劉朝霞，魏建華，姚尚萍，豐靚，劉紅霞

（新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊830000）

銀屑病是一種由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激，免疫介導(dǎo)的，以角質(zhì)形成細(xì)胞增生過度、分化不全、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管形成為主的慢性炎癥性組織病理改變的皮膚類疾病[1-2]。Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子信號(hào)通路（JAK/STAT）作為機(jī)體內(nèi)普遍存在的經(jīng)典信號(hào)通路，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，主要通過多種細(xì)胞因子調(diào)控，介導(dǎo)參與機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、介導(dǎo)炎性反應(yīng)、刺激細(xì)胞凋亡和增殖等過程[3]。

健脾解毒湯是岐黃學(xué)者，全國(guó)名老中醫(yī)藥專家劉紅霞教授結(jié)合新疆的地域特征治療銀屑病的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)多年臨床觀察，療效確切，劉紅霞教授認(rèn)為新疆年降水量少，氣候干燥，燥邪傷津耗氣，津傷則津液陰血不足，津液、陰血均為氣所化生，亦為氣之物質(zhì)基礎(chǔ)，脾為后天之本，為氣血津液生化之源，故燥邪易傷及脾胃；新疆冬季漫長(zhǎng)，飲食以肉食為主，易生濕化熱，傷及脾胃，提出“健脾祛濕法”治療銀屑病的學(xué)術(shù)思想，自擬健脾解毒湯運(yùn)用臨床療效滿意。為進(jìn)一步驗(yàn)證健脾解毒湯治療尋常型銀屑病的作用機(jī)制，本次實(shí)驗(yàn)，通過健脾解毒湯全方及不同拆方干預(yù)脾虛濕盛型尋常型銀屑病小鼠，檢測(cè)JAK/STAT信號(hào)通路中，轉(zhuǎn)錄因子（STAT）3，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子（p-STAT）3，STAT5，p-STAT5 在脾虛濕盛型銀屑病小鼠組織中的表達(dá)，評(píng)估健脾解毒湯及拆方對(duì)尋常型銀屑病治療的貢獻(xiàn)大小，進(jìn)一步闡釋健脾祛濕法治療銀屑病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物美國(guó)癌癥研究所（ICR）小鼠 70 只，4～6 周齡；體質(zhì)量 18～25 g，平均 20.4 g；由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物批號(hào)：XJDC-1811）。TIANScript RT Kit購(gòu)自中國(guó)天根公司；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）購(gòu)自中國(guó)天根公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司；Anti-STAT3抗體（ab68153）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Anti-p-STAT3抗體（9145）購(gòu)自美國(guó)CST公司；Anti-STAT5抗體（ab32043）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Anti-p-STAT5抗體（ab32364）購(gòu)自美國(guó) Abcam公司；Pierce Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物建模制備和分組給藥

1.2.1.1 動(dòng)物分組 動(dòng)物均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)分為7組，每組10只：空白對(duì)照組（A組）、阿維A膠囊組（B組）、健脾湯組（C組）、解毒湯組（D組）、健脾解毒湯組（E組）、脾虛模型組（F組）、脾虛+銀屑病組（G組）。

1.2.1.2 脾虛濕盛動(dòng)物模型 將生大黃以10倍體積的純凈水浸泡過夜，大火煮沸后轉(zhuǎn)文火并保持15 min。倒出藥汁，再以8倍體積水重復(fù)1次，合并濾液，濃縮至100%。置于4℃冰箱冷藏備用。

對(duì)B組、C組、D組、E組、F組、G組中的每只小鼠用大黃水煎液灌服，0.6 mL/只，共7 d。

1.2.1.3 脾虛濕盛型銀屑病動(dòng)物模型 將B組、C組、D組、E組、G組中的小鼠背部剃毛，面積為3 cm×5 cm，局部外用5%咪喹莫特乳膏50.0 mg/d，均勻涂抹于小鼠背部無毛區(qū)域，厚度約為1～2 mm，充分涂抹以使藥物盡可能被皮膚吸收，單指輕壓按摩約60次，1 次/d，連續(xù)用藥 8 d。

1.2.1.4 健脾解毒湯及拆方給藥 A組、F組和G組0.2 mL蒸餾水灌胃，1次/d；B組用藥量為0.03 g/L，1次/d，定時(shí)灌胃1 mL，D組、C組和E組用藥量為1.67 mL/（kg·d），連續(xù)用藥28 d。

1.2.2 皮損組織病理學(xué)檢查 相應(yīng)皮損組織用固定液固定組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色后在光鏡下觀察組織病理變化。

1.2.3 RT-qPCR 通過DNAMAN軟件設(shè)計(jì)STAT3、STAT5、GAPDH熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物，并由上海生工有限公司合成。分別加入2 μL 5×PrimeScript Buffer，0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 μL Oligo（dT）15（15μM），0.5 μL Random 6 mers（100 μM），Total RNA 500 ng，RNase Free dH2O達(dá)到10 μL，混勻后短暫離心，在PCR儀上37℃溫浴 15 min，85 ℃加熱 5 s，稀釋至 35 μL，得到反轉(zhuǎn)錄的 cDNA。 qPCR 反應(yīng)：Forward Primer 10 μM 0.8 μL，0.8 μL Reverse Primer 10 μM，2XSYBR Select Master Mix （2×）10 μL，RNase-free water 6.4 μL，cDNA template 2 μL，配制成20 μL體系混合均勻，在儀器上保持 95℃，1 min，95℃，10 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，94℃ 1 min 30 s，60℃ 1 min，60℃→94℃，1.1℃/s升溫，從而獲得qPCR反應(yīng)結(jié)果。

1.2.4 免疫印跡法（Western blot） 將少量皮損組織塊置于1～2 mL勻漿器中球狀部位，加400 μL單去污劑裂解液（含PMSF）于勻漿器中進(jìn)行勻漿，重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎，裂解30 min后，在4℃下12 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，取適當(dāng)稀釋的上清液用BCA法來測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度后采用 Western blot檢測(cè)組織內(nèi) STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5的表達(dá)，其步驟大致如下；經(jīng)過灌膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，將膜裝入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，制置室溫?fù)u床1 h，加5 mL一抗稀釋液于4℃冰箱過夜。然后加10 mL二抗稀釋液（1∶10 000）置于搖床上 1 h，顯色，在暗室中壓片曝光顯影，結(jié)果用Quantity-one圖像軟件分析并進(jìn)行光密度值掃描，分別計(jì)算目的蛋白條帶與GAPDH強(qiáng)度比值（%）。

2 結(jié)果

2.1 皮損組織病理變化 皮損組織蘇木精-伊紅染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見圖2A～G。在100×倍鏡下觀察，各組小鼠皮損組織形態(tài)：A組小鼠表皮層相對(duì)較薄，真皮層較為緊密。F組與其相比，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表皮無明顯增生現(xiàn)象，表皮較正常組變薄，脾虛濕盛型銀屑病模型，表皮增生明顯，伴有Munro微膿腫，內(nèi)有炎性細(xì)胞及表皮細(xì)胞碎片，角化不全嚴(yán)重，形成銀屑病樣皮損。B組、C組、D組和E組有不同程度的緩解，其中E組優(yōu)于其他各治療組。

2.2 STAT3和STAT5 mRNA表達(dá)差異型 對(duì)A、B、C、D、E、F、G 各組的皮損組織進(jìn)行 STAT3 和STAT5的實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行其mRNA表達(dá)差異型分析，見表1、圖2。STAT3和STAT5的mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，A組與其他各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；F組、G組與其他各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；E組與D組、C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；E組與B組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 小鼠皮損組織的病理圖（蘇木精-伊紅染色×100）

表1 各組皮損組織中STAT3、STAT5的mRNA表達(dá)情況

圖2 各組組織中STAT3、STAT5 mRNA的表達(dá)情況

2.3 STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5 在皮損組織中蛋白表達(dá)差異型 對(duì)A、B、C、D、E、F、G各組的皮損組織進(jìn)行STAT3、STAT5、p-STAT3和p-STAT5的Western blot實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行蛋白表達(dá)差異型分析，見表2、圖3A～D。STAT3和STAT5的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。p-STAT3和p-STAT5蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，A組與其他各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；F組、G組與其他各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；E組與D組、C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；E組與B組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各組皮損組織中STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5的蛋白表達(dá)情況

圖3 各組組織中STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5蛋白的表達(dá)情況

3 討論

銀屑病是一種有遺傳背景、與免疫反應(yīng)異常有關(guān)的、臨床常見的慢性炎癥性皮膚病，全球發(fā)病率約為1%～3%[2，4]。目前研究表明，銀屑病和多個(gè)基因遺傳密切相關(guān)，皮損部位內(nèi)異常T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為銀屑病發(fā)生的重要因素，T細(xì)胞的異常活化會(huì)主動(dòng)或被動(dòng)的分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以通過 JAKs/STATs、MAPK、NF-κb 等多條信號(hào)通路，參與到銀屑病發(fā)病過程中，但JAK/STAT信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)非常重要的一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，大多數(shù)細(xì)胞因子主要通過JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)功能[5]。在銀屑病發(fā)病過程中，JAK/STAT信號(hào)通路參與皮損表皮基層角質(zhì)細(xì)胞的異常分化、血管異常增生、過度角化等多種病理過程，因此JAK/STAT信號(hào)通路在銀屑病的免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)及細(xì)胞信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用[6]。

JAK/STAT信號(hào)通路是繼Ras信號(hào)通路后，近年來發(fā)現(xiàn)的一條新型的信號(hào)通路，其信號(hào)通路較為簡(jiǎn)單，但可在不同細(xì)胞因子的刺激下，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞增殖、分化、侵襲、凋亡及免疫調(diào)控等多種重要的生物功能相聯(lián)系[3，7]。而JAK/STAT信號(hào)通路的缺陷或異常活化都可與銀屑病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有著密不可分的關(guān)系。Jak是一類胞質(zhì)內(nèi)非受體型可溶型酪氨酸蛋白激酶，目前發(fā)現(xiàn)有4個(gè)成員：Jak1、Jak2、Jak3和Tyk2。STAT包含7個(gè)家族成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6。本次實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)關(guān)注STAT3和STAT5。STAT3和STAT5均屬于JAK2的底物，結(jié)合活化后可使STAT3和STAT5磷酸化，并迅速形成同源或異源二聚體，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，與相關(guān)的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮信號(hào)調(diào)控作用，進(jìn)而起到機(jī)體免疫調(diào)控作用和獲得型免疫應(yīng)答反應(yīng)[8-9]。

銀屑病屬中醫(yī)“白疕’、“松皮癬”、“干癬”等范疇。中醫(yī)藥在治療銀屑病上積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，大量研究證明中醫(yī)藥有確切療效，尤其在控制復(fù)發(fā)及藥物安全型上優(yōu)勢(shì)明顯。本次實(shí)驗(yàn)通過“健脾祛濕法”干預(yù)小鼠動(dòng)物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾虛濕盛型銀屑病皮損組織的病理表征明顯，在藥物干預(yù)后，有明顯治愈現(xiàn)象，健脾解毒湯相對(duì)其他方法效果更為優(yōu)異。脾虛濕盛型銀屑病中STAT3和STAT5在mRNA水平上，表達(dá)異常升高；健脾解毒湯及拆方干預(yù)后，可有效降低STAT3和STAT5的mRNA表達(dá)量，健脾解毒湯作用最為明顯。在蛋白表達(dá)方面，p-STAT3和p-STAT5蛋白表達(dá)量在脾虛濕盛型銀屑病中表達(dá)量異常升高，健脾解毒湯及拆方干預(yù)后，有效的降低了其表達(dá)量，其中健脾解毒湯作用也是最為明顯。說明健脾解毒湯可抑制STAT3和STAT5在mRNA水平上的表達(dá)、抑制STAT3和STAT5的磷酸化，通過抑制STAT3和STAT5的表達(dá)和磷酸化，可使細(xì)胞因子傳導(dǎo)中斷或干擾，阻止銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖分化和炎性反應(yīng)侵潤(rùn)，促進(jìn)皮損的消退，發(fā)揮治療銀屑病的作用。