張 偉，劉志文＊，王小琴，李至敏，謝琮琮，李志敏*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學 理學院，江西 南昌 330045）

【研究意義】蛋白質(zhì)是一切生命活動的物質(zhì)基礎，如何獲得高純度且保持活性的目的蛋白是深入研究生命活動的關鍵問題[1]。由于微生物操作簡單、繁殖速度快等巨大優(yōu)勢，采用微生物生產(chǎn)活性蛋白的方法已被廣泛應用于生物學和生物醫(yī)學研究領域[2]。其中采用微生物進行異源表達重組蛋白是常用的手段，目前表達重組蛋白的系統(tǒng)可以分為細菌、酵母、絲狀真菌、單細胞藻類、桿狀病毒、昆蟲細胞、植物細胞、哺乳動物細胞等，具體選擇何種細胞來進行異源表達取決于目的蛋白[3]?！厩叭搜芯窟M展】大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前發(fā)展最為完善也是最常用的高效異源表達重組蛋白的原核表達系統(tǒng)[4]。Page 等[5]研究了在大腸桿菌中以最經(jīng)濟的方式實現(xiàn)最大化表達異源蛋白的策略。Ceccarelli 等[6]綜述了大腸桿菌異源表達重組蛋白的諸多方案和面臨的挑戰(zhàn)。然而，大腸桿菌表達系統(tǒng)也存在諸多缺點。例如，利用大腸桿菌異源表達真核生物來源的蛋白時不能進行翻譯后修飾，不能充分形成二硫鍵導致無法獲得可溶性蛋白等。因此很多在大腸桿菌表達系統(tǒng)中成功異源表達的蛋白以包涵體的形式存在。為了提高重組蛋白在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的可溶性，研究人員開發(fā)了多種助溶標簽，如硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）及小分子泛素樣修飾蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）等[7-10]。其中一些標簽還有助于重組蛋白的分離純化。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)DnaK、DnaJ、GrpE、GroES、GroEL、tig 等分子伴侶蛋白可以幫助新生蛋白質(zhì)組裝和正確折疊，從而提高重組蛋白可溶性，甚至提高其穩(wěn)定性和活性[11-13]?！颈狙芯壳腥朦c】α-酮戊二酸脫羧酶（α-KGD，EC 4.1.1.71）催化α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛，琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脫氫酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為琥珀酸從而進入三羧酸循環(huán)。由于藍細菌中缺乏α-酮戊二酸脫氫酶，因此α-KGD 就成了藍細菌三羧酸循環(huán)中關鍵酶之一[14]。目前關于α-KGD的研究非常少，最新研究也僅停留在催化動力學上，其結(jié)構(gòu)功能關系和催化機制研究均未有報道[15]。本課題組發(fā)現(xiàn)多種藍細菌來源的α-KGD 在大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行異源表達后在裂解液上清中的可溶性不高，主要以包涵體的形式存在于沉淀中，非常難以獲得大量的可溶性α-KGD，這可能是造成目前未有研究報道有關α-KGD 的結(jié)構(gòu)功能關系及催化機制的重要原因之一?！緮M解決的關鍵問題】在NCBI 數(shù)據(jù)庫中集胞藻PCC6803 中的sll1981基因被標注為編碼乙酰乳酸合成酶。然而本課題組通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)sll1981基因編碼蛋白和聚球藻PCC7002 中的a2770基因編碼蛋白的氨基酸序列一致性達到80%。聚球藻PCC7002 中的a2770 蛋白已被證實為一個α-KGD[14]。為了闡明集胞藻PCC6803 中的sll1981基因編碼蛋白的功能，首先就要獲得可溶性的重組sll1981 蛋白。因此本試驗以來自集胞藻PCC6803 中的sll1981基因編碼蛋白為研究對象，構(gòu)建了含有sll1981基因的多種表達載體，探索了這些表達載體在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的表達和可溶性情況，并比較不同方法表達后分離純化得到的sll1981 蛋白催化活性。動力學測試表明集胞藻PCC6803 中sll1981基因編碼蛋白為α-KGD。本研究為在大腸桿菌中異源表達α-KGD 提供了重要信息，也將有助于該酶的結(jié)構(gòu)功能關系及催化機制的進一步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 集胞藻PCC6803 基因組DNA、pET-28b 質(zhì)粒、pET-32a 質(zhì)粒、pCold-TF 質(zhì)粒和分子伴侶pTf16質(zhì)粒由本實驗室保藏；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 T4 DNA 連接酶、DNA Marker 購自北京全式金生物技術有限公司；2×PfuPCR Master-Mix、質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PageRuler 預染蛋白Ladder 購于ThermoFisher Scientific 公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI 和NdeI 購自NEW ENGLAND BioLabs；牛凝血酶（Thrombin）購于Sigma-Aldrich公司；Ni-NTA Agarose 購自QIAGEN公司；其他化學試劑均為分析純，購于北京索萊寶生物科技有限公司；魚腥藻PCC7120來源的琥珀酸半醛脫氫酶（ApSSADH）由本實驗室純化。

1.2 PCR擴增sll1981基因

以集胞藻PCC6803 基因組DNA 為模板擴增sll1981基因，使用ApE 軟件設計上游引物sll1981-F（AAATTTGGATCCATGGGGCAAATGAACACCGCAG）和下游引物sll1981-R（AATAATCTCGAGTTATT CCCAAATTTCACAGGCC）（序列中下劃線為相應酶切位點）。反應體系包含基因組1 μL（終濃度為30 ng/μL），sll1981-F 和sll1981-R 各1μL（終濃度為0.2μmol/L），2×PfuPCR MasterMix 為25μL，加超純水22μL 至總體積50μL。擴增反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min[16]。PCR 反應結(jié)束后得到的產(chǎn)物經(jīng)1.5%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠純化PCR產(chǎn)物。

1.3 含有sll1981基因的表達質(zhì)粒的構(gòu)建

回收得到的30μL PCR 產(chǎn)物中加入10×buffer 5μL，NdeI 和XhoI 限制性內(nèi)切酶各1μL，置于37 ℃水浴恒溫酶切1 h。同理，用相應的限制性內(nèi)切酶對pET-28b載體進行消化。膠回收酶切片段后用T4 DNA連接酶于16 ℃恒溫水浴下過夜連接（目的片段與載體片段的摩爾比為9∶1）。次日取連接液10μL 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，然后再涂布于卡那霉素抗性平板上篩選，次日挑取單克隆菌落做PCR鑒定和DNA 測序鑒定。將測序正確的質(zhì)粒保存為pET28b-sll1981質(zhì)粒。用同樣的方法構(gòu)建pET32asll1981質(zhì)粒和pColdTF-sll1981質(zhì)粒。

1.4 重組sll1981蛋白誘導表達條件的優(yōu)化

1.4.1 重組sll1981蛋白的誘導表達 挑取轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981質(zhì)粒的單克隆菌落于含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，次日按體積分數(shù)1%（v/v）接種量加入新鮮LB培養(yǎng)液中進行菌體擴大培養(yǎng)。待培養(yǎng)液OD600至0.6～0.8 時立即冰水浴30 min，然后加入終濃度為0.2 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導劑于16 ℃、180 r/min條件下誘導表達24 h。次日以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心收集菌體，得到的菌體用20 mmol/L pH 7.5 的Tris-HCl 緩沖液重懸，隨后置于冰水浴中超聲破碎（變幅桿Φ 為10 mm，超聲工作2 s，間歇8 s，有效功率10%（W/W），工作總時間5 min）。細胞破碎液于4 ℃、12 000 r/min離心30 min得到上清液和沉淀，最后電泳檢測sll1981蛋白表達情況。

1.4.2 誘導溫度的優(yōu)化 采用上述方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981質(zhì)粒的大腸桿菌菌體，在加入0.2 mmol/L IPTG 后，將菌體分別置于16 ℃、20 ℃和25 ℃條件下誘導表達24 h，最后電泳檢測sll1981 蛋白表達情況。

1.4.3 誘導時間的優(yōu)化 采用上述同樣的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981質(zhì)粒的大腸桿菌菌體，加入0.2 mmol/L IPTG 后將菌體置于16 ℃、180 r/min 的恒溫搖床培養(yǎng)箱中分別誘導表達6，12，24 h，最后電泳檢測sll1981蛋白表達情況。

1.4.4 誘導劑濃度的優(yōu)化 采用上述同樣的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981質(zhì)粒的大腸桿菌菌體，在菌體OD600至0.6～0.8 時分別加入終濃度為0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 和1.0 mmol/L 的IPTG，然后將菌體均置于16 ℃、180 r/min條件下誘導表達24 h，最后電泳檢測sll1981蛋白表達情況。

1.4.5 溶氧量的優(yōu)化 將轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981質(zhì)粒的菌體過夜培養(yǎng)液分別接種于含有100，200，300，400 mL新鮮LB培養(yǎng)液的1 L錐形瓶中進行菌體擴大培養(yǎng)，待培養(yǎng)液OD600至0.6～0.8時，立即冰水浴30 min，再向其中加入0.2 mmol/L IPTG，置于16 ℃、180 r/min 條件下誘導表達24 h，最后電泳檢測sll1981 蛋白表達情況。

1.5 重組sll1981蛋白的自誘導表達

將轉(zhuǎn)化有pET28b-sll1981表達質(zhì)粒和pET-28b 對照質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）細胞分別于含有50μg/mL 卡那霉素的LB 培養(yǎng)液中恒溫過夜培養(yǎng)。次日，用4 個滅菌處理后的離心管分別離心收集體積分數(shù)1%接種量的菌體，接著用自誘導培養(yǎng)液重懸收集的細胞，再將細胞接種至100 mL 含有100μg/mL卡那霉素的新鮮自誘導培養(yǎng)液中，自誘導培養(yǎng)液按照文獻配置[17]。然后將上述菌體置于16 ℃、180 r/min條件下分別自誘導表達16，20和24 h。最后電泳檢測自誘導表達sll1981蛋白情況。后文將用此法獲得的sll1981蛋白標注為Auto-sll1981。

1.6 重組sll1981蛋白與分子伴侶pTf16質(zhì)粒共表達

采用CaCl2法制得轉(zhuǎn)化有分子伴侶質(zhì)粒pTf16 的大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，再將pET28bsll1981質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至該感受態(tài)細胞。挑取菌落加入到同時含有50μg/mL 卡那霉素和25μg/mL 氯霉素的LB 培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。次日按體積分數(shù)1%接種量接種至含終濃度為1 mg/mL L-（+）-阿拉伯糖的新鮮LB 液體培養(yǎng)基（含上述相應濃度抗生素）中進行菌體擴大培養(yǎng)。待培養(yǎng)液OD600約為0.8 時冰水浴冷卻30 min，然后加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG，置于16 ℃、180 r/min 條件下誘導表達24 h。最后電泳檢測分子伴侶tig蛋白與sll1981蛋白共表達情況。后文將用此法獲得的sll1981蛋白標注為Co-sll1981。

1.7 不同表達質(zhì)粒上sll1981蛋白的誘導表達

將上述構(gòu)建成功的pET28b-sll1981、pET32a-sll1981和pColdTF-sll19813 種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞。挑取單菌落分別于含50μg/mL 卡那霉素、100μg/mL 氨芐青霉素和100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。次日按體積分數(shù)1%接種量分別加入100 mL新鮮LB培養(yǎng)液（含上述相應濃度抗生素）中進行菌體擴大培養(yǎng)，待培養(yǎng)液OD600至0.6～0.8時立即冰水浴30 min，然后向其中加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG，于16 ℃、180 r/min 條件下誘導表達24 h。最后電泳檢測sll1981 蛋白表達情況。后文分別標注為sll1981、Trx-sll1981和TF-sll1981。

1.8 重組sll1981蛋白的分離純化

利用鎳親和層析的方法對上述sll1981 蛋白、Auto-sll1981 蛋白、Co-sll1981 蛋白、Trx-sll1981 蛋白和TF-sll1981 蛋白進行分離純化。以純化Auto-sll1981 蛋白為例。超聲波破碎細胞后于4 ℃、12 000 r/min條件下離心1 h，得到的上清液用0.45μm濾膜過濾后流穿經(jīng)20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5緩沖液平衡后的Ni-NTA柱，然后用含20～200 mmol/L咪唑的20 mM Tris-HCl，pH 7.5緩沖液進行梯度洗脫，分別收集不同濃度下的流穿液并電泳檢測。合并高濃度高純度sll1981 蛋白的洗脫液后于4 ℃濃縮（PEG 20 000）脫鹽（透析3 次）處理，得到的sll1981 蛋白直接用于酶活測定。采用相同的方法純化另外3 種sll1981 蛋白。另外，取純化得到的部分TF-sll1981 蛋白于4 ℃經(jīng)牛凝血酶酶切4 h，然后重新流穿平衡后的Ni-NTA 柱以除去標簽，最后得到無TF標簽的sll1981蛋白。通過測量蛋白質(zhì)在280 nm處的吸光度，計算出無TF標簽的sll1981蛋白（ε=58 955 L/（mol·cm））和TF-sll1981蛋白的濃度（ε=35 995 L/（mol·cm））。

1.9 重組sll1981蛋白的活性檢測

以α-酮戊二酸（α-KG）為底物，采用酶偶聯(lián)法分別檢測自誘導表達后純化得到的sll1981蛋白、與分子伴侶pTf16質(zhì)粒共表達后純化得到的sll1981蛋白、帶TF標簽的sll1981蛋白以及無TF標簽的sll1981蛋白的活性[18]。500μL標準反應體系中包含100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5緩沖液，2 mmol/L Mg2+，2 mmol/L焦磷酸硫胺素（TPP），2 mmol/L 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+），α-KG 濃度為2～30 mmol/L，9μmol/L 來源于魚腥藻PCC7120 的琥珀酸半醛脫氫酶（ApSSADH）[19]，5μmol/L sll1981 蛋白。使用紫外分光光度計連續(xù)測定反應混合液在340 nm 處的吸光值（A340）變化，并根據(jù)NADPH 的生成速率計算出加入不同濃度α-KG 時的初始速度。運用KaleidaGraph 4.0 軟件繪制動力學曲線，并根據(jù)米氏方程v=vmax·[S]/（Km+[S]）計算出Km和kcat。試驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組pET28b-sll1981質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得一條位于1.5～2.0 kbp，大小約1.7 kbp 的DNA 條帶（圖1A）。該基因片段與sll1981基因理論大小（1 653 bp）相吻合。將該擴增得到的sll1981基因酶切后和用相應酶切后的pET-28b 載體按比例連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，次日隨機挑取7 個單克隆菌落進行PCR鑒定。如圖1B可知，3、4、5、7和8號條帶為陽性克隆，2和6號條帶為假陽性克隆。選取其中3 個陽性克隆點送由上海祥音生物科技有限公司進行DNA 測序，測序結(jié)果經(jīng)ApE 軟件分析證明PCR 擴增獲得到的sll1981基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的sll1981基因序列完全一致。因此，成功構(gòu)建得到pET28b-sll1981表達菌株。

圖1 集胞藻PCC6803的sll1981基因PCR擴增和菌落PCR鑒定Fig.1 Amplification and clone identification of sll1981 gene from Synechocystis sp.PCC6803

2.2 重組sll1981蛋白的表達條件的優(yōu)化

重組pET28b-sll1981質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在0.2 mmol/L IPTG，16 ℃、180 r/min 條件下誘導表達24 h后的結(jié)果如圖2所示。和空載體表達情況比較發(fā)現(xiàn)，pET28b-sll1981表達菌株在該條件下成功誘導表達大量sll1981 蛋白，然而誘導表達的sll1981 蛋白在裂解緩沖液中基本不可溶。隨后，本研究探索了各項誘導表達條件，以期找到最佳誘導表達條件，方便后續(xù)蛋白純化以及活性測試。

首先探索了誘導溫度的影響，結(jié)果如圖3 所示。重組sll1981 蛋白在16 ℃、20 ℃和25 ℃下表達量均很高，然而在裂解緩沖液中的可溶性很差，低溫并沒有改善其可溶性。同時，研究發(fā)現(xiàn)當誘導表達溫度為20 ℃和25 ℃時，重組sll1981蛋白的表達量比16 ℃時稍高。

其次探索了誘導時間的影響，其表達結(jié)果如圖4A所示。由圖4A可知誘導相對較長時間（24 h）可以顯著提高sll1981 蛋白的表達量，誘導時間過短（6 h）會使得sll1981 蛋白表達量大大減少，然而誘導時間并不影響sll1981 蛋白的可溶性。本研究還探索了IPTG 濃度的影響。如圖4B 所示，當不添加IPTG 時，sll1981 蛋白沒有表達。當添加IPTG 濃度在0.02～1 mmol/L 時，sll1981 蛋白的表達量沒有明顯差別。在此條件表達時，重組sll1981蛋白沒有明顯的可溶性。此外本研究還探索了培養(yǎng)液的溶氧量對sll1981蛋白表達和可溶性的影響。其誘導表達情況如圖4C。研究發(fā)現(xiàn)，溶氧量的改變并沒有顯著影響sll1981蛋白的表達量和可溶性。

2.3 其他含有sll1981基因重組質(zhì)粒的表達

在大腸桿菌中自誘導表達外源基因獲得重組蛋白的方法簡便易操作，因此本研究也探索了自誘導表達方式對pET28b-sll1981重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達重組sll1981 蛋白的影響。結(jié)果表明，在16 ℃時自誘導16 h沒有誘導表達sll1981蛋白，自誘導20 h后該菌株表達了非常少量的sll1981蛋白。當誘導時間達24 h 后sll1981 蛋白被大量表達。因此，采用自誘導培養(yǎng)基也能有效表達重組sll1981 蛋白，然而此方法表達的sll1981 蛋白可溶性并沒有顯著提高（圖5A）。此前研究表明過表達分子伴侶蛋白可以促進目的蛋白的折疊，從而提高重組蛋白的可溶性。本研究采用pET28b-sll1981重組質(zhì)粒與分子伴侶質(zhì)粒pTf16共轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達sll1981蛋白的方式，其結(jié)果如圖5B所示。分子伴侶質(zhì)粒pTf16表達的觸發(fā)因子tig 蛋白大小為56 ku，比目的蛋白sll1981 小，與電泳結(jié)果中顯示的tig 蛋白處于sll1981 蛋白下方一致，下圖接近55 ku的蛋白分子即為觸發(fā)因子tig蛋白。由圖5B可知，與分子伴侶質(zhì)粒pTf16共表達可以顯著提高sll1981 蛋白的可溶性。同時筆者也構(gòu)建了pET32a-sll1981和pColdTF-sll1981重組質(zhì)粒，其分別含有可能提高重組蛋白可溶性的Trx 和觸發(fā)因子TF 標簽。研究結(jié)果表明sll1981 蛋白連接Trx 標簽后其可溶性沒有顯著提高，然而sll1981 蛋白連接TF 標簽后其可溶性顯著提高，表達的sll1981 蛋白基本都在上清中（圖5C）。

圖2 重組pET28b-sll1981質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導表達Fig.2 The induced expression of recombinant sll1981 protein in Escherichia coli

圖3 不同溫度下重組sll1981蛋白誘導表達Fig.3 Induced expression of recombinant sll1981 protein at deferent temperatures

圖4 重組pET28b-sll1981質(zhì)粒在不同條件下的誘導表達Fig.4 The expression of recombinant pET28b-sll1981 plasmid at various conditions

圖5 重組sll1981蛋白的表達情況Fig.5 The expression of recombinant sll1981 protein at various vectors

2.4 重組sll1981蛋白的純化

分別對上述自誘導（Auto-sll1981）、與pTf16 共表達（Co-sll1981）和TF-sll1981 融合表達（TFsll1981）方法表達的重組sll1981蛋白進行分離純化。此前研究發(fā)現(xiàn)當純化IPTG誘導表達的sll1981蛋白時，洗出的重組sll1981容易形成白色渾濁沉淀，因此最終未能純化得到sll1981蛋白。隨后嘗試對Autosll1981 蛋白進行分離純化（圖6A），最終得到濃度為10μmol/L 的sll1981 蛋白（圖6B）。純化過程未見明顯白色渾濁，可推測自誘導表達的sll1981 蛋白相對較穩(wěn)定。對Auto-sll1981 濃縮時發(fā)現(xiàn)當Auto-sll1981濃度超過10μmol/L時該蛋白還是會聚集形成白色沉淀。對Co-sll1981蛋白進行分離純化（圖7A），最終得到濃度為30μmol/L的sll1981蛋白（圖7B）。采用與pTf16質(zhì)粒共表達后純化得到的Co-sll1981蛋白濃度明顯高于自誘導表達后純化得到的Auto-sll1981蛋白濃度，由此推測Co-sll1981蛋白較上述兩種方法表達的sll1981蛋白更加穩(wěn)定。

圖6 自誘導表達sll1981蛋白的純化Fig.6 Purification of auto-induced expression of recombinant sll1981 protein

圖7 與pTf16分子伴侶共表達sll1981蛋白的純化Fig.7 Purification of sll1981 protein co-expressed with chaperone plasmid pTf16

重組TF-sll1981 蛋白的純化如圖8 所示。由于得到的TF-sll1981 蛋白帶有分子量較大的TF 標簽，因此將TF-sll1981 蛋白于4 ℃經(jīng)凝血酶酶切后再次流穿Ni-NTA 親和層析柱后使得sll1981 蛋白與TF 標簽蛋白分離，得到無TF標簽的高純度sll1981蛋白（圖8B）。

圖8 與TF標簽融合表達sll1981蛋白的純化結(jié)果Fig.8 Purification of sll1981 protein expressed with TF tag

2.5 重組sll1981蛋白作為α-KGD的活性比較

由于sll1981蛋白非常不穩(wěn)定，經(jīng)IPTG誘導表達的sll1981蛋白在用咪唑梯度洗脫時已經(jīng)形成白色沉淀，因此無法檢測其催化活性。其他方法純化得到的sll1981蛋白均能檢測出α-KGD活性（表1）。研究結(jié)果表明催化活性最高的sll1981蛋白是采用與pTf16質(zhì)粒共表達的Co-sll1981蛋白，其次為Auto-sll1981蛋白，活性最低的是TF-sll1981蛋白。當TF-sll1981蛋白的TF標簽被酶切后，盡管筆者可以純化得到不帶TF標簽的sll1981蛋白，然而在測定活性的緩沖液體系中該不帶TF標簽的sll1981蛋白極易沉淀，因此無法測定其催化活性。當?shù)孜铴?KG濃度超過6 mmol/L時，采用自誘導方式獲得的Auto-sll1981在活性測定緩沖體系中也易沉淀，因此本試驗僅能測定其在底物濃度為6 mmol/L時的反應速度為0.670μmol/（L·s），無法測得其他動力學參數(shù)。

表1 不同方法表達的重組sll1981蛋白活性比較Tab.1 Activity comparison of recombinant sll1981 protein expressed by different methods

3 討論與結(jié)論

此前研究表明菌株、培養(yǎng)基、誘導溫度、IPTG 濃度及誘導時間均會影響重組蛋白在異源表達系統(tǒng)中的表達量和可溶性。例如，Biria 研究組[20]通過taguchi 法優(yōu)化誘導溫度和時間及培養(yǎng)基配方大大提高了人類生長激素蛋白（hGH）在大腸桿菌Origami 菌株中的產(chǎn)率。Xu 等[21]通過優(yōu)化IPTG 濃度和誘導時間，使得重組疏水蛋白（HGFI）在大腸桿菌BL21 菌株中得到了滿意的表達。本研究比較了pET28b-sll1981質(zhì)粒在大腸桿菌表達系統(tǒng)中不同溫度，IPTG 濃度及誘導時間、不同溶氧體積比及自誘導培養(yǎng)基中的表達情況。研究發(fā)現(xiàn)重組sll1981 蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中表達量很高，然而基本都是以包涵體形式存在。通過與Trx 助溶標簽融合表達的方式也無助于提高sll1981 蛋白的可溶性。盡管與pColdTF 質(zhì)粒中TF 標簽融合表達后提高了sll1981 蛋白的可溶性，但是酶切TF 標簽蛋白后sll1981 蛋白非常不穩(wěn)定，因此與TF 標簽融合表達這種方法也不可行。幸運的是通過與pTf16 分子伴侶質(zhì)粒共表達的方式獲得了可溶性的sll1981 蛋白，并且具有較高的催化α-KG 脫羧生成琥珀酸半醛的活性。本研究數(shù)據(jù)為生產(chǎn)可溶性具有催化活性的sll1981 蛋白質(zhì)提供了重要基礎。事實上，2006 年Chatterjee 等人發(fā)現(xiàn)pET21b-sll1981質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 菌株后表達的sll1981 蛋白也是以包涵體形式存在，該作者通過包涵體復性的方法純化得到sll1981 蛋白，但是用此法獲得的sll1981 沒有α-KGD 活性[22]。本實驗室未發(fā)表的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)與sll1981 蛋白氨基酸序列高度一致的其他藍細菌來源的α-KGD 在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的可溶性均很差，因此本研究結(jié)果對于純化其他來源的α-KGD 也有重要的參考意義。

此前研究指出自誘導培養(yǎng)基較普通LB 培養(yǎng)基具有均勻的高細胞培養(yǎng)密度和較強的表達能力[23]。因此，本研究嘗試了自誘導培養(yǎng)基表達重組sll1981 蛋白。SDS-PAGE 檢測發(fā)現(xiàn)表達的sll1981蛋白有少量存在于上清液中，繼而對該方法表達的sll1981 蛋白進行純化以及活性測試。在純化過程中，洗出的sll1981 蛋白并沒有形成沉淀，最終純化得到濃度為10 μmol/L 的sll1981 蛋白，超過此濃度時蛋白極易發(fā)生沉淀。在測定該法獲得的sll1981 蛋白活性時，最高僅能檢測到底物α-KG 濃度為6 mmol/L，當超過該濃度時，sll1981 蛋白會聚集形成白色渾濁。猜想可能的原因有二。其一，當?shù)孜餄舛仍龃髸r，反應液中離子強度發(fā)生改變促使sll1981 蛋白構(gòu)象由穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)向不穩(wěn)定狀態(tài)；其二，α-KG 含有兩個羧基，當加入更高濃度的α-KG 時，反應液的pH 值有所改變，致使sll1981 蛋白逐漸形成白色沉淀。

分子伴侶蛋白有助于防止新生蛋白在細胞擁擠的環(huán)境中發(fā)生錯誤折疊和聚集[24]。其中觸發(fā)因子TF（伴侶蛋白）會與核糖體1:1 結(jié)合，并與新生蛋白鏈相互作用，使其處于可進行后續(xù)折疊的狀態(tài)[25-26]。因此本研究選用pTf16 分子伴侶質(zhì)粒（表達的伴侶蛋白為TF）與pET28b-sll1981質(zhì)粒在大腸桿菌中共表達，結(jié)果得到大量可溶性sll1981 蛋白，并且純化得到較高濃度的sll1981 蛋白（30 μmol/L）。該結(jié)果說明在此濃度下sll1981 蛋白不會聚集形成沉淀，比自誘導表達的sll1981 蛋白更穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌硫氧還蛋白Trx 和觸發(fā)因子TF 在大腸桿菌細胞質(zhì)基質(zhì)中可以防止初生蛋白錯誤折疊和聚集，使得多亞基蛋白不易形成包涵體，從而有效提高蛋白質(zhì)的溶解性，因而開發(fā)了目的蛋白與標簽蛋白融合表達的方法。本研究構(gòu)建了兩種融合表達質(zhì)粒pET32a-sll1981和pColdTF-sll1981。結(jié)果顯示sll1981蛋白與Trx 融合表達后溶解性并沒有顯著變化，而與TF 標簽融合表達后的溶解性顯著提高，并且純化得到更高濃度的sll1981 蛋白（30 μmol/L）。遺憾的是TF-sll1981 蛋白酶切去TF 標簽后獲得的sll1981蛋白同樣不穩(wěn)定。

本研究探索了不同表達條件和表達方法對集胞藻PCC6803來源的sll1981蛋白表達量和可溶性的影響，最后純化得到具有催化活性的重組sll1981 蛋白。酶動力學測試數(shù)據(jù)表明sll1981 蛋白具有α-KGD活性，并且不同表達方法獲得的sll1981 蛋白的催化活性差異較大，其中當pET28b-sll1981質(zhì)粒與pTf16分子伴侶質(zhì)粒在大腸桿菌中共表達時，重組sll1981蛋白的可溶性和催化活性均為最佳。