王子朝，寧 濤，張慧茹，詹曉北，吳劍榮，高敏杰

1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001 2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

抗生素作為預(yù)防和控制疾病、提高養(yǎng)殖效益的有效手段，在禽畜飼養(yǎng)中應(yīng)用十分普遍[1]。但抗生素濫用不僅促使病原菌產(chǎn)生了耐藥性[2]，還導(dǎo)致動物來源食品中抗生素殘留過量，影響產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全；同時，食品中殘留的抗生素通過食物鏈最終進(jìn)入人體，對人類健康造成極大危害[3-4]。因此，尋找防病、抗病，提高機(jī)體免疫力和促生長的綠色抗生素替代品迫在眉睫[5-6]。黃原膠是被美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)的一種無限量食品添加劑，其側(cè)鏈和主鏈通過氫鍵形成多重螺旋高級結(jié)構(gòu)，一些活性基團(tuán)被包裹在結(jié)構(gòu)內(nèi)部，限制了黃原膠的生物活性發(fā)揮[7]，使得改性黃原膠及其寡糖研究引起了廣泛關(guān)注。

目前，降解黃原膠有物理、化學(xué)和生物等多種方法。李彥杰[8]采用輻照降解黃原膠，所得黃原膠寡糖具有良好的抗氧化性和抑菌活性。Xiong等[9]在堿性條件下降解黃原膠，得到的3種低分子量黃原膠寡糖均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。Wu等[10]采用雙氧水對黃原膠進(jìn)行降解，所得黃原膠寡糖具有良好的清除羥基自由基活性。何曉燕等[11]采用Cellulomonassp.XT11對黃原膠進(jìn)行降解，所得黃原膠寡糖不僅具有清除羥基自由基能力，還能激活植物防衛(wèi)系統(tǒng)抵御病原菌侵染。物理和化學(xué)法降解黃原膠，不僅對生產(chǎn)設(shè)備要求高，還容易造成環(huán)境污染，而微生物法則具有反應(yīng)條件溫和、易控制、污染小等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。因此，作者采用球毛殼菌CGMCC 6882對黃原膠進(jìn)行降解，并對其降解所得寡糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和抑菌活性探索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

球毛殼菌CGMCC 6882是從植物絞股藍(lán)中分離得到并保存于中國微生物菌種保藏中心的菌種，專利號：ZL 201310002710.3。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號分別為EscherichiacoliCICC 10899和StaphylococcusaureusCICC 10001。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

馬鈴薯：市售；黃原膠：索萊寶生物科技有限公司；溴化鉀、硫酸銨、葡萄糖、硫酸鋅、氯化鈣等均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。搖床：上海國強(qiáng)生化有限公司；離心機(jī)：德國Sigma公司；全自動餾分收集器：上海青浦滬西儀器廠；冷凍干燥機(jī)：美國Labconco公司；高效體積排阻色譜：美國Waters公司；WQF-510紅外光譜儀：北京北分瑞利分析儀器公司；磁力攪拌器：常州市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 主要培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯100 g(切碎煮沸30 min,過濾取濾液)、葡萄糖10 g、瓊脂10 g、蒸餾水500 mL。

黃原膠發(fā)酵培養(yǎng)基：硫酸銨1.0 g、七水合硫酸鎂1.0 g、磷酸二氫鉀1.5 g、磷酸氫二鉀1.5 g、氯化鈉0.5 g、氯化鈣0.3 g、硫酸鐵0.01 g、硫酸錳0.01 g、硫酸鋅0.01 g、黃原膠10.0 g、蒸餾水1 000 mL。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g、牛肉膏1.5 g、氯化鈉2.5 g、營養(yǎng)瓊脂10.0 g、蒸餾水500 mL。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨15.0 g、氯化鈉5.0 g，加入蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0±0.2。

1.4 黃原膠寡糖的制備

將球毛殼菌CGMCC 6882接種至以黃原膠為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，150 r/min、28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)7 d。發(fā)酵結(jié)束后，離心發(fā)酵液除去菌體及不溶性雜質(zhì)后收集上清液，上清液中加入3倍體積的Sevag試劑進(jìn)行脫蛋白，反復(fù)4～5次后加入活性炭進(jìn)行脫色并離心收集上清液。上清液中加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%，除去未降解完的大分子量黃原膠，繼續(xù)加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為90%并放入4 ℃冰箱過夜，析出黃原膠寡糖。將燒杯從冰箱取出，去除上清液并加入適量去離子水復(fù)溶黃原膠寡糖，采用Sepharose CL-6B(2.5 cm×60 cm)進(jìn)行柱層析分離并配以餾分收集器收集黃原膠寡糖溶液組分，將收集的組分進(jìn)行凍干處理以制備黃原膠寡糖。

1.5 單糖組成測定

參考Wang等[12]的方法，采用CarboPac PA20(150 mm×3 mm)色譜柱進(jìn)行單糖組成檢測，用20 mmol/L NaOH溶液等度洗脫。進(jìn)樣量25 μL，流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃，檢測15 min。

1.6 分子質(zhì)量測定

采用高效體積排阻色譜測定分子質(zhì)量，Ultrahydrogel TMLinear 300 mm×7.8 mm id二級串聯(lián)柱，柱溫45 ℃；流動相0.1 mol/L NaNO3，流速0.9 mL/min。用分子質(zhì)量分別為270、975、3 680、13 535 kDa的葡聚糖標(biāo)品繪制分子質(zhì)量校正曲線，根據(jù)樣品保留時間和校正曲線計(jì)算黃原膠寡糖分子質(zhì)量。

1.7 紅外光譜檢測

分別稱取1.0 mg商品級黃原膠與黃原膠寡糖樣品，與200 mg溴化鉀混勻后充分研磨并壓片，采用WQF-510紅外光譜儀對樣品進(jìn)行掃描，波數(shù)范圍400～4 000 cm-1，并用OMNIC-8.2軟件處理紅外數(shù)據(jù)。

1.8 指示菌的活化

將大腸桿菌在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線活化，挑取活化后長勢良好的指示菌于無菌生理鹽水中，采用平板計(jì)數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度約為3×106CFU/mL作為菌懸液A；用無菌肉湯調(diào)整菌懸液濃度為106CFU/mL作為菌懸液B。

1.9 黃原膠寡糖溶液制備

稱取1.0 g黃原膠寡糖樣品溶于100 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙猓渲瞥?0 mg/mL黃原膠寡糖溶液。

1.10 抑菌圈測定

用微量移液器吸取100 μL指示菌菌懸液A涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，取直徑為7 mm的打孔器在涂有指示菌的培養(yǎng)基上打孔，吸取100 μL黃原膠寡糖溶液滴入孔中，每組試驗(yàn)設(shè)3個重復(fù)，以滴加蒸餾水作空白對照，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，取其平均值。

1.11 最小抑菌濃度(MIC)測定

以10 mg/mL黃原膠寡糖溶液作為原液，用孔徑為0.22 μm濾膜過濾，采用二倍稀釋法測定。用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基將原液分別稀釋2、4、8、16、32、64、128和256倍，取不同稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)液200 μL加入96孔酶標(biāo)板中，每孔加入10 μL指示菌菌懸液B；同時設(shè)陰性對照(僅含牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基)。于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，肉眼觀察，孔中菌液澄清判定為有抑菌效果，菌液渾濁則判定為有菌生長[13]。在澄清與渾濁的分界處，此稀釋濃度即為MIC，對每個濃度做3組平行試驗(yàn)。

1.12 最小殺菌濃度(MBC)測定

以最小抑菌濃度為基礎(chǔ)，用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基將寡糖原液分別稀釋2、4、8、16、32和64倍，分別編號1—6。接種大腸桿菌后，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，平皿中無細(xì)菌生長的培養(yǎng)皿所對應(yīng)濃度為最小殺菌濃度。

1.13 金黃色葡萄球菌抑菌活性檢測

金黃色葡萄球菌抑菌活性檢測方法與大腸桿菌相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃原膠寡糖的制備

相較于輻照、強(qiáng)酸堿、強(qiáng)氧化劑等對設(shè)備要求高和容易造成環(huán)境污染的缺點(diǎn)，微生物法降解黃原膠具有反應(yīng)條件溫和、易控制和污染小等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。球毛殼菌CGMCC 6882在以黃原膠為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中長勢良好(圖1)，說明球毛殼菌CGMCC 6882可以降解和利用黃原膠。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液經(jīng)過濾除菌、梯度醇沉、脫蛋白、除色素、柱層析分離和冷凍凍干處理，得到黃原膠寡糖樣品。

圖1 球毛殼菌CGMCC 6882在黃原膠培養(yǎng)基中的生長情況

2.2 黃原膠寡糖的單糖組成與分子質(zhì)量檢測

由圖2可知，商品級黃原膠和黃原膠寡糖所含單糖種類相同，均為葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，初步說明黃原膠經(jīng)球毛殼菌CGMCC 6882降解所得產(chǎn)物為黃原膠寡糖。同時，商品級黃原膠分子質(zhì)量約為3×106Da，而黃原膠寡糖分子質(zhì)量約為4.070×104Da。Song等[14]發(fā)現(xiàn)糖苷鍵類型和巖藻糖含量能夠影響Pleurotusgeesteranus多糖的抗氧化性，Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)Pleurotustuber-regium多糖分子質(zhì)量影響其抗腫瘤活性。單糖組成及比例和分子質(zhì)量大小會影響多糖及寡糖的生物活性，這可能使黃原膠寡糖具有不同生物活性。

圖2 商品級黃原膠和黃原膠寡糖的單糖組成

2.3 紅外光譜分析

圖3 商品級黃原膠和黃原膠寡糖的紅外光譜

2.4 抑菌圈直徑測定

參照Khan[17]抗生素抑菌效果的判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑大于15 mm為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，7～9 mm為低度敏感，無抑菌圈則為不敏感。由表1可知，黃原膠寡糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑分別為18.42 mm和33.51 mm，說明本試驗(yàn)所制備黃原膠寡糖對金黃色葡萄球菌抑菌效果更好。Jiang等[18]從綠豆皮中提取的兩種水溶性多糖MBP-1和MBP-2對大腸桿菌無抑制作用，對金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑分別為(8.8±0.3)mm和(9.3±0.3)mm。Mourad等[19]從烏賊皮和肌肉中所提取硫酸化多糖對大腸桿菌的最大抑菌圈直徑為(24.2±1.1)mm，但其對金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑為(18.0±0.0)mm。

表1 抑菌圈直徑

2.5 MIC和MBC測定

最小抑菌濃度與最小殺菌濃度是判斷抑菌物質(zhì)抑菌活性大小的重要指標(biāo)[20]。由表2可知，黃原膠寡糖對大腸桿菌的MIC和MBC分別為2.50 mg/mL和10.00 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為0.63 mg/mL和1.25 mg/mL。錢方[21]和李彥杰[8]所制備黃原膠寡糖對野油菜黃單胞菌具有很好的抑菌活性，黃成棟[22]所制備黃原膠寡糖對玉米大斑病菌、番茄早疫病菌、瓜類枯萎病菌和辣椒疫霉4種真菌具有較強(qiáng)抑制作用，但對大腸桿菌、白菜軟腐病菌、煙草青枯病菌、柑橘潰瘍、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌卻沒有任何抑制效果。多糖的抑菌活性可能與其結(jié)構(gòu)中單糖組成及比例、分子質(zhì)量大小、羥基與糖醛酸數(shù)量和比例、糖苷鍵種類與數(shù)量、硫酸化與否、空間結(jié)構(gòu)和水溶液黏度等相關(guān)[23]。

表2 黃原膠寡糖最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定結(jié)果

3 結(jié)論

與物理法和化學(xué)法相比，微生物法制備黃原膠寡糖具有反應(yīng)條件溫和、易控制、污染小等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)采用球毛殼菌CGMCC 6882降解黃原膠，所得黃原膠寡糖分子質(zhì)量為4.070×104Da，是商品級黃原膠(3×106Da)的百分之一左右。黃原膠寡糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，對大腸桿菌的MIC和MBC分別為2.50 mg/mL和10.00 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為0.63 mg/mL和1.25 mg/mL。