崔學強，李富榮，張偉宏，葸 靜，金哲宇,4，樸文花

2019年12月，在湖北武漢暴發(fā)了病毒性肺炎疫情，對病毒全基因組測序證實其為一種新的乙型冠狀病毒屬病毒[1-2]。新型冠狀病毒核酸陽性可作新型冠狀病毒確診的方法之一，但檢測結(jié)果為陰性時不能判斷患者是否被感染[3-5]。實時熒光PCR檢測過程中會受到多種因素的影響[6-7]，導致檢測結(jié)果的異常，甚至出現(xiàn)假陰性報告。我們在實際工作中對影響核酸檢測的多種因素進行分析，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2020年2月12日-2020年3月13日就診于某醫(yī)院2 122例有發(fā)熱、干咳、呼吸困難等疑似新型冠狀病毒肺炎患者的標本為研究對象。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及運輸：由經(jīng)過培訓的醫(yī)務人員采集患者的鼻拭子、咽拭子后分別置于樣本保存管中，按A類傳染病的運輸包裝分類(UN2814)運送至我中心專設的標本接收處。所有標本檢測前經(jīng)65 ℃，20 min水浴滅活處理。

1.2.2 試劑：擴增試劑選用國家藥品監(jiān)督管理局獲批新冠病毒核酸檢測6種國產(chǎn)試劑，分別以A-F(批號分別為：2020003，2020102，20206530，2020012，2020113，2020252)表示；核酸提取選擇已獲得國家藥監(jiān)局批準上市的6種可用于新型冠狀病毒核酸提取純化試劑盒，編號分別為A(批號為2020003)、B(批號為2020002)、C(批號為P20200101)、D(批號為20026530)、E(批號為20200110)、F(批號為43556600)。

1.3 主要儀器：ABI7500型PCR儀，科華DP-1000型核酸提取儀，上海之江EX3600型核酸提取儀，Thermo Nano Drop微紫外/可見光分光光度計。

1.4 試驗方案

1.4.1 標本采集人員的影響：標本采集人員分A、B 2個組，A組為耳鼻喉科、發(fā)熱門診、感染科的醫(yī)護人員，B組為其他科室的醫(yī)護人員。對同一天采集的分別為65例、69例疑似患者的標本在相同的實驗條件下進行檢測后，分析2組人員檢測結(jié)果的Ct值和ΔRn值。

1.4.2 實驗室檢測人員的影響：實驗室檢測人員分為培訓前組和培訓后組2組，將培訓前檢測的60例樣本的檢測數(shù)據(jù)稱為培訓前組；-80℃保存樣本，待檢測人員培訓后重新分析凍存的60例樣本，以再次檢測60例樣本的數(shù)據(jù)稱為培訓后組，分析2組人員以手工法提取核酸后檢測結(jié)果的Ct值和ΔRn值。

1.4.3 標本采集部位的影響：同時采集60例疑似患者的咽拭子、鼻拭子樣本，將60份咽拭子分為咽拭子組，將60份鼻拭子和咽拭子合并后充分混合后稱為混合組，在相同的實驗條件下提取核酸，分析2組不同采集部位核酸檢測結(jié)果的Ct值和ΔRn值。

1.4.4 核酸提取方法的影響：將68例疑似患者的樣本分別采用手工核酸提取方法，以磁珠法、濃縮法、一步裂解法進行核酸提取后分為3組，使用Thermo Nano Drop微紫外/可見光分光光度計分別檢測提取后核酸濃度及A260/A280比值，并分析3組方法提取核酸檢測結(jié)果的Ct值和ΔRn值。

1.4.5 核酸檢測試劑的影響：將檢測新冠病毒核酸6種國產(chǎn)試劑分為A-F 6組，將1例確診為陽性患者的標本分別進行1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024倍稀釋后，分析6組核酸檢測試劑檢測結(jié)果情況。

1.5 核酸擴增：使用ABI7500 PCR 儀根據(jù)不同廠家試劑說明書設置反應程序進行上機檢測，并對擴增后的結(jié)果進行判定。每批次試驗必須帶陰性、陽性質(zhì)控[8]，每批次檢測中應設置1個弱陽性質(zhì)控和3個陰性質(zhì)控，弱陽性質(zhì)控檢測結(jié)果為陽性，隨機放在檢測樣本中的3份陰性質(zhì)控檢測結(jié)果均為陰性，否則為失控，需要分析失控原因后重新實驗。

2 結(jié)果

2.1 2組采樣人員采樣后的檢測結(jié)果比較：A組采集的65例樣本，IC基因Ct值的均值為25.383±1.347，ΔRn值的均值為152 253.371±6 317.134；B組采集的69例樣本，IC基因Ct值的均值為30.114±2.441(P<0.05)，ΔRn值的均值為118 229.671±8 587.445，均有明顯差異(P<0.05)。此外在檢測的2 122例標本中內(nèi)標不出64例，占總檢測人數(shù)的2.80%(64/2 122)，ΔRn<25 000的51例，占總檢測人數(shù)的2.21%(51/2 122)，見表1。

2.2 培訓前組和培訓后組檢測人員檢測結(jié)果比較：培訓前組IC基因Ct值為26.23～32.35，ΔRn值為72 103.62～150 987.27；培訓后組IC基因Ct值為24.45～28.44，ΔRn值為85 241.557～165 151.148，培訓前后IC基因Ct值分別為31.193±2.235、26.126±1.125(P<0.05)，ΔRn值分別為126 814.264±7254.541、147 401.851±5 302.586，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3 鼻咽拭子混合組和咽拭子組檢測結(jié)果比較：60例疑似患者采集咽拭子組和鼻咽拭子混合組進行病毒核酸檢測后，IC基因Ct值分別為24.928±0.985和27.050±1.050(P<0.05)，ΔRn值分別為171 344.522±7 346.287、129 980.581±8 341.773，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 標本采集人員、核酸檢測人員、不同采集部位檢測結(jié)果比較

2.4 不同核酸提取方法檢測結(jié)果比較：68例樣本分別進行手工一步裂解法、濃縮法、磁珠法核酸提取后，IC基因Ct值分別為32.889±2.602、26.285±0.953、23.996±0.549(F=13.28，P<0.05)；ΔRn值分別為119 463.815±18 364.599、147 280.282±9 875.452、203 762.625±5 674.936(F=6.033，P<0.05)；提取的核酸經(jīng)Thermo Nano Drop超微量紫外分光儀測定核酸A260/280比值，結(jié)果分別為0.435±0.038、0.677±0.098、1.815±0.108，差異有統(tǒng)計學意義(F=5.353，P<0.05)。

2.5 6種核酸檢測試劑檢測結(jié)果比較：將1例確診新冠陽性患者的標本進行1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024倍稀釋后，使用6種獲批的國產(chǎn)核酸檢測試劑進行檢測，A～F 6組檢測試劑在1∶64倍稀釋后均能檢出陽性，但在1∶256倍稀釋后E檢測試劑仍能檢出陽性，而在1∶1 024倍稀釋后6種檢測試劑均未檢出陽性，見表2。

表2 6種核酸檢測試劑陽性檢測情況

3 討論

COVID-19核酸檢測方法可作為常規(guī)確診檢測方法之一，但相關研究表明，新型冠狀病毒核酸檢測對于確診陽性病例的檢出率僅為30%～50%[9]。影響新型冠狀病毒核酸檢測的因素主要有：①標本采集人員未能采集到含有病毒的細胞或采集到細胞數(shù)量不足，而導致檢測結(jié)果的Ct值增加、ΔRn值降低等情況，同時會導致內(nèi)標不出、反應曲線呈非標準S型上升(呈折線、波浪線等)的情況，加強對標本采集人員的培訓，規(guī)范操作，可有效降低新型冠狀病毒核酸檢測的假陰性率。②有文獻報道，鼻拭子標本的陽性率高于咽拭子[10]，這可能與病毒在機體不同部位富集程度、病毒載量及患者的所處的不同病程階段有關，患者痰液標本在新型冠狀病毒肺炎的陽性檢出率較高，但患者表現(xiàn)為干咳等癥狀，痰標本不易采集，因此在標本采集過程中以鼻咽拭子為主。③磁珠法提取核酸的純度和濃度均高于濃縮法和一步裂解法，且磁珠法更易于自動化和高通量操作。有條件的實驗室在核酸提取的過程中盡量選用自動儀器法，其具有方便、快捷、重復性好、干擾因素少的優(yōu)點，提高工作效率的同時可進一步降低檢測人員感染的風險。④將1例強陽性標本進行4倍等比例稀釋后，在1∶256倍稀釋后E檢測試劑仍能檢出陽性，說明E檢測試劑的靈敏性較高，對弱陽性標本的檢出能力較強。在工作中盡量選擇經(jīng)過驗證的高質(zhì)量核酸檢測產(chǎn)品，以保證檢測結(jié)果的準確性和可靠性[11]。

進一步加強對臨床實驗室的管理，包括標本采集、運輸及保存、實驗室規(guī)范化操作等方面，也是保證檢測結(jié)果準確可靠的關鍵因素[12]。積極參加國家衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評活動，在很大程度上能夠保證新冠核酸檢測的準確性。此外，應開展核酸檢測和血清學聯(lián)合檢測的方法[13]，使其發(fā)揮其各自的優(yōu)勢，有效防止假陰性、假陽性報告的產(chǎn)生。當前針對新型冠狀病毒肺炎檢測的方法較少，且特異性較差等問題是面臨的主要困難。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，為應對新型冠狀病毒肺炎等突發(fā)性傳染病的快速診斷、治療提供了有力的武器[14-15]。

本研究對影響新型冠狀病毒核酸檢測密切相關的多種因素進行了分析和論證，為新型冠狀病毒核酸檢測工作提供了幫助。