千維娜 李 治 李仁廷 趙艷莉 王院春 任 革 曹 茜

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，咸陽市 712000，電子郵箱：huangdd454aa@163.com；2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽市 712000)

在我國，每10萬人即有4.3名乳腺癌患者，全世界每年大約有50萬人死于乳腺癌，同時其發(fā)病率漸趨升高，且發(fā)病年齡漸趨低齡化[1]。放療是乳腺癌的治療方法之一，但其療效受很多因素制約，如對放射線的抵抗、放療后復(fù)發(fā)以及對正常細(xì)胞組織的毒副反應(yīng)等[2]。培元抗癌湯具有活血化瘀的功效，以及抑制腫瘤增長及轉(zhuǎn)移、防止復(fù)發(fā)的作用[3]。研究表明，培元抗癌湯能通過調(diào)節(jié)淋巴B細(xì)胞，B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長；其還能通過調(diào)控Bcl-2和Bax的表達(dá)來抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-468的增殖[4]。目前，培元抗癌湯體內(nèi)抗乳腺癌的分子機制尚未完全清楚。為此，本研究建立MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，探討培元抗癌湯的體內(nèi)抗癌活性，為相關(guān)藥物研發(fā)提供藥理學(xué)依據(jù)，也為臨床治療該病提供探索策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動物 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購自復(fù)旦大學(xué)上海細(xì)胞庫。無特定病原體級BALB/c-nu雌性裸鼠30只，5～6周齡，體質(zhì)量17～20 g，購自上海杰斯捷實驗動物有限公司[許可證號：SCXK(滬)2013-0006]。按照無特定病原體級飼養(yǎng)條件，將所有小鼠在實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，正常進(jìn)食、飲水。

1.2 藥品 培元抗癌湯由西洋參、白花蛇舌草、炒白術(shù)、黃芪、土茯苓、仙鶴草、炙甘草等組成。生藥均購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，于冷水中浸泡2 h后加熱煮沸2 h，濾液，再加入冷水加熱煮沸1.5 h，濾液，將兩次濾液混合，混合后的濾液放置水浴鍋中制備煎劑(生藥含量為3.0 g/mL)，高溫消毒后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｗ⑸溆玫臑跛舅?廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號：H19990134)。

1.3 主要試劑與儀器 胎牛血清(Lonsera公司，批號：NU12982)；伊戈爾最低必需培養(yǎng)基(Eagle′s minimum essential medium,EMEM)(艾美捷科技有限公司，批號：MEL06)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：20150516)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)裂解液(碧云天生物技術(shù)公司，批號：P0013G)；二喹啉甲酸蛋白試劑盒(碧云天公司，批號：P0011)；β肌動蛋白(β-actin)、Bax、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-9抗體(Affinity公司，批號： AF7028、AF0150、AF6388)；Bcl-2、Caspase-7抗體(Abcam公司，批號：ab42128、ab72529)。HERAcell VIOS 160i型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);Universal Hood Ⅱ型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國伯樂公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基，于室溫、無菌并含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長到融合度近80%后，更換培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)[5]。

1.5 動物實驗

1.5.1 模型建立：取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，用生理鹽水制成細(xì)胞懸液，并將其濃度調(diào)整到2.5×107個/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩處皮下注射200 μL細(xì)胞懸液，建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型。測量腫瘤的長徑(a)和縱徑(b)，計算腫瘤體積(V)[6]，V=πab2/6。每隔2 d記錄裸鼠的體重及腫瘤的體積，直到裸鼠的腫瘤體積達(dá)到100 mm3。

1.5.2 分組及給藥：將達(dá)到建模標(biāo)準(zhǔn)的30只載瘤鼠，按隨機數(shù)字表分為對照組、低劑量組(200 mg/kg)、中劑量組(300 mg/kg)和高劑量組(400 mg/kg)和陽性對照組(3 mg/kg)，每組6只。各劑量組載瘤鼠給予相應(yīng)劑量的培元抗癌湯灌胃，陽性對照組經(jīng)載瘤鼠的腋窩皮下注射烏司他丁3 mg/kg，均1次/d，連續(xù)給藥21 d。對照組不做任何干預(yù)治療。給藥劑量的折算參照《藥理實驗方法學(xué)》[7]。記錄實驗中各組載瘤鼠死亡情況。

1.5.3 載瘤鼠乳腺癌抑制率的計算：連續(xù)給藥21 d后，處死各組載瘤鼠，取出乳腺腫瘤，剝離腫瘤外膜及附著的結(jié)締組織，用生理鹽水充分清洗掉表面的血細(xì)胞，若存在較明顯的壞死灶，需剪開腫瘤，清洗干凈腫瘤內(nèi)部的壞死灶，用吸水紙吸干腫瘤表面水分，稱量腫瘤重量。腫瘤抑制率 =(對照組腫瘤均重-實驗組腫瘤均量)/對照組腫瘤均重。

1.5.4 觀察腫瘤組織的病理學(xué)改變：將部分腫瘤組織置于4%多聚甲醛溶液中固定1 d，經(jīng)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后制成切片[8]，顯微鏡下觀察腫瘤組織的細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5.5 免疫印跡試驗檢測腫瘤組織Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-7蛋白相對表達(dá)水平：取5 g腫瘤組織置入研磨器中，加入SDS組織裂解液，迅速在冰上研磨、勻漿，在4℃下以12 000 r/min離心10 min，提取組織總蛋白。二喹啉甲酸法測定蛋白質(zhì)的濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜(350 mA，120 min)，添加5%脫脂奶粉封閉處理1.5 h后，加入一抗β-actin(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Caspase-9(1 ∶500)和Caspase-7(1 ∶1 000)抗體4℃孵育過夜，加入二抗(1 ∶500)室溫孵育2 h，通過凝膠成像分析系統(tǒng)顯影。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，根據(jù)灰度比值計算相關(guān)目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞實驗

1.6.1 分組與給藥：取對數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231接種于6孔板中，接種密度為1×105個/孔并分為細(xì)胞空白組、200 μmol/L培元抗癌湯組、300 μmol/L培元抗癌湯組、400 μmol/L培元抗癌湯組和3 μmol/L烏司他丁組；各給藥物組加入5 mL相應(yīng)濃度的藥物后，將6孔板放入37℃、含有5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后收集各孔細(xì)胞用于后續(xù)實驗，細(xì)胞空白組不做任何干預(yù)。

1.6.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：收集細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，接種于96孔板中孵育過夜，重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，使用胰酶消化細(xì)胞后加入100 μL 二甲基亞砜和20 μL 碘化丙啶,37℃避光反應(yīng)20 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物的一般情況 對照組載瘤鼠出現(xiàn)體重明顯減輕、活動減少、反應(yīng)遲鈍等情況，3只載瘤鼠死亡；培元抗癌湯各劑量組的載瘤鼠用藥后飲食良好，體重較用藥前增加，未出現(xiàn)腹瀉等情況，無死亡；陽性對照組載瘤鼠用藥后體重也較用藥前增加，但對外界刺激反應(yīng)欠靈敏，1只載瘤鼠死亡。

2.2 5組載瘤鼠腫瘤抑制率比較 低劑量組、高劑量組、陽性對照組、中劑量組的腫瘤抑制率依次升高(均P<0.05)，見表1。

表1 5組載瘤鼠腫瘤抑制率比較(x±s，%)

2.3 5組載瘤鼠乳腺腫瘤組織病理形態(tài) 對照組中，腫瘤組織細(xì)胞的形態(tài)各異，呈現(xiàn)不規(guī)則的團塊狀和條狀，腫瘤細(xì)胞異形明顯，細(xì)胞核增大，核異性明顯。低劑量組和對照組差別不大；中、高劑量組腫瘤組織出現(xiàn)了不同程度的腫瘤細(xì)胞退變，并可見細(xì)胞核碎片，凋亡細(xì)胞增多，其中中劑量組腫瘤細(xì)胞退變變化最顯著；陽性對照組也出現(xiàn)一定程度的腫瘤細(xì)胞退變，凋亡細(xì)胞數(shù)增多，密度變小。見圖1。

對照組 低劑量組 中劑量組 高劑量組 陽性對照組

2.4 5組載瘤鼠乳腺腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平比較 與對照組和低劑量組比較，中、高劑量組和陽性對照組的促凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-7相對表達(dá)量均升高(均P<0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達(dá)量均降低(均P<0.05)，但對照組與低劑量組的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。與高劑量組和陽性對照組比較，中劑量組的促凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-7相對表達(dá)量均升高(均P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達(dá)量降低(均P<0.05)，但高劑量組與陽性對照組的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。 結(jié)果見表2及圖2。

圖2 5組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表2 5組乳腺腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量比較(x±s)

2.5 5組細(xì)胞凋亡率比較 與細(xì)胞空白組和200 μmol/L培元抗癌湯組比較，300 μmol/L、400 μmol/L培元抗癌湯組和3 μmol/L烏司他丁組細(xì)胞凋亡率均升高(均P<0.05)；與400 μmol/L培元抗癌湯組和3 μmol/L烏司他丁組比較，300 μmol/L培元抗癌湯組細(xì)胞凋亡率均升高(均P<0.05)；細(xì)胞空白組和200 μmol/L培元抗癌湯組之間，以及400 μmol/L培元抗癌湯組和3 μmol/L烏司他丁組之間，細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3及圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

表3 5組細(xì)胞凋亡率比較(x±s，%)

3 討 論

中草藥是天然的產(chǎn)物，具有抑制腫瘤的作用，而且中草藥的毒副作用比較小[9]。中醫(yī)認(rèn)為，正氣存內(nèi)、邪不可干，邪之所奏，其氣必虛，病變的產(chǎn)生和發(fā)展是由于正邪相爭、正氣不足、正不勝邪所導(dǎo)致，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和病灶的轉(zhuǎn)移其機理也如此[10]。因此，如《難經(jīng)》中提及的“補不足，損有余”，腫瘤的治療方法就是“扶正驅(qū)邪”[11]。

腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展都是因為正氣不足，隨著疾病的繼續(xù)發(fā)展，致使正氣更虛，因此扶正固本在治療腫瘤的過程沒有意義。“痛有定處，不發(fā)生轉(zhuǎn)移”是腫瘤的主要特征，從其形態(tài)看，存在著“瘀血內(nèi)阻”的現(xiàn)象[12]?！皻鉃檠畮?，血為氣之母”，氣可以點化和吸收血的精華，血是氣的載體，也能夠變成氣[13]。如果氣比較虛弱，就會沒有力道，導(dǎo)致淤血，血如果內(nèi)阻，就會阻止氣的循環(huán)，長此以往，就會形成惡性循環(huán)。所以腫瘤的早期是以淤血為主，中期是淤血和氣的循環(huán)受限為主，晚期則氣血兩虛，比較嚴(yán)重。因此，腫瘤的基本機理就是氣血兩虛，虛實相生，治療應(yīng)益氣活血化瘀。李仁廷教授依據(jù)中醫(yī)理論基礎(chǔ)，結(jié)合豐富的臨床經(jīng)驗及現(xiàn)代藥理學(xué)知識研制出培元抗癌湯，其為具有抑制惡性腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移作用的中藥制劑。培元抗癌湯主要是由西洋參、炒白術(shù)、白花蛇舌草、黃芪、仙鶴草、土茯苓、后樸、炙甘草等組成。本方中，西洋參味甘、微苦，性子良、能夠清火生津、益氣養(yǎng)陰；西洋參和白花蛇舌草同用可以解毒、抗癌。在本實驗中，對照組載瘤鼠體重減輕、活動減少、反應(yīng)遲鈍；與對照組比較，培元抗癌湯各劑量組和陽性對照組載瘤鼠體重增加、反應(yīng)較為靈敏，且腫瘤抑制率均升高。這表明培元抗癌湯與烏司他丁均有抑制乳腺癌組織生長的作用，對治療乳腺癌細(xì)胞移植瘤小鼠均有積極的作用。此外，低劑量組、高劑量組、陽性對照組、中劑量組的腫瘤抑制率依次升高(均P<0.05)，提示中劑量的培元抗癌湯腫瘤抑制效果最為明顯。而HE染色結(jié)果也證實了這一結(jié)果，光鏡下觀察各組腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，對照組和低劑量腫瘤細(xì)胞異形明顯，細(xì)胞核增大，核異性明顯，高中劑量組和陽性對照組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度退變，可見細(xì)胞核碎片和凋亡細(xì)胞，中劑量組腫瘤細(xì)胞退變更明顯。總之，適量的培元抗癌湯對人乳腺癌細(xì)胞引起的小鼠腫瘤具有很好的抑制效果。

癌癥的發(fā)生和發(fā)展不僅與腫瘤的惡性增殖有關(guān)，還與癌細(xì)胞所處的微環(huán)境有關(guān)。癌細(xì)胞凋亡被抑制對惡性腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展起到非常重要的作用。Bcl家族的蛋白在凋亡信號轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著重要的作用，是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性因素之一[14]，其通過抑制細(xì)胞凋亡和死亡導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量增多從而促進(jìn)腫瘤的生長。其中，Bcl-2是Bcl家族中重要的抑制凋亡的蛋白。Caspase家族的所有蛋白均與細(xì)胞凋亡相關(guān)，是引導(dǎo)腫瘤生長周期的重要因子，其中Caspase-3是凋亡起始因子，Caspase-9是凋亡執(zhí)行因子。Caspase家族相關(guān)蛋白含量增高可促使癌細(xì)胞凋亡[15]。 本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，中、高劑量組和陽性對照組的促凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-7相對表達(dá)量均升高(均P<0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達(dá)量均降低(均P<0.05)，其中中劑量組的促凋亡蛋白水平最高而抗凋亡蛋白水平最低，這表明培元抗癌湯與烏司他丁均能影響凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長，而中劑量的培元抗癌湯效果最佳。此外，本研究按照腫瘤模型用藥劑量的比例，應(yīng)用不同濃度培元抗癌湯干預(yù)人乳腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，300 μmol/L、400 μmol/L培元抗癌湯組和3 μmol/L烏司他丁組細(xì)胞凋亡率高于細(xì)胞空白組和200 μmol/L培元抗癌湯組，其中300 μmol/L培元抗癌湯組細(xì)胞凋亡率最高，提示適宜劑量的培元抗癌湯可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，適宜劑量的培元抗癌湯能有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤生長，同時可調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但培元抗癌湯中治療乳腺癌的有效成分，以及具體的分子機制和信號通路相關(guān)的作用靶點，有待進(jìn)一步深入探討和研究。