喬先棟 ，劉 婷 ，洪麗英 ，付勇南 △

（1南昌大學(xué)，2江西省高血壓研究所，3南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌330006）

隨著世界人口老齡化的發(fā)展，糖尿病患病人數(shù)逐年增加，根據(jù)2015 年國際糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)顯示，全球糖尿病患者已達4.15 億，在糖尿病患者的死亡人數(shù)中，約1/2患者死于心血管并發(fā)癥［1-2］。體內(nèi)較高的血糖可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞的損傷繼而誘發(fā)動脈粥樣硬化形成，現(xiàn)今普遍認為炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是高糖血癥導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷的重要機制［3］。

熱休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白（carboxyl terminus of heat shock protein 70-interacting protein，CHIP）是E3泛素連接酶的一個成員，首先由Ballinger等［4］發(fā)現(xiàn)于人的心臟cDNA 文庫，也表達于血管內(nèi)皮細胞，其N 端TPR 結(jié)構(gòu)域能與分子伴侶蛋白相互作用，而C 端U-box 結(jié)構(gòu)域具有E3 泛素連接酶活性，能使疾病相關(guān)蛋白質(zhì)及錯誤折疊蛋白質(zhì)泛素化并被降解，從而維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［4-5］。之前對CHIP的研究大多集中在腫瘤方面，其對不同腫瘤影響差異大［6］。在心血管方面，血管緊張素Ⅱ?qū)е碌男募≈厮苣Ｐ椭校^表達CHIP基因小鼠心肌細胞炎癥反應(yīng)和凋亡水平下降［7］，提示CHIP 參與炎癥發(fā)生及細胞凋亡過程。但對CHIP 是否參與高糖（high glucose，HG）介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷尚無相關(guān)報道。本項工作將通過高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human um?bilical vein endothelial cells，HUVECs）損傷及下調(diào)CHIP 表達，初步探討CHIP 對高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響及所涉及的分子機制。

材料和方法

1 細胞提取及處理

提取健康產(chǎn)婦分娩臍帶（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科提供，標本采集通過孕婦本人知情同意及醫(yī)院倫理委員會批準），用Ⅱ型膠原酶消化10 min 后加入胎牛血清中和，560×g 離心5 min，棄上清液，得到HUVECs 沉淀后加入內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液（endothelial cell medium，ECM）重懸并置于95%空氣/5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每 2 d 換 1 次培養(yǎng)液［8］。重組慢病毒 LV-siRNA-NC 和LV-siRNA-CHIP 根據(jù)公司提供的方法加入細胞，處理2～3 d穩(wěn)定后加入不同濃度葡萄糖處理細胞24 h，分為4組：正常糖（normal glucose，NG）+siRNA NC 組、NG+siRNA CHIP 組、HG+siRNA NC 組和HG+siRNA CHIP組。

2 主要試劑及材料

ECM 及配套血清購于 Sciencell；普通 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清及胰酶購于BI；Ⅱ型膠原酶及PCR試劑盒購于全式金公司；引物和轉(zhuǎn)染病毒由GeneChem合成；葡萄糖粉末及內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）ELISA 試劑盒購于Sigma；紅色熒光TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒、MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒和超氧化物陰離子熒光探針二氫乙啶（dihydroethid?ium，DHE）購于碧云天；一氧化氮（nitric oxide，NO）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide syn?thase，iNOS）和總超氧化物歧化酶（superoxide dis?mutase，SOD）測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；CHIP、NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）2、NOX4、p38、p65、p-p38、p-p65、Bax、Bcl-2 及 GAP?DH抗體購于Santa Cruz。

3 主要方法

3.1 MTT 檢測細胞活力 取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后調(diào)整細胞濃度并取100 μL 細胞懸液接種于96孔板使每孔細胞數(shù)為105，細胞融合至70%左右吸去培養(yǎng)液并加入相應(yīng)濃度葡萄糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入20 μL MTT 溶液孵育4 h，去除培養(yǎng)液，加入DMSO 低速振蕩5～10 min，使甲臜完全溶解，使用分光光度計在波長570 nm 處測量各孔吸光度（A）值。每孔設(shè)置3 孔并且設(shè)置調(diào)零孔（無細胞只有培養(yǎng)液）。細胞相對活力（%）=（處理組A值-調(diào)零孔A值）/（對照組A值-調(diào)零孔A值）×100%。

3.2 細胞凋亡檢測 將各組細胞接種于12 孔板，棄上清液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗多聚甲醛，加入通透液室溫孵育5 min，并加入新鮮TUNEL液，封閉液37℃避光孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察，紅色為TUNEL 陽性（凋亡細胞），各組設(shè)置3個復(fù)孔，隨機選取40 個非重疊視野，統(tǒng)計凋亡細胞個數(shù)及總細胞數(shù)。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞/細胞總數(shù)×100%。

3.3 ET-1檢測 超凈臺吸取各組細胞上清液，配制好相應(yīng)濃度標準品液，所有樣品及試劑置于室溫平衡30 min，分別加入100μL 樣品和標準品于96 孔反應(yīng)板并覆蓋板貼37℃孵育1 h，去除液體并甩干，加入Ⅰ抗37℃孵育30 min，加入Ⅱ抗室溫靜置45 min，加入顯影液避光慢速振蕩30 min，加入終止液立馬使用分光光度計在波長450 nm 處測量各組A值。每組設(shè)置3 個復(fù)孔，并設(shè)置調(diào)零孔（樣品稀釋液），計算各組ET-1濃度。

3.4 NO 含量及iNOS 活性檢測 各組細胞使用超聲波細胞粉碎儀處理后12 000×g離心5 min 取上清液。立即用于實驗，按照NO 及iNOS 試劑盒說明加入相應(yīng)試劑操作，分光光度計測定A值并計算各組NO含量及iNOS活性。

3.5 氧自由基水平及SOD 活性檢測 各組處理細胞孵育24 h 后去除上清液，PBS 清洗，加入含10 mmol/L 濃度DHE 的無血清培養(yǎng)液，37℃避光孵育30 min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下拍照。超聲波細胞粉碎儀破碎細胞，12 000×g離心 5 min 取上清液，20μL 樣品加入96 孔板，加入 SOD 測定試劑，37℃孵育20 min，450 nm 波長下測定A值，根據(jù)說明書計算SOD活性。

3.6 RT-qPCR TRIzol 法提取總 RNA，檢查 RNA 純度及質(zhì)量，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行總cDNA合成，并按照定量試劑盒進行操作，以20μL 反應(yīng)體系進行 PCR 擴增，2 μL cDNA 加入上、下游引物各 0.4μL 后在 ABI Prism 7500 Real-Time PCR System 上操作。反應(yīng)條件如下：95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃20s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)。重復(fù)實驗 3 次。采用2-ΔΔCt公式計算目的mRNA 相對表達量。單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein1，MCP-1）上游引物序列為 5′-TGCAGAGGCTCGCGAGCTA-3′，下游引物序列為5′-CAGGTGGTCCATGGAATCCT?GA-3′；白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）上游引物序列為5′-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3′，下游引物序列為 5-AACCCTCTGCACCC-AGTTTTC-3′；GAPDH 上 游 引 物 序 列 為 5′-GTCTTCACTACCATG?GAGAAGG-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-TCATGGAT?GACCTTGGCCAG-3′。

3.7 Western blot 使用含有蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，BCA 法檢測各蛋白濃度，加入loading buffer煮10 min置于-80℃儲存。按照Western blot步驟對蛋白樣品電泳及電轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入抗 CHIP、NOX2、NOX4、p38、p65、p-p38、p-p65、Bax、Bcl-2 及GAPDH 抗體，4℃孵育過夜，加入Ⅱ抗室溫下孵育2 h。加入發(fā)光液使用Quantity 4000 儀器曝光。ImageJ軟件評估相對蛋白表達水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，組間數(shù)據(jù)采用Satterth?waite校正后行t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HUVECs形態(tài)及CHIP的表達

正常原代HUVECs 呈鵝卵石樣，培養(yǎng)2 d 后細胞融合達80%，取第2～6 代細胞用于實驗，光鏡下可見HG+siRNA NC 組細胞形態(tài)改變，數(shù)量較NG+siRNA NC 組減少，而HG+siRNA CHIP 組細胞數(shù)量則較HG+siRNA NC 組進一步減少，見圖1A。Western blot顯示，分別與NG+siRNA NC 組和HG+siRNA NC 組相比 ，NG+siRNA CHIP 和 HG+siRNA CHIP 組 細 胞 中CHIP表達均顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖1B。

Figure 1.The morphological changes of HUVECs（A；scale bar=50 μm）and the protein expression of CHIP（B）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+siRNA NC；#P＜0.05 vs HG+siRNA NC.圖1 HUVECs形態(tài)及CHIP的表達

2 CHIP對HUVECs活力及凋亡率的影響

與5.5 mmol/L 葡萄糖組相比，5.5 mmol/L 葡萄糖+20 mmol/L 甘露醇對細胞活力的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2A。以此結(jié)果可排除滲透壓對實驗的干擾。而25.5 mmol/L 葡萄糖顯著降低細胞活力，并提高細胞凋亡率（P＜0.05），見圖2A、B。與 HG+siRNA NC 組相比，HG+siRNA CHIP 組細胞活力顯著降低，凋亡率顯著提高（P＜0.05），Bax 表達增加及Bcl-2表達減少（P＜0.05），見圖2A～C。

Figure 2.Effects of CHIP on the viability and apoptosis rate of HUVECs.A：the cell viability was detected by MTT assay；B：the apoptosis was detected by TUNEL staining（×100）；C：the protein expression of Bax and Bcl-2 was determined by Western blot.Mean ±SD. n=3.△P＜0.05 vs 5.5 mmol/L glucose；*P＜0.05 vs NG+siRNA NC；#P＜0.05 vs HG+siRNA NC.圖2 CHIP對HUVECs活力及凋亡率的影響

3 CHIP 對 HUVECs 內(nèi) ET-1 和 NO 含量及 iNOS 活性的影響

與 NG+siRNA NC 組相比，HG+siRNA NC 組 ET-1和 NO 含量及 iNOS 活性增加（P＜0.05）；而 HG+siRNA CHIP 組 ET-1 和 NO 含 量及 iNOS 活性相 較 于HG+siRNA NC組進一步增加（P＜0.05），見圖3。

4 CHIP 對 HUVECs 內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平、NOX表達及SOD活性的影響

與 NG+siRNA NC 組相比，HG+siRNA NC 組細胞內(nèi)ROS 水平升高（P＜0.05），NOX2 及 NOX4 蛋白表達水平升高（P＜0.05），同時 SOD 活性降低（P＜0.05）；與 HG+siRNA NC 組相比，HG+siRNA CHIP組細胞內(nèi)ROS水平升高（P＜0.05），NOX2及NOX4蛋白表達水平升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05），見圖4。

5 CHIP對HUVECs內(nèi)炎癥因子水平的影響

與 NG+siRNA NC 組相比，HG+siRNA NC 組細胞內(nèi)炎癥因子 IL-8 和 MCP-1 的 mRNA 水平升高（P＜0.05）；HG+siRNA CHIP 組炎癥因子IL-8和MCP-1的mRNA 水平相較于 HG+siRNA NC 組顯著增加（P＜0.05），見圖5。

6 CHIP對HUVECs內(nèi)p65和p38磷酸化水平影響

與 NG+siRNA NC 組相比，HG+siRNA NC 組 p65和 p38 磷酸化水平增加（P＜0.05）；而 HG+siRNA CHIP 組p65和p38磷酸化水平相較于HG+siRNA NC組顯著升高（P＜0.05），見圖6。

Figure 3.Effects of CHIP on the levels of ET-1，iNOS and NO in HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+siRNA NC；#P＜0.05 vs HG+siRNA NC.圖3 CHIP對HUVECs內(nèi)ET-1、iNOS及NO水平的影響

Figure 4.Effect of CHIP on ROS level，SOD activity and NOX expression in HUVECs.A：the ROS level was detected by fluores?cence probe dihydroethidium under fluorescence microscope（scale bar=50 μm）；B：the activity of SOD was detected by SOD kit；C：the protein expression of NOX2 and NOX4 was determined by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+siRNA NC；#P＜0.05 vs HG+siRNA NC.圖4 CHIP對HUVECs內(nèi)ROS水平、SOD活性及NOX表達的影響

討 論

糖尿病導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷以及動脈粥樣硬化形成涉及分子機制眾多，目前普遍認同的通路包括多元醇通路活化、晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosy lation end products，AGEs）形成增加、蛋白激酶C活化以及己糖胺通路激活等［9］，但最終內(nèi)皮細胞損傷都有炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)參與，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激貫穿整個動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激能刺激脂質(zhì)積累、巨噬細胞遷移以及血管平滑肌細胞的增生從而促進動脈粥樣硬化形成［10］。

Figure 5.The mRNA expression of IL-8 and MCP-1 detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+siRNA NC；#P＜0.05 vs HG+siRNA NC.圖5 CHIP對HUVECs內(nèi)炎癥因子mRNA表達的影響

Figure 6.Effects of CHIP on the phosphorylation levels of p65 and p38 in HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+siRNA NC；#P＜0.05 vs HG+siRNA NC.圖6 CHIP對HUVECs內(nèi)p65和p38磷酸化水平的影響

目前普遍認為CHIP 參與心肌細胞炎癥發(fā)生和氧化應(yīng)激并影響細胞存活率，但尚無CHIP 在高糖引起的血管內(nèi)皮細胞損傷中的研究。在本實驗中，通過MTT檢測和TUNEL 染色法，我們觀察到下調(diào)CHIP表達確實增加高糖介導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細胞的凋亡率和死亡率，證實了CHIP 可以影響高糖導(dǎo)致的臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷。根據(jù)CHIP 對心肌細胞的影響，我們猜測CHIP 可能通過影響血管活性物質(zhì)、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)參與高糖介導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷。

NO 是重要血管活性物質(zhì)，可緩解炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，對抗ET-1 收縮血管效應(yīng)，從而改善血管功能。NO 合成主要依靠內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endo?thelial nitric oxide synthase，eNOS）和iNOS，高糖刺激早期，iNOS 大量表達并產(chǎn)生過多NO，增加細胞氧化應(yīng)激水平［11-12］。大多數(shù)研究注重高糖處理后晚期eNOS 表達水平而忽視iNOS 早期的表達，少量研究發(fā)現(xiàn) CHIP 能影響iNOS 在細胞內(nèi)活性［13］。而ET-1 同樣在高糖處理的血管內(nèi)皮細胞中高表達并且參與動脈粥樣硬化形成?；诖耍緦嶒炦M一步研究CHIP是否影響高糖處理的臍靜脈內(nèi)皮細胞iNOS 和ET-1水平，結(jié)果表明CHIP 可以影響高糖刺激的臍靜脈內(nèi)皮細胞早期iNOS 和ET-1 活性進而對血管功能產(chǎn)生影響。

另一方面，NOX途徑是重要的ROS來源，當葡萄糖含量在細胞內(nèi)較高狀態(tài)下，細胞內(nèi)不僅AGEs含量升高，還可因糖酵解過程分解葡萄糖而產(chǎn)生過多的二酰甘油，在AGEs和二酰甘油等物質(zhì)刺激下蛋白激酶C 活化增加，進而導(dǎo)致NADPH 表達增加?？寡趸镔|(zhì)SOD 可以清除細胞內(nèi)多余氧自由基從而維持細胞內(nèi)氧化平衡。因此SOD 可以作為細胞抗氧化能力指標［14］.本研究中，高糖培養(yǎng)后臍靜脈內(nèi)皮細胞胞質(zhì)內(nèi) NOX2、NOX4 和 ROS 水平增加，SOD 活性下降。說明高糖處理臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，而下調(diào)CHIP 處理細胞24 h 后，臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷加重，證實CHIP 可參與高糖介導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

研究表明，糖尿病患者體內(nèi)心肌細胞及內(nèi)皮細胞 p38 及 p65 活化增加，而抑制 p38 和 p65 的活化能降低細胞內(nèi)炎癥反應(yīng)和凋亡水平［15-16］。p65和p38以無活性形態(tài)存在于細胞質(zhì)，當受到晚期糖基化終末產(chǎn)物、缺氧等刺激后磷酸化激活并遷移至細胞核，激活炎癥因子、凋亡蛋白等靶基因的轉(zhuǎn)錄，啟動炎癥反應(yīng)并介導(dǎo)細胞凋亡［17-18］。研究顯示CHIP能影響心肌細胞 p38 和 p65 活性［19］，而本實驗 p38 和 p65 發(fā)現(xiàn)下調(diào) CHIP 可增加 HUVECs 內(nèi) p38 和 p65 磷酸化及炎癥因子MCP-1 和IL-8 轉(zhuǎn)錄水平和凋亡蛋白Bax 表達水平，但減少Bcl-2 蛋白表達，并發(fā)現(xiàn)下調(diào)CHIP 增加臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)炎癥因子和凋亡蛋白表達。說明CHIP 可通過影響p38 和p65 活化而參與高糖介導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)和凋亡。當然，CHIP 是否可以調(diào)控其它因子從而影響炎癥反應(yīng)和細胞凋亡有待深入研究。

綜上所述，在高糖導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細胞損傷過程中，CHIP可以通過影響炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡蛋白以及血管活性物質(zhì)參與損傷過程，下調(diào)CHIP 表達可加重血管內(nèi)皮細胞損傷，其對血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)、細胞凋亡影響機制可能與調(diào)控p65 和p38 磷酸化水平有關(guān)，而上調(diào)CHIP 表達是否改善高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷未知，有待進一步研究。