潘建剛，張華偉，陳波，周明光，王召賀，徐高原

(武漢科前生物股份有限公司，武漢 430070)

豬鏈球菌(Streptococcussuis)可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡[1-2]，嚴(yán)重危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。根據(jù)莢膜多糖抗原的差異，可將其分為35個(gè)血清型，即1～34及1/2型[3]。對豬致病性較強(qiáng)的有豬鏈球菌1 型、2 型、7型和9型，尤其是豬鏈球菌2 型，不僅對豬的致病性最強(qiáng)，而且可感染特定人群并致死，是一種重要的人畜共患病病原菌[4]。本試驗(yàn)從我國部分豬場分離出1株2型豬鏈球菌，鑒定菌株7種毒力因子基因，并用分離菌株進(jìn)行了小鼠致病性試驗(yàn)，以期為豬鏈球菌2型疫苗的研究提供必要條件和有利數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2014-2016年從全國部分豬場采集疑似豬鏈球菌感染病例腦樣品，腦組織有明顯的肉眼可見出血，共20份。

1.1.2 豬鏈球菌培養(yǎng)基 TSA(Tryptic Soy Agar)、TSB(Tryptic Soy Broth)培養(yǎng)基購自BD生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 新生牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；革蘭氏染液購自南京建成科技有限公司；引物合成及基因測序由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.4 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物 18～22 g的昆明鼠，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 將采集的20份腦樣品，分別于無菌操作臺(tái)中使用接種環(huán)挑取部分組織，均勻涂劃在加有5%新生牛血清的TSA平板中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。24 h后于無菌條件下挑取平板上的疑似菌落劃線接種于5%新生牛血清的TSA平板上，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.2 PCR鑒定

1.2.2.1 DNA提取 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，-20 ℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 PCR引物 選取豬鏈球菌屬保守基因gdh(谷氨酸脫氫酶)，血清型特異性基因cas2J(莢膜多糖)以及7種主要毒力因子fbps(纖連蛋白原結(jié)合蛋白)、sly(溶血素)、orf2(毒力相關(guān)因子)、mrp(溶菌酶釋放蛋白)、89k(毒力島)、gapdh(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)和epf(胞外因子)基因，參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物[5-9]，引物序列見表1。

表1 豬鏈球菌引物Tab 1 Primer of Streptococcus suis

1.2.2.3 PCR檢測及測序分析 PCR擴(kuò)增體系：10×buffer 5.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL，引物P1(10 μmol/L)1.0 μL，引物P2(10 μmol/L)1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，加注射用水至50 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳。用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將該P(yáng)CR產(chǎn)物連接pMD18-T載體，送擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，并與BLAST上的相關(guān)序列比較分析。

1.2.3 形態(tài)觀察 按常規(guī)方法對分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征。

1.2.4 生長曲線的測定 分離菌株接種TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)8～10 h作為種子液。再將上述種子液按培養(yǎng)基總體積的2%接種TSB培養(yǎng)基，于37 ℃搖床170 r/min振蕩培養(yǎng)。其間每隔2 h取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，監(jiān)測24 h。

1.2.5 小鼠致病性試驗(yàn) 采用半數(shù)致死量(LD50)評價(jià)分離菌的致病性，取30只雄性昆明小鼠，隨機(jī)分為6組，每組5只，其中5組作為攻毒組，一組作為對照組。濃縮菌液，調(diào)整菌液初始濃度為1.0×1010CFU/mL，進(jìn)行10倍倍比稀釋，選取100～10-45個(gè)梯度，每個(gè)梯度攻毒一組小鼠，腹腔注射菌液0.2 mL，對照組腹腔注射0.2 mL生理鹽水。連續(xù)觀察14 d，記錄各組死亡情況，對死亡小鼠立即解剖，觀察病變情況，進(jìn)行各臟器細(xì)菌分離、鑒定。根據(jù)Reed-Muench累加法計(jì)算分離菌株的LD50[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離 20份腦組織分別接種TSA平板，通過挑選可疑菌落，對其純化，總共分出10株疑似菌株。在平板上可見灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的小菌落。

2.2 細(xì)菌鑒定 分離的10株細(xì)菌，用豬鏈球菌屬引物gdh進(jìn)行PCR鑒定，其中3株能擴(kuò)增出約695 bp大小的條帶，分別回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，顯示與豬鏈球菌對應(yīng)的序列同源性在95%以上，說明分離菌株為豬鏈球菌(圖1)。

2.3 2型豬鏈球菌PCR鑒定 3株豬鏈球菌經(jīng)過cas2J引物PCR鑒定，1株能擴(kuò)增出長度約為387 bp大小的條帶，回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)所測序列片段大小和預(yù)期片段大小相同，同時(shí)把測出的序列結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，顯示與對應(yīng)血清型的序列同源性在95%以上，說明所擴(kuò)增的基因即為目的基因(圖2)。

M:DL2000 DNA Marker;1-10:疑似菌株;11:陰性對照 M:DL2000 DNA Marker;1-10:suspicious strain；11:Negative control圖1 豬鏈球菌PCR鑒定結(jié)果Fig 1 PCR identification results for Streptococcus suis

M:DL2000 DNA Marker;1-3:豬鏈球菌;4:陰性對照 M:DL2000 DNA Marker;1-3:Streptococcus suis;4:Negative control圖2 2型豬鏈球菌PCR鑒定結(jié)果Fig 2 PCR identification results for Streptococcus suistype 2

2.4 毒力因子鑒定 分離的1株2型豬鏈球菌通過 PCR檢測了mrp、epf、sly、orf2、gapdh、fbps和89k 7種毒力因子，結(jié)果7種毒力因子在分離菌株中都能檢測到(圖3)。對上述菌株毒力基因測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測序列片段大小和預(yù)期片段大小相同，同時(shí)把測出的序列結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，顯示與對應(yīng)的毒力因子序列同源性在95%以上，說明所擴(kuò)增的基因即為目的基因，分離菌株基因中幾種主要毒力因子都有分布。

2.5 形態(tài)學(xué)特性 分離的2型豬鏈球菌經(jīng)過革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，細(xì)菌為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，具有多種不同形態(tài)，可見單個(gè)的球桿菌、桿菌或絲狀的菌體(圖4)。

2.6 生長曲線繪制 在液體TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離菌株，分離菌6 h左右開始進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)8～10 h活菌數(shù)達(dá)到最高峰，但從10 h開始活菌數(shù)一直呈現(xiàn)下降趨勢。分離菌株在TSB液體培養(yǎng)基繁殖速度快，活菌數(shù)高(圖5)。

2.7 小鼠攻毒試驗(yàn) 昆明小鼠腹腔注射不同濃度的菌液后，試驗(yàn)小鼠最早于攻毒后第1天開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡高峰出現(xiàn)在攻毒后2～5 d，7 d后停止死亡。按Reed-Muench法計(jì)算，分離2型豬鏈球菌的LD50見表2。將濃縮菌液稀釋到4.8×107CFU/mL，攻毒0.2 mL，能使半數(shù)小鼠發(fā)生死亡，表明分離菌株毒力較強(qiáng)。

圖4 革蘭氏染色結(jié)果(100×)Fig 4 The results of Gram stain(100×)

圖5 2型豬鏈球菌生長曲線Fig 5 The growth curve of Streptococcus suis type 2

表2 半數(shù)致死量(LD50)試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The results of LD50

2.8 剖檢觀察 剖檢攻毒死亡小鼠，可見攻毒小鼠腹腔內(nèi)滲出液增多，腦和各臟器出血；試驗(yàn)結(jié)束后剖檢空白對照組小鼠，可見健康對照組小鼠腹腔及各器官正常。結(jié)果見圖6。分離的2型豬鏈球菌能引起小鼠的急性敗血癥及腦膜炎，導(dǎo)致小鼠死亡，成功在小鼠上建立攻毒模型。

圖6 剖檢結(jié)果Fig 6 The results of anatomy

2.9 臟器細(xì)菌分離 剖檢死亡小鼠，取各臟器在無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果顯示攻毒后死亡小鼠各臟器均能分離出細(xì)菌。對各臟器分離的細(xì)菌進(jìn)行PCR鑒定并測序，結(jié)果表明各臟器分離菌株均為攻毒2型豬鏈球菌(圖7)。

圖7 攻毒小鼠各臟器細(xì)菌分離鑒定Fig 7 Isolation and identification of bacteria from various organs of challenged mice

3 討論與小結(jié)

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病病原，其致病性差異很大，只有高致病力菌株才能引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡等癥狀，低致病力和無致病力的菌株常見于豬的呼吸道。在致病性血清型中2 型的致病力最強(qiáng)，發(fā)病率最高，流行范圍最廣，其致病性和它的毒力因子相關(guān)[12-13]?，F(xiàn)有疫苗菌株分離年代都比較久遠(yuǎn)，保護(hù)效果有一定的降低。本研究采集最近幾年疑似豬鏈球菌感染病例腦樣品，經(jīng)過平板分離和 PCR鑒定成功獲得一株2型豬鏈球菌，PCR檢測顯示分離菌株基因中幾種主要毒力因子都有分布，在TSB液體培養(yǎng)基繁殖速度快，活菌數(shù)高，能引起小鼠的急性敗血癥及腦膜炎導(dǎo)致小鼠死亡，證明分離株毒力強(qiáng)，是潛在的疫苗菌株。