王巖松，賀明睿，王冬妍，姜鑫，羅景陽(yáng)，袁帥

（1.沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110124；2.沈陽(yáng)化工大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110142；3.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院,遼寧 沈陽(yáng) 110036）

溶膠-凝膠分子印跡技術(shù)是采用溶膠-凝膠法將模板分子引入無(wú)機(jī)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中制備分子印跡聚合物（Molecular Imprinted Polymer，MIP）的一項(xiàng)技術(shù)，是溶膠-凝膠法和分子印跡技術(shù)的結(jié)合體[1-3]。模板分子在聚合物基體中以共價(jià)鍵，非共價(jià)鍵，氫鍵等形成具有“記憶”功能的識(shí)別位點(diǎn)。模板分子脫離聚合物后留下與其結(jié)構(gòu)相匹配的立體空腔，通過(guò)立體空腔與識(shí)別位點(diǎn)對(duì)模板分子表現(xiàn)出特異的識(shí)別性[4-5]。目前分子印跡聚合物已廣泛應(yīng)用于分離技術(shù)、傳感技術(shù)、環(huán)境檢測(cè)、食品檢測(cè)等領(lǐng)域，展現(xiàn)了良好的性能和應(yīng)用前景[6-7]。

烯肟菌胺作為模板分子，均勻的鑲嵌在鈦酸丁酯的聚合物中，依靠烯肟菌胺分子構(gòu)型和物理吸附在聚合物中形成與之相匹配立體空間結(jié)構(gòu)，通過(guò)索氏提取洗脫模板分子后，保留具有特異吸附性能的空腔，空腔的比例和識(shí)別位點(diǎn)的分布直接影響著印跡聚合物的吸附性和特異性。優(yōu)化模板分子與功能單體的比例，聚合過(guò)程中酸的加入量，溫度的控制等實(shí)現(xiàn)烯肟菌胺分子印跡聚合物的最佳吸附性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

串聯(lián)質(zhì)譜儀（API 4000，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；液相色譜儀（LC 20A，日本島津公司）；電子天平（BS244S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-2，余姚市遠(yuǎn)東數(shù)控儀器廠）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市英峪予華儀器制造廠）；臺(tái)式離心機(jī)（800-1，金壇區(qū)西城區(qū)新瑞儀器廠）；恒溫水浴振蕩器（SHA-B，國(guó)華企業(yè)）；電子萬(wàn)用爐（DL-1，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）。

烯肟菌胺（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，沈陽(yáng)化工研究院）；氟嗎啉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%，沈陽(yáng)化工研究院）；烯酰嗎啉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，德國(guó)的Sigma公司）；無(wú)水乙醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；鈦酸丁酯（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；鹽酸（分析純，國(guó)藥有限公司）；冰乙酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）。

1.2 MIP的制備

準(zhǔn)確稱取0.382 4 g烯肟菌胺于250 mL三角瓶中，加入60 mL無(wú)水乙醇攪拌至完全溶解。逐滴加入一定量的鈦酸丁酯，充分混勻后緩慢加入一定體積的鹽酸（1 mol·L-1），再加入1 mL 去離子水，在一定溫度的水浴中攪拌5 h得到透明溶膠。取出三角瓶置于40℃烘箱中保溫48 h形成凝膠，升高溫度至60℃干燥24 h，充分研磨后置于索氏提取器中，60 mL無(wú)水乙醇-乙酸（體積比為8∶2）提取6 h，反復(fù)多次用甲醇-水（體積比為1∶1）超聲洗脫至洗脫液為中性后用甲醇洗脫，LC-MS/MS檢測(cè)不到烯肟菌胺分子為止，將聚合物置于60℃烘箱中烘干后得到烯肟菌胺分子印跡聚合物，置于干燥器中備用。

非分子印跡聚合物（NIP）的制備步驟除不添加烯肟菌胺，與MIP 制備方法一致。

1.3 MIP的性能表征

1.3.1 LC-MS/MS檢測(cè)的條件

Symmetry C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)；流動(dòng)相A為水，B為甲醇，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸；線性梯度洗脫程序：0～1 min為10%B，1～5 min由10%B變?yōu)?5%B，5～7 min由80%B變?yōu)?5%B，7～7.5 min由95%B變?yōu)?0%B，7.5～10 min 保持10%B。流速：0.3 mL·min-1。柱溫：35℃。進(jìn)樣體積10 μL。

電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)，正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)；電噴霧電壓(ionspray voltage IS)：5 500 V；霧化氣壓力：65 psi (448.16 kPa)；氣簾氣壓力：15 psi（103.42 kPa）；輔助氣壓力：65 psi（448.16 kPa）；離子源溫度：550℃；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量(collision energy，CE)及去簇電壓(declustering potential,DP)見(jiàn)表1。

表1 烯肟菌胺、氟嗎啉和烯酰嗎啉的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.2 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取20 mg MIP和NIP各7份，分別置于10 mL塑料離心管中，加入5 mL烯肟菌胺水溶液（10 mg·L-1）30℃恒溫水浴震蕩，不同時(shí)間間隔同時(shí)取出MIP和NIP各1份，離心后取上清液100 μL置于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，取1 mL溶液過(guò)0.22濾膜，供LC-MS/MS測(cè)定。10、20、30、40、50、60、80 min吸附量Q與吸附時(shí)間t作圖，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。吸附量計(jì)算見(jiàn)式（1）。

式中：Q—吸附量，μg·g-1；

V—烯肟菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

C0—烯肟菌胺的初始質(zhì)量濃度，ng·mL-1；

C1—吸附后烯肟菌胺的質(zhì)量濃度，ng·mL-1；

W—聚合物的質(zhì)量，mg。

1.3.3 靜態(tài)平衡吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取20 mg MIP和NIP各6份，置于10 mL塑料離心管中，分別加入2、4、6、8、10和12 μg·mL-1的烯肟菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，在30℃下恒溫震蕩60 min后離心，取上清液100 μL置于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，取1 mL溶液過(guò)0.22濾膜，供LC-MS/MS測(cè)定。吸附量Q與烯肟菌胺濃度C作圖，繪制等溫吸附曲線。

1.3.4 MIP選擇性吸附實(shí)驗(yàn)

取20 mg MIP各3份置于10 mL塑料離心管中，分別加入5 mL質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的烯肟菌胺、氟嗎啉和烯酰嗎啉水溶液，恒溫震蕩一定時(shí)間，供LC-MS/MS測(cè)定。比較MIP 對(duì)3種化合物的吸附性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同制備條件對(duì)MIP吸附性能的影響

2.1.1 印跡分子與交聯(lián)劑的摩爾比對(duì)MIP吸附量的影響

通過(guò)改變烯肟菌胺與鈦酸丁酯的摩爾比，考察其成膠效果和對(duì)MIP吸附性能的影響，制備過(guò)程中其他條件保持不變。

比較了烯肟菌胺與鈦酸丁酯摩爾比為1∶10、1∶15、1∶20時(shí)，隨著鈦酸丁酯的量的增大成膠時(shí)間縮短，在摩爾比為1∶20時(shí)，膠體渾濁并出現(xiàn)乳白色懸浮顆粒。準(zhǔn)確稱取不同摩爾比的MIP各20 mg，置于10 mL質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的烯肟菌胺水溶液中，室溫下震蕩吸附60 min，之后離心，上清液供LC-MS/MS測(cè)定。計(jì)算吸附量Q，分別為375、1 110和720 μg·g-1。推測(cè)在鈦酸丁酯比例較低時(shí)，模板分子在聚合物中沒(méi)有形成獨(dú)立的空腔，特異識(shí)別位點(diǎn)較少，導(dǎo)致吸附性能較差。隨著鈦酸丁酯比例的增加，模板分子在聚合物中均勻的分散，形成完整獨(dú)立的空腔和與模板分子相匹配的識(shí)別位點(diǎn)，因此吸附性能較強(qiáng)。但是隨著鈦酸丁酯比例的繼續(xù)增加，模板分子在聚合物中形成空腔和識(shí)別位點(diǎn)的數(shù)量相對(duì)下降，同時(shí)部分模板分子被包裹在聚合物中無(wú)法脫離，導(dǎo)致MIP的吸附性能下降。因此實(shí)驗(yàn)選擇烯肟菌胺與鈦酸丁酯的摩爾比為1∶15。

2.1.2 酸的用量對(duì)MIP吸附量的影響

在聚合反應(yīng)中，不改變其他聚合反應(yīng)條件的同時(shí)，嘗試不同酸的加入量考察對(duì)MIP吸附量的影響。

在5組聚合反應(yīng)中分別加入濃度為1 mol·L-1的鹽酸0.5、1.2、1.5、1.7、2.5 mL，鹽酸的加入量為0.5和2.5 mL時(shí)，溶液未形成膠體狀態(tài)，加入量為1.2、1.5和1.7 mL時(shí)，形成了透明的膠體，隨著酸加入量的增加，成膠速度加快。當(dāng)酸的加入量為1.5 mL時(shí)，MIP的吸附量最大為1 170 μg·g-1，減少和加大鹽酸的加入量，吸附量都會(huì)相應(yīng)地下降。因?yàn)殁佀岫□в须娯?fù)性，少量H離子存在中和了電負(fù)性，提高分子間碰撞的概率，催化聚合反應(yīng)。但是過(guò)量的H離子的存在，使得聚合反應(yīng)過(guò)快，在短時(shí)間形成了較大的膠粒，模板分子被完全封鎖在聚合物中間無(wú)法洗脫出來(lái)，降低了MIP應(yīng)有的特異吸附性。因此綜合以上實(shí)驗(yàn)，選擇酸的加入量為1.5 mL。

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)MIP吸附量的影響

溫度是聚合反應(yīng)速率的重要因素，實(shí)驗(yàn)比較了35、40、45、50℃條件下對(duì)聚合反應(yīng)的影響。在35℃聚合時(shí)，10 h 未形成膠體。在40和45℃聚合時(shí)，分別在5和4.5 h形成無(wú)色透明溶膠狀態(tài)，在50℃時(shí)3后溶液出現(xiàn)黏稠狀，很快出現(xiàn)白色懸浮顆粒。對(duì)40和45℃制備的MIP進(jìn)行了吸附量的測(cè)定，45℃制備的MIP吸附量1 170 μg·g-1略高于40℃制備的MIP吸附量1 085 μg·g-1，因此實(shí)驗(yàn)選擇聚合反應(yīng)溫度為45℃。

2.2 MIP吸附性能實(shí)驗(yàn)

2.2.1 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)是為了考察吸附量隨著吸附時(shí)間的增加的變化情況，MIP和NIP吸附量隨著吸附時(shí)間的變化曲線見(jiàn)圖1。如圖所示，在30 min內(nèi)MIP吸附量迅速增大，30到60 min加大緩慢，60到80 min處于平衡狀態(tài)，NIP 在20 min后趨于平衡，在吸附曲線平衡階段MIP的吸附量明顯高于NIP。因?yàn)槲介_始階段，溶液中模板分子濃度較大與聚合物接觸頻率較大，模板分子迅速與聚合物表面形成物理吸附，NIP 在20 min附近達(dá)到了飽和吸附；30 min前MIP在表面吸附同時(shí)模板分子進(jìn)入“記憶”空腔，隨著空腔和識(shí)別位點(diǎn)被占據(jù)增大了模板分子進(jìn)入深層次空腔的阻力，吸附速率下降。在超聲震蕩的作用下，60 min后MIP達(dá)到了飽和吸附。

圖1 MIP和NIP對(duì)烯肟菌胺的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

2.2.2 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

采用靜態(tài)吸附法，考察在一定的條件下MIP和NIP對(duì)不同濃度的烯肟菌胺的吸附量。根據(jù)不同濃度下吸附量的變化，以不同溶液中烯肟菌胺濃度為橫坐標(biāo)，吸附量Q為縱坐標(biāo)，作MIP和NIP的等溫吸附曲線，吸附時(shí)間為60 min，見(jiàn)圖2。

圖2 聚合物的靜態(tài)吸附曲線

如圖2所示，MIP和NIP都表現(xiàn)出隨著吸附烯肟菌胺濃度的升高吸附量變大的趨勢(shì)，NIP的吸附曲線比較平穩(wěn)，MIP曲線在4到8 μg·mL-1出現(xiàn)了突越，MIP結(jié)構(gòu)中印跡空腔和識(shí)別位點(diǎn)與烯肟菌胺濃度相匹配，烯肟菌胺分子在MIP中迅速占位，在質(zhì)量濃度達(dá)到10 μg·mL-1時(shí)吸附行為達(dá)到終點(diǎn)，最大吸附量為1 170 μg·g-1。NIP依靠自身的縫隙和疏松的結(jié)構(gòu)也存在一定的吸附行為，飽和吸附量為520 μg·g-1。

2.2.3 MIP選擇性的考察

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，比較了MIP對(duì)烯肟菌胺、氟嗎啉和烯酰嗎啉的吸附能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果MIP對(duì)烯肟菌胺的吸附量明顯高于氟嗎啉和烯酰嗎啉，為1 170 μg·g-1。對(duì)氟嗎啉和烯酰嗎啉的吸附量分別為545和560 μg·g-1，略高于NIP。氟嗎啉和烯酰嗎啉的結(jié)構(gòu)比較相近，吸附量也變化不大，再次證明MIP結(jié)構(gòu)中形成的記憶空腔和識(shí)別位點(diǎn)只與烯肟菌胺分子相匹配，與氟嗎啉和烯酰嗎啉的分子結(jié)構(gòu)不具有識(shí)別功能。

3 結(jié) 論

以烯肟菌胺為模板分子，采用溶膠-凝膠法制備了分子印跡聚合物，摸索出事宜的制備條件，通過(guò)吸附性能實(shí)驗(yàn)證明了MIP具有較強(qiáng)的吸附性，能夠選擇性吸附烯肟菌胺分子。實(shí)驗(yàn)將利用MIP的特異選擇性吸附應(yīng)用食品中烯肟菌胺殘留的固相萃取。