)外傷時,血管收縮,血小板在受損部位聚集,并釋放生長因子吸引炎癥細胞;同時,凝血系統(tǒng)被激活后產(chǎn)生了凝血酶,促進纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。在之后的2~3 d內(nèi),多種炎癥細胞在傷口趨化和聚集,在吞噬入侵細菌的同時也會釋放出多種生長因子。傷口愈合的增生期通常發(fā)生在創(chuàng)傷發(fā)生后的7~14 d,增生期是創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵階段,特征之一便是上皮化[5]。在此期間,多種細胞增殖速度增加,多種生長因子發(fā)揮重要作用[13-15]。其后傷口愈合組織的重塑期和細胞增殖階段彼此重疊,其過程可達數(shù)年甚至終生。目前,針對肽對促進傷口愈合作用的研究較少,劉悅等[16]、黃亞增等[17]研究發(fā)現(xiàn),豬骨多肽在一定程度上可以抑制實驗性大鼠蛋清性關(guān)節(jié)炎的炎性反應,并能夠抑制棉球肉芽腫的滲出及抑制其增生,可應用于防治風濕、類風濕疾病,并且在骨折修復、骨質(zhì)疏松方面也有一定作用。

        本研究以蒸餾水作為對照,采用皮膚打孔手術(shù)模型,鉆取小鼠背部兩側(cè)直徑4 mm的全層皮膚,來探討B(tài)COPs對術(shù)后的傷口愈合是否具有促進作用,結(jié)果顯示,術(shù)后3 d,BCOPs(0.375、0.75、1.5)劑量組傷口剩余面積小于對照組(P<0.05);術(shù)后7 d,所有BCOPs干預組的傷口剩余面積明顯小于對照組(P<0.05),這表明BCOPs劑量組的傷口愈合情況明顯優(yōu)于對照組,提示BCOPs對于傷口愈合具有一定的促進作用。與此同時,本研究繪制了術(shù)后小鼠傷口剩余面積隨時間變化的折線圖,可見BCOPs(0.75)劑量組在術(shù)后0~11 d具有較快的愈合速度。對傷口剩余面積的進一步分析發(fā)現(xiàn),傷口剩余面積會在某個時間點發(fā)生較大變化,對照組約發(fā)生在術(shù)后7 d,BCOPs劑量組有所提前,約發(fā)生在術(shù)后5 d。根據(jù)手術(shù)后15 d結(jié)果,BCOPs(6.0)劑量組小鼠傷口剩余面積與對照組相比無顯著性差異,從折線圖也未見其傷口愈合速度明顯快于對照組,因此初步推測高劑量組在傷口愈合后期作用并不明顯。

        有研究顯示,SDF-1α不僅具有促血管生成作用[18],還可以增加外周血內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量和功能,繼而改善內(nèi)皮修復能力,維持內(nèi)皮損傷和修復之間的動態(tài)平衡,恢復及改善內(nèi)皮功能[19]。對不同時期小鼠血清中SDF-1α的濃度進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),在術(shù)后4、8、12 d,BCOPs劑量組實驗動物血清SDF-1α的濃度與對照組相比,均明顯升高(P<0.05)。BCOPs能夠促進SDF-1α的分泌,從而促進血管生成,改善內(nèi)皮修復能力,這也可能是BCOPs對傷口愈合具有促進作用的機制之一。傷口愈合增生期約發(fā)生在創(chuàng)傷造成的7 d后[20]。本研究在術(shù)后8 d觀察傷口組織病理情況,在BCOPs劑量組中發(fā)現(xiàn)大量上皮化、血管增生以及纖維母細胞分化的證據(jù),以上發(fā)現(xiàn)也說明了BCOPs具有一定的促進傷口愈合的作用。

        綜上所述,本研究通過建立小鼠傷口模型,探討B(tài)COPs對傷口愈合是否具有促進作用,結(jié)果顯示,BCOPs可以有效促進小鼠傷口愈合,縮短傷口愈合周期,其可能的機制之一是通過促進SDF-1α的分泌從而促進血管生成,加快傷口愈合。傷口愈合是一個復雜的過程,BCOPs對于促進傷口愈合的具體機制仍有待進一步探索研究。

        參考文獻

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        Abstract:ObjectiveTo investigate the influence and mechanism of bovine collagen oligopeptide on wound healing in mice.MethodA total of 240 ICR mice were randomly assigned to 6 groups,including a control group and 5 bovine collagen oligopeptide intervention groups (0.375、0.75、1.5、3.0、6.0g/kg·BW).And each group was randomly assigned to 4 subgroups.The mice were carried out by mice stomach-lavaging continuously for 16 days after excisional wound model.And the mice would be sacrificed separately at day 4,day8,day12 and day 16.Wound closure was assayed,and the serum SDF-1α parameter was conducted.After fixation of the skin biopsy samples in 4% formalin,they were embedded in paraffin and stained with HE.ResultWe found that bovine collagen oligopeptide treatment could significantly decrease the wound region (P<0.05)and increase the secret of SDF-1α (P<0.05).ConclusionThese findings suggest that bovine collagen oligopeptide have an obvious promote on wound healing and the underlying mechanism may be related to enhancing SDF-1α.

        Keywords:bovine collagen oligopeptide(BCOPs);wound healing;SDF-1α;BAP

        (責任編輯 李婷婷)

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