王林，高曉龍，吳迪，張瑋，張啟龍，栗云鵬，程汝佳，杜鵑，李蕊，王培， 馮小宇，韋海濤，周德剛，劉曉冬，宋彥軍

(北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京102629)

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染家豬和野豬引起的一種高度接觸性的烈性傳染病，致死率幾乎100%，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報(bào)告?zhèn)魅静?。?921年肯尼亞首次發(fā)生非洲豬瘟疫情以來(lái)，該病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重威脅和巨大經(jīng)濟(jì)損失。上世紀(jì)中葉非洲豬瘟通過(guò)航空運(yùn)輸傳入歐洲，相繼在意大利、葡萄牙、法國(guó)、比利時(shí)、荷蘭等國(guó)家暴發(fā)疫情，經(jīng)過(guò)二三十年的努力，除意大利撒丁島外，歐洲其他國(guó)家成功將該病根除；但2007年，格魯吉亞暴發(fā)非洲豬瘟疫情后，該病持續(xù)向全球蔓延，在俄羅斯、白俄羅斯、波蘭等東歐國(guó)家和地區(qū)廣泛流行[1]。我國(guó)自2018年10月發(fā)生首例非洲豬瘟疫情以來(lái)[2]，迅速蔓延全國(guó)31個(gè)省份，截至2019年10月全國(guó)共報(bào)告158起非洲豬瘟疫情，共撲殺生豬百萬(wàn)余頭，導(dǎo)致我國(guó)生豬養(yǎng)殖遭受毀滅性打擊，甚至給我國(guó)經(jīng)濟(jì)、政治、社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的影響。鑒于當(dāng)前無(wú)有效商品化疫苗可用[3]，因此非洲豬瘟的早期快速準(zhǔn)確診斷對(duì)該病的防控具有非常重要的意義。

國(guó)內(nèi)外研究人員針對(duì)非洲豬瘟病毒建立了多種核酸檢測(cè)方法[4]，主要有PCR、熒光定量PCR、數(shù)字PCR[5]、恒溫RPA-LFD[6]以及納米孔測(cè)序[7]等，但這些方法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、設(shè)備要求高、成本高、易污染等問(wèn)題。雖然恒溫RPA-LFD檢測(cè)方法反應(yīng)時(shí)間僅為20 min，但其利用免疫層析試紙條進(jìn)行結(jié)果判讀仍需10～15min，操作繁瑣同樣不利于非洲豬瘟的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷，而環(huán)介導(dǎo)等溫快速檢測(cè)方法(Loopmediated Isothermal Amplification, LAMP)具有特異性好、靈敏度高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，且多位研究人員也針對(duì)口蹄疫[10]、禽流感[11]、圓環(huán)3型[12]、中東呼吸綜合征病毒[13]以及西尼羅河病毒[14]等多種疾病建立了LAMP恒溫快速檢測(cè)方法。

因此，本研究基于LAMP擴(kuò)增技術(shù)針對(duì)ASFV p72基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物組建立ASFV恒溫快速檢測(cè)方法，并通過(guò)向LAMP反應(yīng)體系中添加SYTO9熒光染料實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)控和結(jié)果判定，同時(shí)對(duì)該方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性、符合率和適用儀器等進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和試劑 便攜式MA-1610型等溫?zé)晒釶CR儀(購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、ABI QuantStudio 7熒光定量PCR儀、LoopampDNA 擴(kuò)增試劑盒(購(gòu)自榮研生物科技(中國(guó))有限公司)、SYTO9(購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)、DNA核酸提取試劑盒(購(gòu)自杭州博日科技有限公司)

1.1.2 毒株與樣品 非洲豬瘟病毒p72基因保守區(qū)域DNA質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

非洲豬瘟陽(yáng)性樣本核酸、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV-JXA1株)、歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV-LV株)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank已發(fā)表的ASFV Georgia株(GenBank: MH910495.1)，運(yùn)用“環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法引物設(shè)計(jì)輔助軟件(http:∥primerexplorer.jp/)在線設(shè)計(jì)非洲豬瘟病毒p72基因的內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物，引物序列見(jiàn)表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 引物篩選 將人工合成的ASFV p72基因保守區(qū)域DNA質(zhì)粒稀釋成濃度為1×104copies/μL和無(wú)RNase水作為陽(yáng)性模板和陰性模板，63℃擴(kuò)增120 min，根據(jù)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)間、“S型”擴(kuò)增曲線和非特異性曲線等結(jié)果綜合分析，篩選ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP快速檢測(cè)方法的最佳引物組。

表1 基于ASFV p72基因設(shè)計(jì)的LAMP擴(kuò)增引物Tab 1 LAMP Primers designed for the P72 gene of ASFV

1.2.3 方法的建立與優(yōu)化 按照LoopampDNA 擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行配制ASFV熒光LAMP基礎(chǔ)反應(yīng)體系18.5 μL，包含2×LAMP反應(yīng)液 12.5 μL，外引物(F3/B3，濃度為5 μM)各1μL、內(nèi)引物(FIP/BIP，濃度為40 μM)各1μL、環(huán)引物L(fēng)B(濃度為20 μM)1 μL、Bst DNA 聚合酶1 μL，SYTO9熒光染料(1 mM)1 μL，DNA模板2 μL，無(wú)DNA酶水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為63℃，1 min，50cycles。

以濃度為1×105copies/μL 的DNA質(zhì)粒為模板，分別在61℃、63℃、65℃、67℃ 等4個(gè)溫度條件下進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)間確定最佳反應(yīng)溫度。

分別以濃度為1×106～1×101copies/μL 的p72基因質(zhì)粒為模板，在最佳反應(yīng)溫度時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)最低檢測(cè)限來(lái)確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.4 靈敏度驗(yàn)證 將濃度為1×106copies/μL 的p72基因質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋至1×100copies/μL同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，驗(yàn)證該方法靈敏性。

1.2.5 特異性驗(yàn)證 將本實(shí)驗(yàn)室保存的ASFV核酸(經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)不含PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、FMDV、PCV2和PCV3等病毒核酸)和PRV、CSFV、PRRSV-JXA1株、PRRSV-LV株、PEDV提取核酸后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.6 重復(fù)性驗(yàn)證 分別以濃度為1×105～1×101copies/μL的p72基因質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度重復(fù)4次，根據(jù)其Ct值計(jì)算變異系數(shù)，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.2.7 儀器適用性驗(yàn)證 使用濃度為1×106～1×101copies/μL的p72基因質(zhì)粒為模板，分別在ABI QuantStudio 7熒光定量PCR儀和便攜式MA-1610型等溫?zé)晒釶CR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP擴(kuò)增，對(duì)本方法適用儀器進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.8 臨床樣本檢測(cè) 分別采用本研究建立的ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP快速檢測(cè)方法和《非洲豬瘟病毒檢測(cè)操作規(guī)程(試行)》“非洲豬瘟核酸檢測(cè)技術(shù)(方法一)”規(guī)定的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室采集的20份飼料、30份血液、20份脾臟等70份樣品進(jìn)行檢測(cè)，分析該方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選 分別使用設(shè)計(jì)的ASFV-LAMP擴(kuò)增引物組A和B對(duì)1×105copies/μL DNA合成質(zhì)粒和陰性對(duì)照63℃擴(kuò)增2h。結(jié)果(圖1)顯示，A組引物在29 min出現(xiàn)明顯的“S”型擴(kuò)增曲線且陰性對(duì)照無(wú)非特異性擴(kuò)增，而B(niǎo)組引物在75 min才檢出陽(yáng)性DNA模板，A組引物陽(yáng)性檢出時(shí)間優(yōu)于B組，因此選擇A組引物為ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)引物。

圖1 ASFV實(shí)時(shí)熒光 LAMP引物篩選Fig 1 Primers screening of real-time fluorescent LAMP for ASFV

2.2 方法的建立與優(yōu)化 經(jīng)優(yōu)化后的ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP快速檢測(cè)方法反應(yīng)體系為25 μL，分別為2×LAMP反應(yīng)液 12.5 μL，外引物(F3/B3，濃度為5 μM)各1 μL、內(nèi)引物(FIP/BIP，濃度為40 μM)各1 μL、環(huán)引物L(fēng)B(濃度為20 μM)1 μL、Bst DNA 聚合酶1 μL，SYTO9熒光染料(1mM)1 μL，DNA模板2 μL，無(wú)DNA酶水3.5 μL。

最佳反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果(圖2)顯示，61℃時(shí)Ct值為21.89，63℃時(shí)Ct值為19.57，65℃時(shí)Ct值為21.06，67℃時(shí)Ct值為25.75，表明同一模板濃度條件下，63℃擴(kuò)增時(shí)間最短，因此最佳反應(yīng)溫度為63℃。

圖2 反應(yīng)溫度優(yōu)化Fig 2 Optimization of reaction temperature

2.3 靈敏度及最佳反應(yīng)時(shí)間 以1×106～1×100copies/μL 的p72基因質(zhì)粒為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP擴(kuò)增。結(jié)果(圖3)顯示，ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法最低檢測(cè)限為10 copies/μL。ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)表明該檢測(cè)方法結(jié)果Ct值與模板濃度呈線性相關(guān)，R2為0.992，表明線性關(guān)系良好。

由圖3可知，本方法最低檢測(cè)限為10 copies/μL，重復(fù)3次的平均Ct值為30.21，因此本方法最佳反應(yīng)循環(huán)數(shù)為40 cycles，即最佳反應(yīng)時(shí)間為40 min。

1～7: 1×106 ～1×100 copies/μL圖3 ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP靈敏度驗(yàn)證Fig 3 Sensitivity of ASFV real-time fluorescent LAMP

圖4 ASFV實(shí)時(shí)熒光 LAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 4 Standard curve of ASFV real-time fluorescent LAMP

2.4 特異性驗(yàn)證 采用ASFV、PRV、CSFV、PRRSV-JXA1株、PRRSV-LV株、PEDV進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性。結(jié)果(圖5)顯示，除ASFV出現(xiàn)特異性擴(kuò)增外，其余病毒檢測(cè)均為陰性，表明該方法特異性良好。

2.5 重復(fù)性驗(yàn)證 采用1×105～1×101copies/μL的p72基因質(zhì)粒為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度重復(fù)4次，結(jié)果如表2所示，變異系數(shù)均小于5%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.6 適用儀器驗(yàn)證 利用ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP方法分別在ABI QuantStudio 7熒光定量PCR儀和便攜式MA-1610型等溫?zé)晒釶CR儀上對(duì)1×106～1×101copies/μL濃度的質(zhì)粒模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果(圖6)顯示，全部濃度的質(zhì)粒均能檢出，表明本方法儀器適用性好，既可適用于獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室常用的熒光定量PCR儀，也能適用于便攜式恒溫?zé)晒釶CR儀。

圖5 ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP特異性驗(yàn)證Fig 5 Specificity of ASFV real-time fluorescent LAMP

表2 ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP重復(fù)性驗(yàn)證Tab 2 Repeatability of ASFV real-time fluorescent LAMP

A：便攜式MA-1610型等溫?zé)晒釶CR儀；B：ABI QuantStudio 7熒光定量PCR儀； 1～6：1×106 ～1×101 copies/μL；7：陰性對(duì)照 A: Portable isothermal fluorescence PCR(MA-1610)； B: ABI QuantStudio 7； 1～6：1×106 ～1×101 copies/μL；7: Negative control圖6 ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP方法不同儀器適用性驗(yàn)證Fig 6 Verification for the applicability of ASFV real- time fluorescent LAMP in different PCR instruments

2.7 臨床樣品檢測(cè) 采用本研究建立的ASFV實(shí)時(shí)熒光LAMP方法和標(biāo)準(zhǔn)方法qPCR同時(shí)對(duì)70份臨床樣品進(jìn)行ASFV檢測(cè)。結(jié)果(表3)顯示，LAMP方法檢測(cè)出4份血液樣品、9份脾臟樣品檢測(cè)陽(yáng)性，其余樣品均為陰性，與標(biāo)準(zhǔn)方法qPCR檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為100%。

表3 實(shí)時(shí)熒光LAMP和qPCR臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Tab 3 Parallel test results between real-time fluorescent LAMP and qPCR for clinical samples

3 討論與結(jié)論

自2018年10月我國(guó)暴發(fā)首例非洲豬瘟疫情以來(lái)，迅速蔓延至全國(guó)，給我國(guó)生豬養(yǎng)殖造成非常嚴(yán)重的損失。因此非洲豬瘟的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷對(duì)于該病的發(fā)現(xiàn)、傳播和控制具有重要的意義。LAMP恒溫快速檢測(cè)技術(shù)能夠針對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)4-6對(duì)引物，在60～65 ℃恒溫條件下40～60 min即可完成檢測(cè)，具有方便、快捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。目前LAMP檢測(cè)結(jié)果的判定主要有濁度法、鈣黃綠素目視法、瓊脂糖凝膠電泳法以及免疫層析法等，但濁度法對(duì)儀器設(shè)備要求高、鈣黃綠素目視法對(duì)弱陽(yáng)樣品存在人為誤判且成本高、瓊脂糖凝膠電泳和免疫層析反應(yīng)管開(kāi)蓋極易造成環(huán)境污染，造成LAMP檢測(cè)技術(shù)難以在臨床應(yīng)用推廣。Than Linh Quyen等研究發(fā)現(xiàn)SYTO9作為一種激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)與FAM相近的DNA熒光染料(激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為498 nm)，其具有信噪比高、靈敏度高、對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)無(wú)抑制作用等優(yōu)點(diǎn)，可用于LAMP擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中的實(shí)時(shí)監(jiān)控，有助于提高LAMP檢測(cè)的準(zhǔn)確性以及減少氣溶膠污染[15]。

因此，本研究針對(duì)非洲豬瘟病毒P72基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性LAMP檢測(cè)引物，包括2條內(nèi)引物、2條外引物和1條環(huán)引物，并對(duì)反應(yīng)溫度、時(shí)間等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)通過(guò)在反應(yīng)體系中添加適量的SYTO9熒光染料，建立了非洲豬瘟病毒SYTO9實(shí)時(shí)熒光LAMP快速檢測(cè)方法。本方法反應(yīng)時(shí)間短，在63 ℃恒溫條件下反應(yīng)40 min即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，最快15～20min就能檢測(cè)到ASFV；靈敏度高，最低檢測(cè)限為10 copies/μL；特異性良好，PRV、CSFV、PRRSV、PEDV等病毒不發(fā)生非特異性擴(kuò)增；重復(fù)性好，變異系數(shù)均小于5%，；符合率高，與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的熒光定量PCR方法符合率為100%;適用儀器較廣，不僅適用于等溫?zé)晒釶CR儀，同時(shí)也適用于各種常規(guī)熒光定量PCR儀器。

綜上所述，本研究建立的基于SYTO9熒光染料的非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光LAMP快速檢測(cè)方法具有反應(yīng)快速(40 min)、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、符合率高、操作簡(jiǎn)便、不易污染、適用儀器廣等優(yōu)勢(shì)，可用于非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別診斷，為非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)急檢測(cè)和防控提供了一種新方法，更適合基層推廣應(yīng)用。