陳德勝，張學(xué)森，郭鳳英，田佳寧，張佳林，李 燕

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是骨科最為常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，其主要特征在關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜增生、軟骨下骨硬化并骨贅形成[1-2]。通常多發(fā)生于中老年人，尤其在60歲以上的年齡群體。有統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示[3]，65歲以上人群中X線檢查結(jié)果表現(xiàn)為骨性關(guān)節(jié)炎病理改變的可達(dá)50%以上,而在75歲以上人群中,發(fā)生率高達(dá)80%左右。老年膝骨性關(guān)節(jié)炎在病變的終末期可出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)內(nèi)外翻畸形、屈曲攣縮畸形，疼痛和活動(dòng)受限，大多數(shù)患者需要人工全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療，給患者家庭和社會(huì)帶來極大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。如何有效防治老年膝骨關(guān)節(jié)炎是目前骨科研究的熱點(diǎn)。骨關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)病變最主要的發(fā)病部位是關(guān)節(jié)軟骨，軟骨細(xì)胞與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)相互依存，細(xì)胞外基質(zhì)作為一種載體供軟骨細(xì)胞吸收營養(yǎng)及傳遞信號(hào)。研究表明[4]，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)軟骨細(xì)胞合成眾多的因子和細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作為由軟骨細(xì)胞介導(dǎo)的調(diào)控系統(tǒng)。Notch 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)合成穩(wěn)定起著特別重要的作用[5-7]。本文通過免疫組化檢測(cè)老年膝骨關(guān)節(jié)炎并屈曲內(nèi)翻畸形采取人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中截骨去除的軟骨組織的Notch1及其配體Jagged1的表達(dá)情況，探索Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在老年膝骨關(guān)節(jié)炎病變發(fā)生、發(fā)展中的作用及其可能的作用機(jī)制，可為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎早期藥物預(yù)防和治療尋找有效的治療方法提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2018年10月-2020年1月因老年膝骨關(guān)節(jié)炎并屈曲內(nèi)翻畸形采取人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者35例為觀察組，男性11例，女性24例；年齡63～78歲，中位年齡67.5歲。老年膝骨關(guān)節(jié)炎患者均符合由中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)關(guān)節(jié)外科學(xué)組制定的2018版《骨關(guān)節(jié)炎診療指南》。選取因膝關(guān)節(jié)外傷行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療患者13例作為對(duì)照組，男性10例，女性3例；年齡19～55歲，中位年齡32.5歲。本研究已取得患者與患者家屬的知情同意且獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本收集及處理：觀察組患者取術(shù)中因關(guān)節(jié)截骨成形去除的股骨髁負(fù)重面的軟骨組織，對(duì)照組取術(shù)中因外傷脫落需要去除的股骨髁軟骨組織。選取相應(yīng)的骨組織立即置于無菌器械臺(tái)上，觀察組用組織剪除掉股骨髁負(fù)重面周圍軟組織，再用咬骨鉗咬去四周磨損較輕部位，選磨損嚴(yán)重部位裁剪成約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的軟骨組織標(biāo)本；對(duì)照組去除周圍碎骨，裁剪約0.25 cm×0.2cm×0.2 cm大小的軟骨組織標(biāo)本。將關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本放置10%中性多聚甲醛浸泡，再置于15%EDTA液中進(jìn)行脫鈣處理，持續(xù)約4周，當(dāng)大頭針可以輕松刺入骨組織時(shí)脫鈣結(jié)束。將標(biāo)本制作成蠟塊，以厚度為4 μm進(jìn)行切片，放在60 ℃烤片機(jī)中烘干后備用。

1.3 蘇木素-伊紅(HE)染色：將準(zhǔn)備好的玻片先后置入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ以及不同濃度酒精浸泡，用蒸餾水洗掉殘留酒精；加入蘇木素染色，自來水洗掉染液，鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來水沖洗，用0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗殘液；蘇木素染色后切片置入伊紅染液中染色，再置入95%酒精I(xiàn)、酒精I(xiàn)I、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫水透明，用中性樹膠對(duì)已脫水的切片進(jìn)行封片。

1.4 番紅 O-固綠染色：將烘干后備用玻片先后放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ及不同濃度酒精浸泡，蒸餾水洗掉殘留酒精；加入新鮮配制的Weigert染液染色，酸性乙醇分化液分化，蒸餾水沖洗；固綠染色液內(nèi)浸染，蒸餾水沖洗后置入Safranin O stain內(nèi)浸染，蒸餾水沖洗；乙酸溶液洗滌去除殘留的固綠，蒸餾水沖洗，乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡，再用中性樹膠進(jìn)行封片。

1.5 免疫組織化學(xué)染色：切片在68 ℃中烤片2 h后入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇浸泡，并用自來水、蒸餾水沖洗； 3% H2O2孵育，將切片小心放入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液煮沸的沸水中進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加羊血清于玻片封閉；PBS液沖洗，滴加一抗(Notch1、Jagged1)孵育，4℃過夜；PBS沖洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育；PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白稀釋液，37 ℃孵育；滴加DAB液靜置數(shù)分鐘，置于顯微鏡下觀察顯色，適時(shí)終止。用流水沖洗，蘇木素液對(duì)已顯色的切片復(fù)染，流水輕洗；1%鹽酸酒精分化，流水輕洗；碳酸鋰返藍(lán)，流水輕洗，95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡，用中性樹脂封片。將每張切片放置在400倍鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核被著黃褐色為Notch1、Jagged1陽性骨細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)觀察組及對(duì)照組Notch1、Jagged1陽性骨細(xì)胞個(gè)數(shù),以陽性細(xì)胞率(染色陽性的骨細(xì)胞個(gè)數(shù)/總的骨細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%)表示蛋白的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 蘇木素-伊紅(HE)染色：觀察組軟骨表面粗糙不平整，軟骨表層變薄，表層有較大的缺損區(qū)出現(xiàn)，鈣化層細(xì)胞排布不均勻，排列成棉絮狀，軟骨細(xì)胞數(shù)目大量減少，細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞層次比較紊亂，出現(xiàn)局部的細(xì)胞核固縮、核壞死，潮線不連續(xù)及部分或完全消失，有的出現(xiàn)復(fù)制或漂移，甚至有的表現(xiàn)為多條潮線。部分區(qū)域軟骨細(xì)胞有局灶增生，軟骨基質(zhì)染色明顯不均勻、色變淡；對(duì)照組軟骨面光滑，平整，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞染色清晰，軟骨組織各層辨別清楚，潮線完整連續(xù)，軟骨基質(zhì)染色均勻(圖1,目錄后)。

2.2 番紅 O-固綠染色：觀察組鏡下觀察可見軟骨表面不光滑，部分出現(xiàn)表層潰瘍表現(xiàn)。軟骨各層排列不均勻，軟骨細(xì)胞數(shù)明顯減少、大小不等，有的排列成簇，輪廓不清晰，出現(xiàn)部分細(xì)胞壞死表現(xiàn)。番紅染色深染或失染，鈣化層增厚，伴有血管長(zhǎng)入，潮線間隙增寬或者不連續(xù)性中斷，甚至出現(xiàn)潮線前移、紊亂及消失。對(duì)照組鏡下觀察可見軟骨細(xì)胞排列均勻，潮線連續(xù)，潮線下軟骨下骨染色呈藍(lán)色，番紅染色輕染，軟骨基質(zhì)輕度纖維化(圖2,目錄后)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色：免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，受體Notch1、配體Jagged1在觀察組及對(duì)照組均有表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)。觀察組中Notch1為0.51±0.14、Jagged1為0.45±0.07；觀察組中Notch1為0.22±0.11、Jagged1為0.27±0.09。2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1及圖3-圖4(目錄后)。

表1 Notch1、Jagged1免疫組化染色結(jié)果

3 討論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是以膝關(guān)節(jié)軟骨退變、丟失、破壞，并出現(xiàn)軟骨下骨硬化，軟骨下骨及關(guān)節(jié)邊緣反應(yīng)性增生、骨贅形成、關(guān)節(jié)間隙狹窄等一系列病理改變表現(xiàn)[8]。其發(fā)病率與年齡密切相關(guān)，隨著年齡的增長(zhǎng)，膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐年增高，尤其以女性絕經(jīng)期后更為多見。

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)病變最早期最主要發(fā)病部位是關(guān)節(jié)軟骨。正常狀況下，關(guān)節(jié)軟骨的生成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡中，受到細(xì)胞外基質(zhì)、基質(zhì)蛋白酶、炎癥因子、炎性介質(zhì)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多因素的調(diào)控[9]。由于機(jī)械壓力及無菌性炎癥等刺激下關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退行性病理改變，隨著病情發(fā)展，進(jìn)一步激發(fā)大量炎性因子，反應(yīng)性加速關(guān)節(jié)軟骨退變及加重軟骨凋亡[10]。本文研究的Notch1及其配體Jagged1在膝關(guān)節(jié)軟骨組織的表達(dá)與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎有明顯相關(guān)性。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎病變發(fā)生發(fā)展與Notch、NF-κB、Wnt、MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控有關(guān)，而Notch 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是有著極其重要的相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[11]，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞本身與細(xì)胞間的生物活動(dòng)中起著重要作用。Notch由受體、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子、配體、其他 的效應(yīng)物和調(diào)節(jié)分子等組成，Notch信號(hào)的激活依賴于相鄰細(xì)胞間的配體與受體的結(jié)合[12]。

本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組的Notch1及其配體Jagged1的陽性細(xì)胞率表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，Notch1及其配體Jagged1與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變程度有一定的正相關(guān)性。也表明Notch信號(hào)通路表達(dá)水平在骨性關(guān)節(jié)炎中發(fā)生變化，軟骨細(xì)胞表型改變，Notch-1、Jagged-1大量表達(dá)。與正常人關(guān)節(jié)軟骨相比，骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，受體Notch1、配體Jagged1及靶基因Hes5大量表達(dá)[13]。KARLSSON等[14]發(fā)現(xiàn)Notch-1、Jagged-1 和 HES5 在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中表達(dá)范圍較正常軟骨中的表達(dá)范圍明顯擴(kuò)大。Notch1 陽性率與骨性關(guān)節(jié)炎軟骨Outerbridge分級(jí)相關(guān)，隨著軟骨退變的加重，淺層及中層軟骨細(xì)胞Notch1陽性率增高。此外，本文通過病理觀察，觀察組中關(guān)節(jié)軟骨不完整，關(guān)節(jié)軟骨面毛糙，軟骨各層辨別不清晰，軟骨基質(zhì)缺失，膠原染色減弱。這些關(guān)節(jié)軟骨病理變化均與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎病理研究結(jié)果相符合。

綜上所述，Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與老年骨關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)軟骨退行性改變密切相關(guān)，也可能參與調(diào)控老年膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的病理改變。